NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM TỪ STREPTOMYCES 16.34 ppt

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM TỪ STREPTOMYCES 16.34 TÓM TẮT Mục tiêu: sàng lọc dạng chủng đầu dòng, cải thiện khả sinh tổng hợp kháng sinh khảo sát thành phần kháng sinh chủng Streptomyces 16.34 phân lập từ chất Việt Nam Phương pháp: sử dụng ISP (International Streptomyces Project) để phân loại Streptomyces 16.34 Khả lên men sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 khảo sát phương pháp lên men chìm máy lắc phương pháp khuếch tán khối thạch, giếng thạch khoanh giấy lọc Phương pháp chiết đơn với dung mơi thích hợp dùng để chiết xuất kháng sinh, sau dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng để khảo sát thành phần kháng sinh Kết quả: Sàng lọc ngẫu nhiên sàng lọc sau đột biến cho biến chủng kháng sinh tăng mạnh Môi trường MT4 dịch thể hiệu kỹ thuật lên men chìm Kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 16.34 có thành phần khác nhau, chiết xuất butyl acetat n-butanol diệt 8/10 vi khuẩn 6/7 chủng vi nấm thử Kết luận: chưa xác định xác tên khoa học chủng Streptomyces 16.34, phân lập từ chất Việt nam, dựa tiêu chuẩn phân loại ISP kháng sinh chiết xuất từ xạ khuẩn thể vai trò kháng khuẩn kháng nấm hiệu quả, điều mang đến hy vọng phát kháng sinh chống nấm mạnh ABSTRACT Objective: to select the isolates, to improve its ability of antibiotic biosynthesis and to examine the components of antifungal products from Streptomyces 16.34 which has been isolated from substrate in Viet Nam Methods: Streptomyces 16.34 was classified by using ISP (International Streptomyces Project) The antibiotic biosynthesis ability of Streptomyces 16.34 was determined by the submerged fermentative method and the agar diffusion method (an agar cut diffusion; well diffusion and disk diffusion) The antifungal agent was extracted by appropriate sovents and then its components were determined by thin layer chromatography Results: Random selection and selection after mutation product the mutated isolates having powerfully better antibiotic activity The MT4 broth was very useful for the submerged culture fermentation The antifungal agent, including at least components, could be extracted from Streptomyces 16.34 by butyl acetate or n-butanol The agent has the activity against 8/10 test bacteria and against over tested fungi Conclusions: classification according to ISP have not yet determined the scientific name of Streptomyces 16.34, which was isolated from substrate in Việt Nam However, the antibiotic extracted from Streptomyces 16.34 has shown effectively the antibiotics ability and the antifungal ability It is expected that a strong antibiotic can be developed furthermore ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước phát triển lại có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, đó, bệnh nhiễm trùng ln mối đe dọa nguy hiểm đến sức khoẻ người Nhưng điều kiện khí hậu tạo quần thể vi sinh vật phong phú, phải kể đến chi xạ khuẩn Streptomyces - thuộc lớp phụ (bộ) Actynomycetales - có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng có cấu trúc đặc điểm kháng sinh khác nhau, số lồi có khả sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm(1) Gần việc phân lập chủng Streptomyces tiến hành số Viện nghiên cứu Trường Đại học nước ta Bài báo công bố số kết đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm từ Streptomyces 16.34” khía cạnh sau: - Nghiên cứu sàng lọc dạng chủng đầu dòng cải thiện khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 16.34 phân lập từ chất Việt Nam - Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh: thành phần môi trường lên men, điều kiện ngoại cảnh, v.v để cải thiện khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng - Nghiên cứu chiết xuất kháng sinh, nghiên cứu thành phần kháng sinh PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN LIỆU Chủng xạ khuẩn Chủng Streptomyces 16.34 phịng thí nghiệm Vi sinh vật học, Bộ môn Vi sinh Sinh học, trường đại học Dược Hà Nội cung cấp Giống vi sinh vật kiểm định Giống VSV kiểm định môn Vi sinh Sinh học cung cấp, bao gồm vi khuẩn Gr (+), vi khuẩn Gr (–) chủng vi nấm kiểm định Các môi trường sử dụng - Nuôi cấy xạ khuẩn sử dụng môi trường MT1- MT7 biến thể dịch thể (bỏ thạch) từ để lên men sinh tổng hợp kháng sinh (1) - Phân loại Streptomyces: sử dụng môi trường ISP1-ISP9 (4) - Nuôi cấy vi nấm để thử nghiệm môi trường Sabouraud - Nuôi cấy vi khuẩn kiểm định môi trường canh thang thạch thường Các phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nuôi cấy bề mặt thạch nghiêng hộp Petri sử dụng để nuôi cấy xạ khuẩn, vi khuẩn vi nấm - Phân loại Streptomyces 16.34 sử dụng phương pháp phân loại theo ISP (International Streptomyces Project)(4) - Phương pháp lên men chìm máy lắc sử dụng để nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces áp dụng phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy lọc(1) - -Chiết xuất kháng sinh sử dụng phương pháp chiết đơn dung mơi thích hợp - Nghiên cứu thành phần kháng sinh sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng KẾT QUẢ Kết phân loại ISP theo khoá phân loại ISP Đã xác định đặc trưng phân loại theo khoá phân loại ISP Streptomyces 16.34 với đặc trưng phân loại sau: Màu sắc khuẩn ty khí sinh: xám trắng (WGy), màu sắc khuẩn ty chất: có (1), sắc tố melanoit: khơng có (0), hình dạng chuỗi bào tử: móc câu xoắn đơn (RA), bề mặt bào tử: nhẵn (Sm), tiêu thụ D-glucoza: có (+), tiêu thụ inisitol: có (+), tiêu thụ D-xyloza: có (+), tiêu thụ D-malnitol: có (+), tiêu thụ D-fructoza: có (+), tiêu thụ Larabinoza: khơng (-), tiêu thụ Rafinoza: có (+), tiêu thụ Rhamnoza: có (+), tiêu thụ sacaroza: có (+) Viết ký hiệu tóm tắt sau: WGy RA Sm + + + + + - + + + Tuy nhiên so sánh với danh mục chủng cơng bố ISP khơng có cơng bố trùng với kết chúng tơi, chưa xác định tên khoa học Streptomyces 16.34 theo ISP Kết thử khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 phân lập Kết thử khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 môi trường MT3 cho thấy Streptomyces 16.34 sinh tổng hợp kháng sinh chống lại 8/10 chủng vi khuẩn thử Tiếp tục nuôi cấy Streptomyces 16.34 môi trường MT1-MT7 sau ngày ủ thử khả sinh tổng hợp kháng sinh đánh giá 10 vi khuẩn kiểm định phương pháp khối thạch Kết giới thiệu bảng Bảng Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 môi trường khác Đường kính vịng vơ khuẩn (mm), s V S i sinh TT M M M M M M M vật KĐ T1 B T2 cereus 7,62 8,43 1, 18 B T3 6,04 43 9,73 0, T4 3,94 11 9,26 1, T5 2,61 27 4,41 2, T6 4,63 77 7,47 2, T7 0,21 1, 86 1,72 1, 08 2,56 8, 35 pumilus 0, 89 B 1, 07 7,15 1, 06 6,17 0, 92 4,35 1, 59 5,93 3, 29 2,53 0, 42 3,69 9, 76 Đường kính vịng vơ khuẩn (mm), s V S i sinh TT M M M M M M M vật KĐ T1 subtilis T2 0, 26 S 0, 96 lutea 1,67 S ta 43 0,63 62 3,18 55 9,05 21 3,65 79 9,48 80 5,13 59 3,82 75 6,05 96 8,17 87 2,67 1, 12 2,73 0, 0, T7 0, 0, T6 1, 4, T5 0, 0, T4 0, 0, T3 0, 55 5,78 1,97 aureus 1, 09 E coli 68 8, 76 0, 1, 06 1, 78 9, 42 1, 43 2,73 0, 60 9, 17 0, 58 9, 98 0,16 Đường kính vịng vơ khuẩn (mm), s V S i sinh TT M M M M M M M vật KĐ T1 T2 1, T3 07 P ro T4 0, 98 5,30 5,26 T5 1, 95 4,93 T6 1, 35 5,05 T7 0, 89 2,29 1, 17 5,50 9, 39 mirabili 1, 1, 0, 2, 2, 0, 0, s 20 P 02 46 25 0 0 35 s 7, 68 92 18 7, 78 0 aerugin 0, 0, osa 55 S al 0 31 3,32 8, 46 7, 75 9, 50 Đường kính vịng vơ khuẩn (mm), s V S i sinh TT M M M M M M M vật KĐ T1 typhi T2 T3 T4 T5 1, 87 0 0 S 0, 23 hi T6 9, T7 0, 78 51 0, 71 7, 52 0 flexneri 0, 57 0, 10 Môi trường MT4 cho kết tốt nhất, cịn mơi trường phân lập MT3 cho kết thứ Hai vi khuẩn kiểm định có độ nhạy tốt kháng sinh Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis BV 108 sử dụng làm vi khuẩn kiểm định cho nghiên cứu sau Kết sàng lọc ngẫu nhiên Kết sàng lọc ngẫu nhiên Streptomyces 16.34 trình bày bảng Bảng Kết sàng lọc ngẫu nhiên Biế B pumilus Pro mirabilis n chủng D(m s % m) 25,63 0,5 24,52 21,63 0,2 10 25,80 10 0,2 26,48 1,5 23,42 10 0,2 11 10 11 0,5 22,36 0,8 20,46 6 10 0,4 26,46 10 10 1,2 % 8 s m) D(m 25,12 11 0,5 12 Biế B pumilus Pro mirabilis n chủng D(m s % m) 11 D(m s % 19,86 1,2 97 0,6 10 m) 22,34 1,2 94 12 23,64 0,4 99 21,53 13 26,62 1,3 14 25,30 0,2 26,48 21,65 11 1,4 11 2,1 10 1,4 23,42 15 11 23,16 10 0,5 11 Biế B pumilus Pro mirabilis n chủng D(m s % m) 16 25,16 1,3 26,68 23,37 0,5 11 26,60 11 0,6 25,70 0,6 20,42 10 1,1 21,37 10 0,2 95 11 0,1 22,86 11 0,3 22,60 2 20 10 0,2 19 % 5 18 s m) 17 D(m 19,76 0,1 10 97 Biế B pumilus Pro mirabilis n chủng D(m s % m) 21 D(m s % 17,34 0,4 85 0,6 12 m) 19,74 0,3 83 22 27,44 0,2 23 25,50 1,3 25,78 10 0,1 23,52 22,52 0,4 10 23,46 0,6 25 25,45 24 11 0,4 99 11 21,82 11 1,2 10 Biế B pumilus Pro mirabilis n chủng D(m s % m) MC D(m s % 20,38 0,4 10 m) 23,78 0,4 10 0 Các biến chủng tốt 22, 10, giữ lại để nghiên cứu tiếp Kết lên men chìm Đã tiến hành lên men chìm môi trương dịch thể MT1, MT3 MT4 Kết giới thiệu bảng Bảng Kết lên men chìm ST T Mơi Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Gh i trường B pumillus Pr mirabilis D 1 dd dd 0,2 14,3 0,1 20,3 MT dd s MT D 16,3 MT s 0,5 22,4 16,7 0,7 0,5 19,1 1,1 Môi trường MT4 dịch thể cho kết tốt Khảo sát tác dụng pH lên độ bền kháng sinh, kết (kết không giới thiệu) cho thấy pH trung tính kháng sinh bền Kết chiết xuất kháng sinh Dịch lọc dịch lên men chiết dung môi khác pH khác để chọn dung môi tốt Kết giới thiệu bảng Bảng Kết chiết xuất kháng sinh dung mơi hữu Kết (D - đường kính vịng vơ khuẩn, s) Dung mơi p H Pha dịch chiết Proteus Bacillus mirabilis Butyl Hữu acetat pumillus 18,3 0,9 23,8 2,3 Nướ 0 0 Hữu 17,3 2,2 25,6 1,6 c 7 Nướ 0 0 Hữu 14,2 1,9 25,1 2,5 c 10 5 Kết (D - đường kính vịng vơ khuẩn, s) Dung môi p H Pha dịch chiết Proteus Bacillus mirabilis pumillus Nướ 0 0 Hữu 13,9 0,3 15,1 1,0 c Cloro -form 4 Nướ c 18,1 Hữu 0,5 17,4 19,6 2,0 1,2 18,3 1,7 Nướ c 20,4 1,2 21,2 2,3 Kết (D - đường kính vịng vô khuẩn, s) Dung môi p H Pha dịch chiết Proteus Bacillus mirabilis Hữu pumillus 16,1 1,5 18,9 0,5 10 Nướ c Diclo 18,7 Hữu 8,66 -metan 1,1 19,0 0,5 3,2 9,37 0,8 Nướ c 19,1 Hữu 0,7 19,8 20,2 0,7 1,1 20,1 0,3 2 Kết (D - đường kính vịng vơ khuẩn, s) Dung mơi p H Pha dịch chiết Proteus Bacillus mirabilis Nướ c 16,6 Hữu pumillus 2,8 19,2 19,1 0,5 1,4 18,9 0,4 10 Nướ c n- 22,1 Hữu Butanol 0,8 25,2 22,1 0,3 1,1 28,2 0,3 Nướ c 0 0 Kết (D - đường kính vịng vơ khuẩn, s) Dung mơi p H Pha dịch chiết Proteus Bacillus mirabilis Hữu pumillus 21,5 0,9 21,6 1,1 7 Nướ - 0 Hữu 24,2 0,7 25,8 0,8 c 5 10 Nướ 0 0 c Như sử dụng số dung môi để chiết xuất kháng sinh, dung môi butylacetat n-butanol cho kết chiết tốt, n-butanol pH cho kết tốt Khảo sát tác dụng nhiệt độ lên kháng sinh cho thấy kháng sinh khơng bị hoạt tính đun cách thuỷ 30 phút đun sôi 10 phút Kết sắc ký lớp mỏng Đã tiến hành sắc ký lớp mỏng dịch chiết kháng sinh từ môi trường nuôi cấy bề mặt hệ dung mơi chạy có thành phần sau: Hệ H1: Cloroform: Metanol: NH4OH 25%: 2: 2: 1, Hệ H2: n-Butanol: Etanol: Dimethylformamid: 3: 1: 1, Hệ H3: Butylacetat: Aceton: Trietylamin: 1: 2: Các kết giới thiệu bảng Bảng Kết sắc ký lớp mỏng Hệ Rf dung môi Mắt thường UV254 Nynhidrin Vi sinh vật H1 0,75; 0,55;0,76; 0,80; 0,92 0,80;0,93 H2 0; 0,42; 0,55; 0,62; 0,76; 0,82 0; 0,66 0,97 0; 0,14 0,68 H3 0,55; 0; 0,82; 0,92 0 - 0; 0,87 Như hỗn hợp kháng sinh có thành phần có hoạt tính kháng sinh (hệ H2-thử nghiệm vi sinh vật), có thành phần hình với nynhidrin Kết thử kháng sinh chống nấm Tác dụng chống nấm kháng sinh Streptomyces 16.34 tạo khảo sát phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch Candida albicans, Saccharomyces cerivisiae, Aspergillus niger, Mốc đen sp.1, Mốc đen sp.3, Mốc xanh sp.1, Mốc xanh sp.2 Kết giới thiệu bảng Bảng Kết thử tác dụng chống nấm STT Chủng C albicans S cerivisiae A niger D s D s D s 16.34.1 11,59 2,96 17,23 0,09 10,36 1,19 16.34.4 11,64 1,82 15,55 0,91 12,15 1,73 16.34.22 11,02 1,34 17,11 0,50 11,99 1,07 16.34.24 9,39 0,55 16,12 0,82 11,01 1,29 16.34.25 10,25 0,95 17,24 1,29 10,44 0,60 16.34.30 9,51 0,76 15,91 0,13 9,83 0,66 Kháng sinh Streptomyces 16.34 tạo có tác dụng chống nấm rõ rệt: tác dụng với 6/7 vi nấm thử KẾT LUẬN Streptomyces 16.34 xạ khuẩn phân lập từ chất Việt Nam có tác dụng kháng sinh rõ rệt 8/10 vi khuẩn thử Tuy nhiên phân loại theo ISP cho thấy chưa xác định tên khoa học Streptomyces Sàng lọc ngẫu nhiên sàng lọc sau đột biến cho biến chủng kháng sinh tăng mạnh Lên men chìm mơi trường MT4 dịch thể cho kết tốt Sử dụng số dung môi hữu để chiết kháng sinh butyl acetat n-butanol cho kết tốt Sắc ký lớp mỏng cho thấy có thành phần kháng sinh Kháng sinh có tác dụng kháng nấm tốt, diệt 6/7 vi nấm thử ... học Streptomyces 16.34 theo ISP Kết thử khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 phân lập Kết thử khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 16.34 môi trường MT3 cho thấy Streptomyces 16.34. .. sinh chống nấm từ Streptomyces 16.34? ?? khía cạnh sau: - Nghiên cứu sàng lọc dạng chủng đầu dòng cải thiện khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 16.34 phân lập từ chất Việt Nam - Nghiên cứu. .. sinh tổng hợp kháng sinh: thành phần môi trường lên men, điều kiện ngoại cảnh, v.v để cải thiện khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng - Nghiên cứu chiết xuất kháng sinh, nghiên cứu thành phần kháng