CHUYÊN đề PHÂN lập, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM và TIÊU CHUẨN hóa dược LIỆU đại BI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH KHOA DƯỢC NHÓM -LỚP 17DDUB3 NGUYỄN VĂN TUẤN ANH TRẦN THỊ MỸ DUYÊN PHÙNG VÕ CÁT NGUYÊN NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM NGÔ THỊ NHO CHUYÊN ĐỀ PHÂN LẬP, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ĐẠI BI TP Hồ Chí Minh - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH KHOA DƯỢC NHÓM -LỚP 17DDUB3 NGUYỄN VĂN TUẤN ANH TRẦN THỊ MỸ DUYÊN PHÙNG VÕ CÁT NGUN NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM NGƠ THỊ NHO CHUN ĐỀ PHÂN LẬP, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ĐẠI BI GV hướng dẫn: ThS Trương Đỗ Quyên TP Hồ Chí Minh - 2020 MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 TÊN GỌI CỦA DƯỢC LIỆU 1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN BỐ 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Phân bố 1.3 BỘ PHẬN DÙNG 1.4 VI PHẪU 5 1.5 NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH HOẠT CHẤT 2.1 HOẠT CHẤT CHÍNH 2.1.1 D-borneol 2.1.2 L-camphor 2.1.3 Cineol 5 2.1.4 Flavonoid 2.1.5 Sesquiterpene lactones  2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 2.2.1 Hoạt chống khối u 2.2.2 Tác dụng bảo vệ gan 2.2.3 Chống oxy hóa 6 2.2.4 Kháng khuẩn kháng viêm 2.2.5 Tăng thẩm thấu qua da 2.2.6 Chữa lành vết thương 2.2.7 Ngăn ngừa béo phì 6 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP 3.1 CHIẾT XUẤT 3.1.1 Phương pháp cất kéo nước 3.1.2 Phương pháp cất kéo nước 3.2 PHÂN LẬP Type chapter title (level 3) Type chapter title (level 3) Type chapter title (level 3) Type chapter title (level 3) Type chapter title (level 3) KIỂM NGHIỆM 4.1 ĐỊNH TÍNH 4.1.1 Các thành phần dễ bay 4.1.2 Các thành phần khác 4.1.2.1 Flavonoid 4.1.2.2 Alkaloid 6 4.1.2.3 Glycoside tim (thuốc thử Keller-Killani) 4.1.2.4 Saponin 4.1.2.5 Tecpenoid (salkowski) 4.1.2.6 Tanin 6 4.1.2.7 Phlobatannin 4.2 ĐỊNH LƯỢNG 6 4.2.1 Định lượng borneol phương pháp sắc ký (GC) 4.2.2 Xác định tổng hàm lượng Flavone phép đo quang phổ UV-VIS 4.3 CHỈ TIÊU KHÁC CÔNG DỤNG 5.1 THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN 5.2 THEO Y HỌC HIỆN ĐẠI CÁC BÀI THUỐC VÀ CHẾ PHẨM 6.1 TRỊ VIÊM CỔ HỌNG MẠN TÍNH, VIÊM AMIDAN 6.2 TRỊ BỆNH VIÊM KHÍ QUẢN 6.3 LÁ ĐẠI BI CHỮA HO 5 6.4 RỄ CÂY ĐẠI BI CHƯA ĐAU BỤNG KINH 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B bal : Blumea balsamifera (L.) DC Ank : Alkaloid Fla : Flavonoid Sap : Saponin Ter : Terpenoid Phlo : Phlobatannin RSD : độ lệch chuẩn tương đối GC : sắc ký khí DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Tóm tắt phản ứng định tính thành phần có B balsamifera DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Ảnh dược liệu Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) Hình 2.1 Cấu trúc hóa học borneol Hình 2.2 Cấu trúc camphor Hình 2.3 Cấu trúc cineol Hình 3.1 Sơ đồ quy trình cất kéo đại bi nước Hình 4.1 Sắc ký đồ tổng dịng ion GC-MS dầu dễ bay Blumea balsamifera Hình 4.2 Kết phân tích thành phần hóa học dầu dễ bay từ Blumea balsamifera GC / MS DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo cho chúng em môi trường học tập lành mạnh tiến Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên môn – Cơ Trương Đỗ Qun nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức quý báu sống kiến thức chun mơn cịn làm cho chúng em u thích mơn Dược liệu nhiều Với vốn kiến thức hạn chế lần chúng em làm báo cáo với hình thức tiểu luận nên khơng tránh khỏi sai sót Chúng em mong nhận ý kiến đóng góp, phê bình thầy Đó hành trang quý giá để chúng em hồn thiện cống hiến kiến thức ỏi vào nghiệp tiến xã hội sau Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn gia đình, người thân cảm ơn bạn thành viên nhóm cố gắng hồn thành tốt báo cáo Chúng em xin chân thành cảm ơn! TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc và vị thuốc Viê ̣t Nam, NXB Y học, tr.605-607 BỘ Y TẾ (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y HỌC, Hà Nội, tr 183, 267 Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, PL Pang, Y.; Wang, D.; Fan, Z.; Chen, X.; Yu, F.; Hu, X.; Wang, K.; Yuan L   (2014), “Blumea balsamifera—A Phytochemical and Pharmacological Review”, Molecules, 19(7), pp 9453-9477 Zhou X., Yang X.S., Zhao C (2001), “Chemical components of volatile oil from folium et cacumen Blumea balsamifera originated from Guizhou”, J Instrem Anal, 20, pp 76–78 China Pharmacopoeia Committee (2005), Chinese Medicine Science and Technology Press, Chinese Pharmacopoeia, pp 740 Isidorov VA, Krajewska U, Vinogorova VT, Vetchinnikova LV, Fuksman IL, Bal K (2004), “Gas chromatographic analysis of essential oil from buds of different birch species with preliminary partition of components”, Biochem Syst Ecol, 32, pp 1–13 Zhi-long Jiang, Yan Zhou, Wei-chen Ge, and Ke Yuan (2004), “Phytochemical compositions of volatile oil from Blumea balsamifera and their biological activities”, Pharmacogn Mag, 10(39), pp.346–352 Saikia P., Khan ML (2011), “Diversity of medicinal plants and their uses in home gardens of upper Assam, Northeast India”, Asian J Pharm Biol Res, 1, pp 296-309 10 Ganesh Chandra J (2015), “Ethnomedicinal Use and Phytochemical Analysis of Selected Medicinal Plants of Mizoram, India”, Vol.1.Truy cập từ trang https://greenchemistry.imedpub.com/ethnomedicinal-use-and-phytochemicalanalysis-of-selectedmedicinal-plants-ofmizoram-india.php?aid=7836 (ngày truy cập 10-18-2020) 11 Joshi K, Joshi R, Joshi AR (2011), “Indigenous knowledge and uses of medicinal plants in Macchegaun”, Nepal Ind J TradKnowl, 10, pp 281-286 12 Nessa, F.; Ismail, Z.; Karupiah, S.; Mohamed (2005), “N RP–HPLC method for the quantitative analysis of naturally occurring flavonoids in leaves of Blumea balsamifera DC”, Journal of Chromatographic Science, 43, pp 416–420 13 Wang, Yuanhui; Shi, Linfan; Wang, Aimei; Tian, Hongyun; Wang, Hongxin; Zou, Chunli(2014), “Preparation of High-Purity (–)-Borneol and Xanthoxylin from Leaves of Blumea balsamifera (L.) DC”, Separation Science and Technology, 49, pp 15351540 14 Xu, Jing; Jin, Da-qing; Liu, Cuizhou; Xie, Chunfeng; Guo, Yuanqiang; Fang, Lingzhi (2012), “Isolation, Characterization, and NO Inhibitory Activities of Sesquiterpenes from Blumea balsamifera”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, pp 8051- 8058 15 D.M.H Ali; K.C Wong; P.K Lim (2005), “Flavonoids from Blumea balsamifera”, Fitoterapia, 76, pp 128- 130 16 MỞ ĐẦU Nhờ khí hậu ơn hịa, hệ động thực vật phát triển phong phú đa dạng Đặc biệt vị thuốc có dược tính q giá tổ tiên ta sử dụng để phòng bệnh, chữa bệnh hiệu Đúc kết từ kinh nghiệm ý chí tìm tịi, nghiên cứu dược liệu có giá trị với đời sống thực tiễn, nhiều ghi chép, sách truyền từ đời sang đời khác trân trọng gìn giữ ngày Với tiến khoa học đại giới giúp cho ngành dược liệu học Việt Nam nói riêng giới nói chung ngày phát triển gặt hái nhiều thành công Xu hướng sử dụng dược liệu hoạt chất tinh chế từ dược liệu ngày phổ biến nhằm tìm tịi, phát tính ứng dụng y học Trong số nhiều dược liệu nghiên cứu nay, đại bi (Blumea balsamifera) từ xưa ông bà ta sử dụng để chữa trị số bệnh thông thường cảm cúm, đau mắt, đau bụng, ho lâu ngày… Từ nhu cầu muốn hiểu rõ sâu sắc nguồn gốc gây nên tác dụng có lợi Dựa phương tiện khoa học phân lập, định tính hoạt chất có tác lợi từ chiết xuất, tinh chế hoạt chất góp phần làm phong phú thêm nguồn tài nguyên hoạt chất cho y học PHẦN TỔNG QUAN: 1.1 TÊN GỌI CỦA DƯỢC LIỆU Tên gọi: Đại bi Tên gọi khác: Từ bi xanh, băng phiến, đại ngải, mai hoa não, gãi nạp hương, mai phiến, mai hoa băng phiến, long não hương, … Tên khoa học: Blumea balsamifera (L.) DC Họ: Cúc (Asteraceae) 1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN BỐ 1.2.1 Đặc điểm hình thái Cây nhỏ, cao khoảng 1,5-2,5m, thân phân cành phía ngọn, nhiều lơng Lá mọc so le, phiến có lơng, mép có cưa hay ngun Cụm hoa hình ngù nách hay ngọn, gồm nhiều đầu, đầu có nhiều hoa màu vàng Quả bế có lơng Tồn có mùi thơm Long não Cây hoa tháng 3-5, có tháng 7-8 [1] Hình 1.1 Ảnh dược liệu Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) 1.2.2 Phân bố Cây phân bố rộng rãi khắp vùng núi độ cao 1000m, trung du đồng bằng, thường gặp ven đường, quanh làng, savan, đồng cỏ (Việt Nam, Trung Quốc nước vùng Nam Á, từ Ấn Độ kéo đến Malaysia, Philippin, …) Tại Việt Nam, phân bố nhiều vùng, loại mọc dại ven đường Có nhiều ởmiền trung du, đồng bằng, hải đảo, ven rừng vùng núi cao 1000m Các vùng đồi núi quang, có nhiều ánh sáng, bãi đất rộng địa điểm lý tưởng cho phát triển phát tán nhanh chóng Nhiều vùng Tây Nguyên, Tây Nam Bộ Cà Mau, Kiêng Giang, Đồng Tháp 1.3 BỘ PHẬN DÙNG Tồn 1.4 THU HÁI Có thể thu hái quanh năm, chủ yếu vào mùa hạ Thu hái toàn vào mùa hạ thu, dùng tươi, phơi hay sấy khơ Có thể dùng non búp để chưng cất cho thăng hoa thành Mai hoa băng phiến (Long não Ðại bi) 1.5 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Lá chứa từ 0,2-1,8% tinh dầu Trong thành phần chủ yếu D-borneol, L camphor, cineol, limonen, acid palmitic, acid myristic, cịn có sesquiterpen alcol Thành phần mai hoa băng phiến borneol; chất có tinh thể óng ánh trắng hoa mai, mà có tên mai hoa băng phiến hay băng phiến đại bi Ngoài ra, thành phần đại bi cịn có nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe khác như: Vitamin C, protit, lipit, sắt, corten, canxi, … [2] HOẠT CHẤT 2.1 HOẠT CHẤT CHÍNH Trong đại bi thường có chừng 0,2 đến 1,88% tinh dầu chất băng phiến Thành phần chủ yếu tinh dầu có D-Borneol, L camphor, Cineol, Limonen, … Tỉ lệ Borneol L camphor thay đổi theo vùng: Hà Giang 97% borneol, 1,2% Camphor, Hà Nội 50,57% 18, 71%, Đắc Nông 5,7% 70,05% 2.1.1 D-borneol Chất băng tinh phiến gồm chủ yếu chất borneol có cơng thức C 10 H 18O, có tinh thể trắng óng ánh hoa mai có tên mai hoa Điểm chảy: 203-204°C Rất dễ thăng hoa Thể rắn nhiệt độ thường Độ sôi: 212°C Không tan nước, tan dung môi hữu cồn cao độ Rất dễ bị oxy hoá thường xảy với trùng hiệp hố Hình 2.1 Cấu trúc hóa học borneol 2.1.2 L-camphor Bột kết tinh phiến trắng gần trắng, khối kết tinh không màu Thăng hoa nhiệt độ thường Khó tan nước, tan ethanol 96 % ether dầu hỏa (khoảng sôi từ 50 °C đến 70 °C) Dễ tan dầu béo, rất khó tan glycerol Hình 2.2 Cấu trúc camphor 2.1.3 Cineol Chất lỏng trong, khơng màu, có mùi đặc trưng Thực tế không tan nước, trộn lẫn với ethanol 96 % và dicloromethan Hình 2.3 Cấu trúc cineol 2.1.4 Flavonoid Bao gồm thành phần flavonoid, flavanon chalcon Quercetin, blumeatin, velutin, tamarixetin, dihydroquercetin-7,4'-dimethyl ether, ombuine, rhamnetin, luteolin-7-methyl ether, luteolin, 5,7,3 ', 5'-tetrahydroxyflavanone dihydroquercetin-4'-metyl ete… 2.1.5 Sesquiterpene lactones  Là nhóm chất hố học phổ biển họ Cúc, có ba sesquiterpene lactones, Blumealactone A, Blumealactone B, Blumealactone C. Có tác dụng gây độc tế ức chế khối u 2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 3.2.3 Phân lập số flavonoid Bằng cách chiết xuất Soxhlet khô (189 g) với ligroin (60–80 oC) thu 3,4 ', 5-trihydroxy-3', 7-dimethoxyflavanone (500 mg) Từ trình chiết xuất với axeton thu ', 4', 5-trihydroxy-7-metoxyflavanone (100 mg) biflavonoid mới( 3-O-7 "-biluteolin (880 mg) 3.2.4 Ly trích phân lập chất ức chế Xanthin Oxidase 3.2.4.1 Ly trích cao thơ Cây đại bi xay nhỏ chia làm nhiều phần trích nóng với metanol phương pháp đun hoàn lưu Mỗi lần trích khoảng 250 gam với 1,5 lít metanol, đun hồn lưu ba Mỗi phần trích lần Tồn dịch trích thu đem quay áp suất kém, thu cao metanol thô Cao metanol thô cho phân tán nước cất chiết với dung môi hexan, cloroform, etyl acetat thu cao tương ứng: cao hexan, cao CHCl3, cao EtOAc cao H2O Quy trình ly trích cao trình bày sơ đồ 3.1 3.2.4.2 Quá trình phân lập 3.2.4.2.1 Cao CHCl3 Thực sắc ký cột cao CHCl3 (57,6 g) silica gel với hệ giải ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 20%) dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2 đun nóng, gom thành phân đoạn (F1-F4) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F2 (9,1 g) với hệ dung ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2 đun nóng thu sáu phân đoạn (F2.1- F2.6) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F2.3 (2,5 g) với hệ dung ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH) thu phân đoạn (F23.1-F23.5) Sắc ký cột hấp phụ silica gel pha đảo phân đoạn F23.2 (354 mg) F23.3 (612 mg) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu hợp chất (1) (2) (sơ đồ 3.2) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F3 (11,2 g) với hệ dung ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2 thu năm phân đoạn (F3.1-F3.5) Sắc ký cột hấp phụ silica gel pha đảo phân đoạn F3.2 (1,2 g) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu hợp chất (4) (sơ đồ 3.3) 3.2.4.2.2 Cao EtOAc Thực sắc ký cột cao EtOAc (32,4 g) silica gel với hệ giải ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 20%) dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2, gom thành phân đoạn (F1-F7) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F3 (4,6 g) với hệ dung ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-20% MeOH), dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2 thu bốn phân đoạn (F3.1-F3.4) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F3.2 (2,3 g) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu hai hợp chất (6) hợp chất (7) (sơ đồ 3.4) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F3.4 (820 mg) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu hợp chất (3) (sơ đồ 3.4) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F4 (3,5 g) với hệ dung ly cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-20% MeOH), dựa sắc ký lớp mỏng màu dung dịch Ce(SO4)2 thu năm phân đoạn (F4.1F4.5) Sắc ký cột hấp phụ silica gel phân đoạn F4.2 (550 mg) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu hợp chất (5) (sơ đồ 3.5) KIỂM NGHIỆM 4.1 ĐỊNH TÍNH 4.1.1 Các thành phần dễ bay Phương pháp GC-MS Một số nghiên cứu trước báo cáo loại dầu dễ bay của B.balsamifera chủ yếu chứa monoterpenes sesquiterpenes, chẳng hạn như L-borneol, 10-epi-γ-eudesmol, γ-eudesmol, β-eudesmol, α-eudesmol, limonene, L -camphor, axit palmitic, và D- long não [1] Các bước tiến hành:  Khai thác tinh dầu: Lấy 200 g bột khô cây Blumea balsamifera sau rây qua rây 20 lỗ, cho vào bình cầu đáy trịn thêm 600 mL nước cất vào, sau chiết máy chiết dầu bay theo. Thu lấy dịch cất chiết dietyl ete. Chúng ta thu dầu dễ bay sau thêm natri sulfat khan. Dầu dễ bay chất lỏng nhờn có màu vàng nhạt mùi thơm nồng. Tỷ lệ thu dầu của Blumea balsamifera là 3,25% [ 2 ]  Các điều kiện phâ tích: Điều kiện GC: Cột sắc ký cột mao quản thạch anh đàn hồi DB-WAX (30 m × 0,25 mm, 0,25 mm); lập trình nhiệt độ: Giữ nhiệt độ ban đầu 45 ᴼC phút, sau tăng nhiệt độ lên 100 ᴼC với tốc độ 10 ᴼC phút lại tăng nhiệt độ lên 170 ᴼC với tốc độ ᴼC phút, sau lại đến 240 ᴼC phút tốc độ 10 ᴼC phút. Nhiệt độ cửa nạp mẫu 250 ᴼC, nhiệt độ phịng chế hịa khí 250 ᴼC, khí mang heli; vận tốc dịng chảy 0,8 ml/phút, tốc độ lấy mẫu tách 20 ml/phút Các điều kiện phổ khối lượng: Để electron bắn phá nguồn ion hóa tác động electron; năng lượng ion hóa 70 eV; nhiệt độ nguồn ion hóa 200 ᴼC; điện áp máy dò 350 V; dải chất lượng quét từ 40300 m/z; tốc độ quét 0,5 s; và nhiệt độ bốn 130 ᴼC. Mỗi khối phổ tương ứng với pic sắc ký định tính sở biểu đồ máy tính; Hàm lượng tương đối thành phần tính phương pháp chuẩn hóa diện tích pic theo biểu đồ tổng dịng ion  Giá trị số trì: Thí nghiệm sử dụng mẫu đối chứng hỗn hợp n-alkan để phân tích liệu điều kiện sắc ký khí khối phổ, đồng thời sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích pic để xác định tỷ lệ phần trăm tương đối thành phần hóa học tinh dầu. Sau đó, tính tốn giá trị RI thành phần phương trình tuyến tính theo thời gian lưu n-alkan. RI = 100n + 100 (t x - t n ) / t n + 1 - t n ; ở phân tích nhóm t x , t n và t n + 1 với số cacbon thời gian lưu (phút) đỉnh dòng n n + n-ankan (t n