Đề tài vật LIỆU y SINH TRONG TIM và VAN TIM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC -o0o Tiểu luận môn: VẬT LIỆU Y SINH Đề tài: VẬT LIỆU Y SINH TRONG TIM VÀ VAN TIM DANH SÁCH NHĨM • Phạm Thị Thủy 1115583 • Phạm Phúc Diễm Trang 1118487 • Nguyễn Thị Ngọc Ánh 1215016 • Nguyễn Ngọc Anh Thư 1118462 • Hà Thị Kim Tuyền 1118524 MỤC LỤC Mở đầu I Vật liệu y sinh chế tạo van tim Giới thiệu van tim Van sinh học II TAVI((transcatheter aortic valve implantation) Kĩ nghệ mô van tim 4.1 Kĩ nghệ mô van tim tạo dựa vào matrices dị loài decellularized 4.2 Kĩ nghệ mô van tim dựa vào matrices từ polyme 4.3 Kĩ nghệ mô van tạo dựa vào matrices lai sinh học/ polymer 4.4 Thảo luận 4.5 Triển vọng tương lai 11 12 Vật liệu y sinh chế tạo tim 22 Kết Luận 13 15 18 18 20 28 MỞ ĐẦU: Tim quan quan trọng, máy bơm chuyển máu nuôi tế bào khắp thể Do đó, bệnh tim có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh mạng người, bệnh gây tử vong hàng đầu Hoa Kì (gần 2000 người chết ngày) • Thế giới: Theo thống kê, năm giới có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch Bệnh thường gặp nữ giới nhiều nam giới • Việt Nam: Cứ người trưởng thành có người có nguy mắc bệnh tim mạch, Mỗi năm, bệnh lý tim mạch cướp khoảng 200.000 người, chiếm 1/4 tổng số trường hợp tử vong Hiện nay, biện pháp điều trị hư hỏng tim hạn chế phải lắp thiết bị nhân tạo cấy ghép từ người hiến tặng Việc gây bất cập bệnh nhân phải uống thuốc gây giảm miễn dịch để hạn chế đào thải quan cấy ghép, sử dụng thuốc chống đông máu; chi phí điều trị cao vấn đề đạo đức (buôn bán nội tạng) I VẬT LIỆU Y SINH TRONG CHẾ TẠO VAN TIM Giới thiệu van tim: Là mỏng, mềm dẽo Quả tim bình thường có bốn buồng tim: nhĩ trái thất trái ngăn cách với van hai lá, nhĩ phải thất phải ngăn cách van ba Dòng máu từ thất phải qua van động mạch phổi để lên động mạch phổi, từ thất trái qua van động mạch chủ để vào động mạch chủ Vai trò van giúp dòng máu theo chiều định Hoạt động van tim: Khi tim giãn: máu từ tâm nhĩ đổ vào tâm thất Khi van mở, van bán nguyệt đóng lại Khi tim co: máu từ tâm thất đổ động mạch van bán nguyệt mở Van đóng mở 400 triệu lần năm Van Sinh học Là loại van lấy từ tim động vật (van dị loài) xử lý loại bỏ thành phần gây thải ghép (các thành phần mang tính kháng nguyên) sửa lại phần Chúng đặt lên khung đỡ kim loại hay nhựa để giúp đặt vào thể cách dễ dàng Một loại van sinh học khác sử dụng tổ chức van lấy từ người hiến tạng (van đồng loài) Loại van thường thay cho van động mạch Có thể chia thành: + Có stent: gồm mơ động vật+vịng bao quanh làm nhựa kim loại +Không stent: van người van heo động mạch chủ mạch máu lớn từ thể  Van Tim Heo (pig/ porcine valve) Đây loại van giống van người cấu trúc chức Thời gian sử dụng từ 10-15 năm Vật liệu bao gồm +Van heo +Stent làm hợp kim Elgiloy(Cobalt-nickel) +Vòng bao quanh Teflon  Van Tim Bò ( Cow/Bovine Valve) Khơng giống van tim heo, thay cấu trúc thật mà lấy từ ngoại tâm mạc bò(hoặc heo/ngựa) bao quanh lớp kim loại để dễ cấy vào người Thời gian sử dụng: 20 năm +Huyết động lực học ổn định, kích thước nhỏ(19-21 mm) +Nguồn cung cấp nhiều Van sinh học có vấn đề quan tâm thối hóa canxi hóa Sự thối hóa xảy lực dồn tim gây “ mệt mỏi” tim, dẫn đến van bị hư Tất van sinh học thường xử lý với Glutaraldehyde(GLUT) trước cấy ghép + Có thể liên kết chéo với Collagene=>giảm đáp ứng miễn dịch, tăng nguy bị canxi hóa +Giảm tính kháng ngun +Và tế bào có khả sống sót cao +Duy trì ổn định sợi +Giảm chế stress tim tăng độ bền cấu trúc Tuy nhiên GLUT lại +Làm Van bị thối hóa Canxi hóa( tăng Canxi khống) +Khơng thể liên kết với elastin glucosaminoglycans(GAGs) ( mô động vật) Nhưng khơng xử lý với GLUT van bắt đầu thối hóa nhanh chóng rút ngắn thời gian sử dụng Sau người ta thấy neomycin trisulphate, ức chế hyaluronidase, kết hợp với  1ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) sau liên kết với GLUT (NEG) mơ Nhóm khác gồm mơ liên kết chéo với EDC/NHS GLUT(ENG) Nhóm cuối mơ xử lý với GLUT Nhóm NEG cho thấy khả ức chế enzyme phân hủy GAGs hẳn so với nhóm Tất nhóm ổn định collagene Khi nhóm cấy da chuột in vivo xem xét thối hóa GAGs Thì NEG mang lại kết tốt hẳn nhóm NEG ENG giảm q trình Calci hóa hẳn GLUT Hình 1: kết nhuộm với Alcian xanh đại diện cho GAGs xử lý với chất A GLUT B.ENG C.NEG Kết cho thấy GLUT bắt màu NEG bắt màu nhiều GAGs tập trung nhiều vùng Hình A Phân tích hexosamine sau tuần NEG trì GAGs nhiều so với nhóm Hình B Phân tích với Calcium cho thấy NEG có q trình Calci hóa thấp so với nhóm == Neomycin kháng sinh thơng dụng có thể: +Ức chế enzyme phân hủy GAGs +Có khả liên kết với elastin GAGs +Giảm thối hóa van +Giới hạn tăng Canxi +Có khả chịu đựng stress giúp van hoạt động thêm nhiều năm Neomycin ngăn chặn enzyme gián tiếp phân hủy glycosaminoglycan van sinh học nhân tạo Ưu-Nhược điểm van sinh học Ưu điểm + Không cần sử dụng thuốc chống đông máu suốt đời + Giống với van tim người=> không cần sử dụng thuốc chống thải ghép sau Nhược điểm +Tuổi thọ khơng cao q trình thối hóa diễn nên bệnh nhân nhỏ tuổi phải thay thêm vài lần +Có thể bị Calci hóa Q trình Calci hóa Q trình Calci hóa tượng nguyên tử Cacbon, Phosphate hợp chất có chứa Cacbon hình thành cục nhỏ Van=> Van hỏng Canxi hóa độ tuổi cảm ứng trình” wear and tear” tạm dịch mài mòn dễ rách Lượng Cholesterol giảm q trình calxi hóa giảm mà chưa tìm nguyên nhân  Giải pháp uống loại thuốc làm giảm lượng phospholipid nhóm thuốc statin làm giảm q trình Calci hóa 10 Hình 2: Sơ đồ bioreactor giúp tim đập Các van tim kĩ nghệ mô (mũi tên) bơm máu với môi trường chất dinh dưỡng Các luồng nhịp tạo thơng qua hệ thống khí nén Điều kiện áp suất trao đổi khí giám sát, vô trùng Chỏm van từ động mạch chủ rung suốt chu kỳ tim Một ống dẫn động mạch chủ tâm nhĩ trái cấy ghép giúp tăng áp suất động mạch chủ cách giảm áp suất tâm trương (Hilbert cộng 1999) Toàn sáu van có tế bào tự thân cấy ghép Hai van có EC bốn van lại chứa với tế bào sợi (myofibroblasts) EC Tất loại van cấy sang mô vào tuần thứ 12 Hình thái tổng quát cho thấy bề mặt bên phẳng khơng hình thành huyết khối không dãn Mặc dù ban đầu van dịch chuyển quan sát siêu âm tim Doppler cấy vào mô ống dẫn hoạt động, van khơng cịn dịch chuyển Có thể giải thích sinh lý bệnh học cho tượng thích nghi hệ tuần hồn cừu 4.2 Kĩ nghệ mơ van tim dựa vào matrices từ polyme Một vật liệu tổng hợp lý tưởng Hình van tim từ mơ tự thân thiết kế trước cấy mơ hình động vật (Hoerstrup et al 2000b.) scaffold tạm thời dẫn đến hình thành phát triển mơ Nó phải có 90% lỗ (Agrawal & Ray 2001) phải 15 có mạng lưới lỗ liên kết với điều cần thiết cho tăng trưởng tế bào, cung cấp dinh dưỡng loại bỏ chất thải từ trình trao đổi chất Hiện nay, số kỹ thuật sử dụng để chế tạo cấu trúc lỗ vậy, ví dụ kỹ thuật lọc qua muối, dệt lưới sợi (Agrawal & Ray 2001; Hutmacher et al 2001), tạo mẫu cách nhanh chóng(Hutmacher et al 2001), giai đoạn tách (Nam & Park 1999) mạ điện (Buchko et al 1999) Bên cạnh tính tương hợp sinh học, phân hủy tái sản xuất, scaffold nên có bề mặt hóa học thuận lợi cho tế bào tăng trưởng phù hợp với đặc tính học mơ Một số loại polyme tổng hợp có khả phân hủy sinh học, chẳng hạn polyglactin, acid polyglycolic (Shinoka et al 1995) (PGA; Shinoka et al 1996)., Acid polylactic (PLA; Shinoka et al 1998)., Polyhydroxyalkanoates (PHA; Sodian 2000a et al.) copolymer PGA PLA (PGLA; hãng ZÜND et al 1997), nghiên cứu matrices cho kỹ nghệ mô van tim (A) Aliphatic polyesters Polyglactin, PGA PLA thuộc họ polyeste béo, có khả phân hủy, phân tách chuỗi polymer cách thủy phân ester chúng Kết monomer tiết nước tiểu vào chu trình acid tricarboxylic (Agrawal & Ray 2001) Nỗ lực ban đầu để tạo van tim dựa phối hợp polyeste béo Những hạn chế chủ yếu từ polyeste béo độ dày chúng, độ cứng tính dẻo, dẫn đến khó khăn để chế tạo van tim ba (B) Polyhydroxyalcanoates Họ PHAs gồm polyeste tạo từ sản phẩm hydroxyacids hạt tế bào vi khuẩn (Kessler & Withold 2001) Cả polyhydroxyoctanoate (Sodian et al 2000b, c) poly-4-hydroxybutyrate (P4HB) sử dụng (Sodian et al 2000a, b) để tạo ống dẫn van tim ba Những vật liệu có tính chất nhiệt dẻo dễ dàng đúc thành hình dạng mong muốn (Sodian et al 2002) Hạn chế chung PHAs phân hủy Khi kết hợp polyeste béo PHAs thử nghiệm polyme tổng hợp (Hoerstrup 2000b; Cổ et al 2000; Rabkin et al 2002) Đặc biệt, sử dụng PGA với P4HB, kết hợp độ xốp cao PGA tính nhiệt dẻo P4HB (Hoerstrup 2000b; Rabkin et al 2002) Ứng dụng điều chế tạo loại van tim ba hoàn chỉnh cho thấy kết đầy hứa hẹn cừu có tăng trưởng nhanh chóng(Hoerstrup 2000b) (C) Bằng chứng nghiên cứu 16 Trong nghiên cứu dựa nguyên tắc kĩ nghệ mơ van tim tự thân có matrices từ PGA / P4HB mơ hình ni cấy động vật, bước thử nghiệm sau hình thành (Hoerstrup et al 2000b) Van tim ba chế tạo từ PGA / P4HB cho vào myofibroblasts cừu tự thân EC Các cấu trúc hình thành 14 ngày máy phát xung hệ thống ống nghiệm tăng lưu lượng điều kiện áp suất (hình 3) Hình Van tim kĩ nghệ mơ tự thân(Autologous) trước cấy vào mơ hình động vật ( Hoerstrup cộng 2000 b ) Sử dụng mạch nối tim phổi, phổi tự nhiên bị cắt bỏ van cấy vào sáu cừu (weightZ19G2.8 kg) Kết cho thấy tất sáu khơng có chuyện xảy sau phẫu thuật van ghép từ ngày 4, 6, 8, 16 20 tuần Siêu âm tim cho thấy tim hoạt động, không bị hẹp lại Mô học cho thấy đồng lớp mơ với nội mạc Soi kính hiển vi điện tử cho thấy bề mặt phẳng van Tính chất học so sánh với mơ tự nhiên tuần 20 Toàn phân hủy polyme xảy tuần thứ Các phân tử ECM (collagen, elastin glycosaminoglycans) DNA tăng đến mức tương tự mơ tư nhiên chí cao tuần 20 Nghiên cứu chứng minh trình hình thành in vitro van tim sống cấy ghép dựa tổng hợp matrices từ polymer nuôi cấy môi trường thể Các 17 van tự thân hoạt động tới năm tháng thể giống van tim bình thường vi cấu trúc, tính chất học hình thành ECM (D) Từ động vật sang người Như nguyên tắc việc sử dụng matrices tổng hợp thực thành cơng mơ hình động vật, phương pháp chuyển sang người hệ thống ống nghiệm Trong hầu hết phương pháp tiếp cận kĩ nghệ mô tim mạch, tế bào thu hoạch từ mô người, ví dụ từ động mạch ngoại vi quần thể tế bào mạch máu gồm myofibroblasts EC Trong số này, dịng tế bào dễ dàng tách máy phân loại tế bào (Hoerstrup et al 1998), gieo vào matrices phân hủy sinh học thực theo hai bước Đầu tiên, myofibroblasts cho vào tăng trưởng Thứ hai, EC gieo bề mặt mơ dẫn đến hình thành cấu trúc mơ học tương tự van tự nhiên Đối với ứng dụng lâm sàng, số nguồn tế bào người thử nghiệm Trong số hứa hẹn tế bào mạch máu từ tế bào có nguồn gốc tủy xương (hình 4a-c), từ tế bào máu (hình 4d- f) tế bào máu cuống rốn Gần đây, tế bào có nguồn gốc từ tủy xương cuống rốn thử nghiệm thành cơng để tạo van tim (hình 5) ống nghiệm (Hoerstrup et al., 2002a, b) bên cạnh tế bào mạch máu thu mà khơng cần phẫu thuật, nguồn tế bào dễ thu nhận Do phát triển tiềm chúng, tế bào xem lựa chọn hấp dẫn cho ứng dụng kỹ nghệ mô tim Trong nghiên cứu gần đây, việc sử dụng tế bào máu cuống rốn nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho kỹ nghệ mô tim chứng minh, họ cho thấy thử nghiệm tuyệt vời matrices tổng hợp từ PGA / P4HB (Schmidt et al 2004) Cũng hình thành nội mạc mô van tim dựa matrices có nguồn gốc từ PGA/P4HB tế bào sợi từ cuống rốn 4.3 Kĩ nghệ mô van tim tạo dựa vào matrices lai sinh học/ polymer Một chiến lược xa kỹ thuật mô mà gần giới thiệu sử dụng vật liệu composite sinh học / polymeric matrices lai Lai tạo cấu trúc phức tạp van tim, ví dụ: chế tạo từ van động mạch chủ heo decellularized nhúng phủ với polymer phân hủy sinh học (Stamm 2004) Hơn nữa, scaffolds bổ sung tín hiệu phân tử để bắt chước cấu trúc chức vi môi trường ngoại bào tự nhiên phát triển năm gần (Lutolf & Hubbell 2005) 4.4 Thảo luận (a) Viêm chất gian bào (matrix) 18 Vấn đề tồn đáp ứng viêm miễn dịch phản ứng bên thể Năm 2003, nhóm bác sĩ phẫu thuật tim Vienna công bố kết thảm hại họ van tim heo decellularized bệnh nhi (Simon et al 2003) Ba số bốn bệnh nhân tử vong năm sau điều trị phẫu thuật biến chứng liên quan đến van Mô học họ cho thấy viêm nhiễm nặng từ ngồi với thối hóa sau Họ cịn nhiều phần decellularization chưa xác định đầy đủ Mặc dù viêm cho thấy đáp ứng miễn dịch với tế bào xenogeneic ECM gây tranh luận tiếp tục nghiên cứu (b) An tồn mơ xenogeneic decellularized Một vấn đề quan trọng khả lan truyền mối nguy hiểm từ vi sinh vật mô cấy ghép ngoại lai(xenotransplanted), retrovirus nội sinh lợn bệnh prionic Gần đây, liệu dịch tễ học cho thấy lan truyền mạnh mẽ bệnh CreutzfeldJakob từ gia súc sang người thông qua thịt bị nhiễm bệnh, vật liệu phẫu thuật có nguồn gốc từ ruột bò hay loại thuốc, vắc xin chuẩn bị sử dụng huyết thai bê (Knight & Collins 2001) Ngược lại, nghiên cứu gần (Kallenbach et al 2004) cho thấy lan truyền retrovirus nội sinh lợn từ lợn sang người khó (c) Việc chuẩn bị trước kỹ nghệ mô van tim trước cấy Kích thích tương tác học sinh học vần đề phức tạp việc điều hịa trạng thái mơ Để kích thích tương tác số điều kiện thuận lợi tạo Điều hòa học bao gồm tác nhân kích thích học bioreactors in vitro dòng chảy, ứng suất cắt căng áp dụng để phát triển mô Đối với kỹ nghệ mô van tim, phản ứng sinh học thường sử dụng phổ biến hệ thống máy tạo xung (duplicator) mô môi trường sinh học tạo điều kiện cho việc mở đóng hoạt động van Sau cấy in vitro cung cấp yếu tố tăng trưởng kích thích học (bioreactors) kích thích phát triển mô (Niklason et al 1999) (D) Các mô hình động vật tuần hồn phổi động mạch chủ Một mơ hình động vật tồn giới thành lập chấp nhận để kiểm tra thiết bị van tim sinh học môi trường thể phát triển cừu Cừu có hệ thống van bị canxi hóa nhanh nhất, khả tăng trưởng tim mạch máu lớn tương đương với người Cấy van tim thay tuần hoàn phổi tương đối dễ dàng để thực có tỷ lệ gây bệnh thấp (Cổ et al 2000) Tuy nhiên, việc đánh giá van tim động mạch chủ cần phải đánh giá hệ tuần hoàn Do vấn đề giải phẫu cấy ghép theo chiều thẳng vị trí vành(subcoronary) cừu vơ khó khăn phức tạp tỷ lệ gây bệnh tử vong cao Cấy ghép thay tập trung vào động mạch chủ 19 giảm dần vấn đề khác (Hilbert et al 1999) Thành công ban đầu cho thấy van mở đóng suốt chu kỳ tim xác nhận siêu âm Theo đó, có động lực để nghiên cứu vấn đề khác chức van thối hóa mơ hình động vật 4.5 Triển vọng tương lai (?)Cần có u cầu van? Khái niệm kỹ nghệ mô van tim phẫu thuật khoa nhi Được thúc đẩy việc thiếu thay thích hợp cho bệnh nhân khơng có bị thay đổi nghiêm trọng mơ van bẩm sinh Phần lớn bệnh nhân cần phải có ống dẫn van Cấy ống dẫn, địi hỏi kỹ phẫu thuật cao, người lớn Khi tỷ lệ biến chứng cao van dị loài, cho thấy giảm sử dụng van thời gian gần Kỹ nghệ mô van tự thân có khả tăng trưởng, sửa chữa tái tạo vượt qua thiếu vật liệu thay thích hợp tránh việc giải phẫu lại Đa số bệnh nhân cần thay van người lớn 70 tuổi Khi tuổi thọ tăng cao, ngày nhiều bệnh nhân có nhu cầu thay van tim có chức lâu dài mà van sinh học xử lý với glutaraldehyde đáp ứng Sự phát triển kỹ nghệ mô van tim dựa vào thiết kế có stent bước quan trọng việc đạt mục tiêu Lý tưởng nhất, công nghệ kĩ nghệ mô đưa vào thử nghiệm lâm sàng tương lai, lịch trình cho bệnh nhân lớn tuổi chẩn đoán với bệnh van tim là: (i) thu tế bào cách, ví dụ, chọc tủy xương gây tê chỗ; (ii) biệt hóa mở rộng tế bào kỹ nghệ mô van tim ống nghiệm; (iii) theo tiêu chuẩn chất lượng xác định (hóa sinh, mơ học, an tồn sinh học, vv), việc cấy van tự thân vào bệnh nhân sau khoảng thời gian sáu đến tám tuần 20 Hình 4: Các tế bào tủy xương có nguồn gốc từ người 14 ngày sau tách (a) độ phóng đại 400X; ép vimentin (b), độ phóng đại 400X; α-SMA (c), độ phóng đại 1000X; tế bào tiền thân biểu mô từ máu cuống rốn người sau 21 ngày ni cấy (d), độ phóng đại 50X; chứng minh hấp thu ac-LDL (e), độ phóng đại 50X; yếu tố von Willebrand (f), độ phóng đại 100X, cho chế tạo van tim tự thân từ mô sống ( Hoerstrup et al (2002a); Schmidtet al (2004).) 21 Hình 5: Kỹ nghệ mơ van tim chế tạo từ tế bào tủy người II VẬT LIỆU Y SINH TRONG CHẾ TẠO TIM Tái tạo tim từ tế bào iPS giá thể tim chuột  Trước có nghiên cứu sử dụng tế bào gốc phôi chưa biệt hóa trái tim hủy tế bào, nhiên kết nhận chưa có co bóp hoạt động xung điện cấu trúc Trong nghiên cứu này, nhà khoa học tái tạo mô tim người từ giá thể tim chuột hủy tế bào (decellularized whole-heart – DC) dùng tế bào đa tiềm tiền thân tim mạch (multipotential cardiovascular progenitors - MCPs) có nguồn gốc từ tế bào gốc đa cảm ứng (induced pluripotent stem cells iPSCs) Mơ hình hình thành tim cấu trúc tương tự mạch máu, có nhịp đập 40-50nhịp/ph, biểu Ca 2+ nội bào thời (intracellular Ca2+ transients - CaiT) đáp ứng mong đợi loại thuốc khác Vì nghiên cứu thiết lập chiến lược cho kỹ nghệ mô tim người  Hủy tế bào tim chuột đặc tính giá thể  Sử dụng Trypsin số chất tẩy rửa SDS Triton X – 100  Chỉ xử lý tim chuột với acid peracetic nồng độ thấp phút, rửa nhiều lần Điều nhằm giảm thiệt hại đến protein chất ngoại bào (ECM) trì cấu trúc 3D giá thể Kết ta thu giá thể khung tim chuột suốt  Nhuộm xanh tryptan để thấy mạch máu, động mạch nguyên vẹn khung giá thể  Tiến hành thử nghiệm kiểm tra chất lượng khung giá thể 22  Sự hóa biệt tế bào MCPs bào iPSCs người từ tế Hình 4a: Tổng quan trình nghiên cứu Hình 4b: (1) Tim chuột trước hủy tế bào, (2) Sau xử lý với nước khử ion, (3) Sau xử lý với PBS, (4) Sau xử lý với enzyme, (5) Sau xử lý với SDS 1%, (6) Sau xử lý với Triton X-100 3%, (7) Sau xử lý với acid, (8) Sau nhuộm xanh tryptan Hình 4c: Kết phân tích mơ học nhuộm hematoxylin eosin (H&E): Tim chuột chưa xử lý, tế bào, nhân tế bào bắt màu xanh (trên); tim qua xử lý, khơng cịn tế bào (dưới) [Thang màu đen tương ứng kích thước 10μm] Hình 4d: Lượng dsDNA tim chuột chưa xử lý (trái) sau xử lý (phải) Hình 4e: Kết quét hiển vi điện tử (SEM) tâm thất trái (trên) động mạch chủ (dưới) Myofibers – mf (dấu * ngồi bên trái hàng trên) van động mạch chủ (dấu * ô hàng dưới) Tim sau xử lý cịn cấu trúc thành mạch van nguyên vẹn Hình 4f: Kết nhuộm miễn dịch huỳnh quang Tim chuột sau xử lý (phải) thành phần ECM đặc trưng khơng cịn tế bào (khơng thấy nhân bắt màu xanh nhuộm DAPI) [Thang màu trắng tương ứng kích thước 50μm] 23  Giai đoạn 1: Chuyển iPSCs vào mơi trường khơng huyết để biệt hóa thành MCPs Môi trường sử dụng yếu tố tăng trưởng trình hình thành sớm tim mạch để biệt hóa tế bào ES (tế bào gốc phôi)/iPSCs người thành MCPs Thể phôi (EBs) tạo từ tế bào Y1 – iPSCs việc bổ sung protein tái tạo xương (bone morphogenetic protein - BMP4, 1ng ml-1) 24h ( ngày – 1) Xử lý tiếp BMP4 (10ng ml-1), nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (basic fibroblast growth factor – bFGF, 5ng ml -1) ActinvinA (1.5ng ml-1) từ ngày 1-4 Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (vascular endothelial growth factor A - VEGF, 10ng ml -1) dickkopf homologue1 (DKK1, 150ng ml-1) thêm vào từ ngày tới ngày  Giai đoạn 2: EBs sau ngày tách thành tế bào đơn Phân tích nhận biết tế bào phát huỳnh quang cho thấy có khoảng 63% tế bào KDRlow/C-KITneg chứng diện MCPs, từ EBs phân tách Tùy vào nồng độ chất cho (VEGF DKK1) mà lượng tế bào phân ly thành tế bào tim (cardiomyocytes – CMs), tế bào trơn (smooth muscle celld – SMCs), tế bào nội mô (endothelial cells – ECs) khác Vì kiểm sốt biệt hóa thành tế bào nhân tố sinh trưởng  Giai đoạn 3: Xử lý giá thể tim chuột phục hồi với tế bào MCPs nhân tố VEGF (10ng ml-1) DKK1 (150ng ml-1) muốn tái tạo tim, VEGF(20ng ml -1) bFGF(20ng ml-1) để tái tạo cấu trúc màng 24 Hình 5a: Quy trình tái tạo tim từ giá thể tim chuột hủy tế bào, kết hợp với MCPs có nguồn gốc từ iPSCs người Thể phôi (Embryoid bodies – EBs) biệt hóa từ iPSCs ngày thứ sau phân tách thành tế bào đơn (giai đoạn 1) Các tế bào phân tách (khoảng 10 triệu tế bào) kết hợp với giá thề tim chuột xử lý (giai đoạn 2) Các tế bào MCPs in situ biệt hóa thành dịng tế bào tim tái tạo lại mơ tim giá thể Hình 5b: Sự diện cấu trúc tương tự mạch máu (kí hiệu mũi tên) giá thể tim chuột tái tế bào hóa (tim tái tạo) (phải) Thang đo tương ứng 500μm Hình 5c: Kết đo điện tâm đồ 4Hz cấu trúc tim tái tạo Hình 5d: Phát CaiT đồng theo chiều xung điện từ giá thể tim tái tế bào hóa Hình 5e: Tim tái tạo xử lý với paraffin liên kết với nhau, kèm phân tích nhuộm H&E Mũi tên cho thấy hiện khoang mạch máu phân bố tế bào có nguồn gốc từ MCPs dọc theo bề mặt màng tim  Sự tái tạo mô tim từ giá thể tim chuột hủy tế bào 25  Khoảng 10 triệu tế bào đơn phân tách từ EBs cấy vào giá thể ống thông nối với động mạch chủ Để hình thành tế bào tim từ MCPs, nhóm nghiên cứu thực bổ sung định kỳ VEGF(10ng/ml) DKK1(150ng/ml) 8h/lần qua ống thơng  Để tính tốn mức độ trì tế tái tạo, ta thu dịch truyền đếm số lượng tế bào sau lần truyền dịch Sau ngày, tế bào có tương tác định với ECM Ước tính khoảng 10 – 15% tế bào cấy bảo tồn khung giá thể-ECM sau ngày Song song với MCPs từ iPSCs người, tế bào MCPs có nguồn gốc từ tế bào gốc mơ RUES2 thử nghiệm mơ hình khác Kết ta quan sát hình thành cấu trúc tương tự mạch máu hai mơ hình Hai mơ hình biểu hoạt động co thắt sau 20 ngày truyền dịch, với nhịp đập tương đương nhau, khoảng 40 – 50lần/ph  Phân tích điện sinh học cấu trúc tim tái tạo  Đo điện tâm đồ để kiểm tra đặc điểm điện sinh học cấu trúc tim tái tạo (hình 6c) Các tín hiệu điện bất thường thơng qua hình thái sóng cho thấy thiếu hoạt động điều khiển hệ thống dẫn truyền 26  Kiểm tra CMs mô tim tái tạo có kết hợp với dịng điện cách nhuộm cấu trúc tim với chất nhuộm thị Ca 2+ nội bào, Rhod – 2/AM lập đồ chi tiết mức CaiT theo không gian thời gian Phát nhiều vùng truyền sóng thống nhất, cho thấy khả truyền điện CMs giao tiếp tế bào với tế bào (hình 6d) Tuy nhiên sóng CaiT vấp phải vùng mà mơ tách biệt nhau, ngun nhân CMs cách xa nồng độ CMs thấp  Phân tích mơ học  Chứng tỏ ECM tự nhiên giá thể nhân tố tăng trưởng ngoại bào ảnh hưởng đến di chuyển và/hoặc định dòng tế bào tiền thân tim mạch giai đoạn sớm Hình 6a: Vành ngồi tim nhuộm miễn dịch huỳnh quang với CTNT kết hợp với vùng sáng, tạo thành hình ảnh thứ từ trái sang Độ phóng đại cao cho thấy xếp sợi myofibers Hình 6b: Vùng thành tâm thất (ventricular wall – VW) nhuộm miễn dịch huỳnh quang với CTNT SMMHC, marker SMC Hình 6c: Một vùng nhuộm với CD31 – marker bề mặt tế bào nội mô ECs Mũi tên cho ta thấy ECs có nguồn gốc từ MCPs dọc theo bề mặt màng Một số vấn đề đặt  Để tế bào phát triển hướng khơng cần có tác nhân tăng trưởng mà tế bào cảm nhận tác nhân độ cứng va chạm học Dẫn đến trái tim 27 tạo công suất thấp khoảng 2% so với công suất bơm tim chuột trưởng thành  Tính tồn vẹn mạch máu rào cản cấy ghép Bất kì khe hở hệ thống tạo cục máu đông gây nguy hiểm cho quan vật chủ  Để tạo khung sườn cần chất tẩy rửa loại bỏ chất béo, DNA, protein hòa tan đường gần tất vật liệu khác tế bào từ trái tim, để lại lưới hạt collagen, laminins số protein khác yếu tố tăng trưởng cho tế bào Vấn đề đặt dùng lượng tẩy q giữ lại số phân tử dẫn đến từ chối hệ miễn dịch, dùng lượng nhiều số protein quan trọng yếu tố tăng trưởng  Vật liệu ghép vĩnh viễn thường bị bao quanh sợi fibrin có khả gây phản ứng viêm mãn tính miễn dịch thể  Khó khăn cuối phải thay tim vào thể động vật giữ cho tim đập thời gian dài Hướng tiếp cận nhờ tế bào gốc Tạp chí y học quốc tế Lancet vừa đăng nghiên cứu thực nghiệm nhà khoa học Mỹ khẳng định, tế bào gốc chữa lành tổn thương đau tim gây Các mô tim tái tạo từ tế bào gốc phục hồi tăng cường chức bị tổn thương tim, nên liệu pháp điều trị ngăn chặn nguy liệt tim  Với liệu pháp điều trị tế bào gốc này, nhóm bệnh nhân tim chuyển từ nhóm có nguy tử vong cao xuống nhóm có nguy thấp ưu tiên điều trị KẾT LUẬN: Tim quan quan trọng thể Các bệnh tim không ngừng gia tăng mối lo lắng hàng đầu giới ảnh hưởng trực tiếp đến sinh mạng người Các nghiên cứu để tìm vật liệu y sinh giúp chế tạo tim van tim động lực thách thức đối lớn nhà khoa học Nguồn: http://suckhoedoisong.vn/y-te/chinh-phuc-ky-thuat-thay-van-tim-qua-da2012043004198938.htm http://www.heart-valve-surgery.com/heart-surgery-blog/2008/08/29/mechanical-orbioprosthetic-heart-valve-replacements/ http://circres.ahajournals.org/content/97/8/743.full http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22395345 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17353047 http://nhandan.com.vn/suckhoe/tin-tuc/item/12194902-.html http://www.heart-valve-surgery.com/heart-surgery-blog/2008/02/26/facts-about-tissueheart-valve-replacements/ http://www.nature.com/news/tissue-engineering-how-to-build-a-heart-1.13327 28 http://www.vietnamplus.vn/nuoi-cay-te-bao-goc-de-chua-cac-ton-thuong-tim/130176.vnp http://elbiruniblogspotcom.blogspot.com/2013/08/repopulation-of-decellularizedmouse.html http://www.intechopen.com/books/regenerative-medicine-and-tissueengineering/biomaterials-for-cardiac-tissue-engineering http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23910415 http://www.revespcardiol.org/en/cardiac-tissue-engineering-and-the/articulo/90198900/ 29 ... LỤC Mở đầu I Vật liệu y sinh chế tạo van tim Giới thiệu van tim Van sinh học II TAVI((transcatheter aortic valve implantation) Kĩ nghệ mô van tim 4.1 Kĩ nghệ mô van tim tạo dựa vào matrices dị... 4.2 Kĩ nghệ mơ van tim dựa vào matrices từ polyme 4.3 Kĩ nghệ mô van tạo dựa vào matrices lai sinh học/ polymer 4.4 Thảo luận 4.5 Triển vọng tương lai 11 12 Vật liệu y sinh chế tạo tim 22 Kết Luận... cao vấn đề đạo đức (buôn bán nội tạng) I VẬT LIỆU Y SINH TRONG CHẾ TẠO VAN TIM Giới thiệu van tim: Là mỏng, mềm dẽo Quả tim bình thường có bốn buồng tim: nhĩ trái thất trái ngăn cách với van hai