Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương bằng san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH DUY THẢO NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH DUY THẢO NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN Phản biện 2: TS.BS TRƯƠNG TRÍ HỮU Phản biện 3: TS BÙI HỒNG THỦY Phản biện độc lập 1: TS BÙI HỒNG THỦY Phản biện độc lập 2: TS.BS PHAN NGỌC TIẾN NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN CƠNG TOẠI Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi Huỳnh Duy Thảo, nghiên cứu sinh khóa 22/2012 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM, chuyên ngành Sinh lý học Người Động vật, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn khoa học Thầy PGS.TS.BS Trần Cơng Toại Cơng trình nghiên cứu không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu, kết thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi thực nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam đoan Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 10 năm 2017 Người viết cam đoan Huỳnh Duy Thảo LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành luận án này, tơi nhận giúp đỡ chân tình, hiệu nhiều cá nhân, tập thể, Thầy/Cơ, đồng nghiệp, bạn học, gia đình bạn bè Lời cho phép xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới PGS.TS.BS Trần Công Toại, người thầy hướng dẫn khoa học, người tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy/Cơ, Anh, Chị, Em đồng nghiệp Bộ môn Mô - Phôi - Di truyền, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch cho tơi lời khun bổ ích ý kiến quý báu hỗ trợ lớn mặt tinh thần để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy/Cô Bộ môn Sinh lý Động vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tận tình hỗ trợ q báu để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Y Bác sĩ, Khoa Chấn thương Chỉnh hình, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình TP.HCM, nhiệt tình giúp đỡ, tạo thuận lợi để thu thập mẫu nghiên cứu, số liệu bệnh nhân để hoàn thành luận án Xin cảm ơn bạn học khóa 21, 22 thuộc chuyên ngành Sinh lý học Người Động vật hỗ trợ vượt qua khó khăn, thách thức năm tháng học tập mái Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Cuối luận án quà dành tặng cho thành viên gia đình tơi, người ln bên tơi, cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để vượt qua hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tất người! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận án MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ Danh mục đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ NGHỆ MÔ 1.2 NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG 1.2.1 Tế bào gốc trung mô 1.2.2 Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô 1.2.3 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô 1.2.4 Phân lập trì tế bào gốc trung mơ 1.2.5 Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô 1.2.6 Số lượng tế bào gốc trung mô 1.2.7 Biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành ngun bào xương 10 1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 11 1.3.1 Tiềm tạo xương 12 1.3.2 Tiềm biệt hóa thành nguyên bào xương 13 1.3.3 Các marker định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 14 1.3.3.1 CD105 14 1.3.3.2 CD90 14 1.3.3.3 CD73 15 1.3.4 Các marker nguyên bào xương 16 1.3.4.1 Marker tăng trưởng tế bào 17 1.3.4.2 Marker protein chất ngoại bào 17 1.3.4.3 Marker q trình khống hóa chất 18 1.4 GIÁ THỂ 19 1.5 CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC 20 1.6 SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 21 1.6.1 Sử dụng san hô Porites để tạo vật liệu ghép thay xương 22 1.6.1.1 Thành phần cấu tạo san hô Porites 22 1.6.1.2 Cấu trúc độ xốp san hô 23 1.6.1.3 Đặc điểm học 24 1.6.1.4 Đặc tính cảm ứng tạo xương 25 1.6.1.5 Đặc tính kích ứng tạo xương 25 1.6.1.6 Khả tạo xương 26 1.6.1.7 Tính tương hợp sinh học 27 1.6.1.8 Đặc tính thối biến sinh học 27 1.6.1.9 Kiểm sốt chất lượng mảnh ghép san hơ 30 1.6.2 Nguyên tắc xử lý, chế tạo san hô thành vật liệu ghép thay xương 30 1.7 MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 31 1.7.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mơ hình động vật 31 1.7.2 Mơ hình động vật thỏ để đánh giá vật liệu ghép thay xương 33 1.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH LIỀN XƯƠNG 35 1.8.1 Dựa hình ảnh X-Quang 35 1.8.2 Dựa đo độ hấp thu tia X hai nguồn lượng chụp cắt lớp 35 1.8.3 Dựa hình thái mơ xương 36 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38 2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 39 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.3.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô từ thu nhận từ tủy xương người 39 2.3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 39 2.3.1.2 Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 41 2.3.1.3 Đánh giá tính tồn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 45 2.3.2 Tạo mảnh ghép thay xương từ kết hợp tế bào gốc trung mô từ tủy xương người khung san hô 47 2.3.3 Ghép mảnh ghép san hô mang nguyên bào xương trường hợp khuyết xương thỏ 48 2.3.3.1 Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương thỏ 49 2.3.3.2 Biệt hóa tế bào gốc tủy xương thỏ thành nguyên bào xương 50 2.3.3.3 Tạo mảnh ghép từ khung san hô tế bào gốc trung mô 51 2.3.3.4 Ghép mảnh ghép phần thân xương đùi thỏ 51 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53 3.1 PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 53 3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 53 3.1.2 Kết nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 60 3.1.3 Kết định danh tế bào gốc trung mô 66 3.1.4 Định danh nguyên bào xương 73 3.1.5 Đánh giá tính tồn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 81 3.2 TẠO MẢNH GHÉP TỪ SỰ KẾT HỢP CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ KHUNG SAN HÔ 83 3.2.1 Đánh giá tăng trưởng tế bào mảnh ghép 85 3.2.2 Đánh giá đặc điểm cấu trúc mảnh ghép 87 3.2.3 Đánh giá khả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương giá thể san hô 91 3.3 XÂY DỰNG MƠ HÌNH GHÉP ĐOẠN XƯƠNG ĐÙI TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ KHUNG SAN HÔ VÀ NGUYÊN BÀO XƯƠNG TỰ THÂN 93 3.3.1 Phân lập, nuôi cấy nhân khối tế bào tủy xương thỏ 93 3.3.2 Cảm ứng biệt hóa tạo nguyên bào xương từ tế bào gốc tủy xương thỏ 99 3.3.3 Tạo mảnh ghép từ giá thể san hô tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ 101 3.3.4 Quy trình ghép mảnh ghép đoạn xương đùi thỏ 104 3.3.5 Đánh giá kết sau ghép 107 3.3.5.1 Mảnh ghép thời điểm tháng 107 3.3.5.2 Mảnh ghép thời điểm tháng 111 3.3.5.3 Mảnh ghép thời điểm tháng 113 KẾT LUẬN 119 KIẾN NGHỊ 120 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC NGHIÊN CỨU DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT ADSCs Adipose-Derived Stem Cells Tế bào gốc từ mô mỡ ALP Alkaline Phosphatase Enzyme Alkaline Phosphatase BMSC Bone Marrow Stem Cell Tế bào gốc tủy xương BTE Bone Tissue Engineering Công nghệ mô xương CFU-Fs Colony Forming Units - Fibroblasts Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi Cộng CS FBS Fetal Bovine Serum Huyết thai bò H&E Hematoxylin&Eosin Nhuộm Hematoxylin Eosin HA Hydroxyapatite Hydroxyapatite ISCT International Society for Cellular Hội liệu pháp Tế bào Quốc tế Therapy Kính hiển vi KHV MSC Mesenchymal Stem Cell Tế bào gốc trung mô NBF Neutral Buffered Formalin Dung dịch formalin đệm trung tính Nhiễm sắc thể NST OB Osteoblast Nguyên bào xương OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphate SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét Tế bào gốc TBG UCMSCs Umbilical Cord MSCs Tế bào gốc trung mô cuống rốn vQCT volumetric Quantitative Computed Chụp cắt lớp định lượng thể Tomography tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số yếu tố tăng trưởng sử dụng phổ biến kỹ nghệ mô xương 20 Bảng 1.2 Đặc trưng rỗng san hô Porites lutea 23 Bảng 3.3 Kết phân lập tế bào gốc tủy xương số CFU-Fs 53 Bảng 3.4 So sánh mật độ tế bào đơn nhân thu nhận từ tủy xương người 56 Bảng 3.5 So sánh số CFU-Fs thu nhận từ tủy xương người 58 Bảng 3.6 Mật độ tế bào đếm lần cấy chuyền thứ ba 63 Bảng 3.7 Khung CD Panel kết phân tích Flow Cytometry 68 Bảng 3.8 Giá trị đo mật độ quang hai nhóm mẫu tế bào gốc trung mô nguyên bào xương 86 Bảng 3.9 Tóm tắt số đặc điểm thỏ trình nghiên cứu 94 Bảng 3.10 Một số đặc điểm tương đồng tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thỏ 97 Bảng 3.11 Mật độ tế bào từ tủy xương thỏ lần cấy chuyền thứ ba 98 Bảng 3.12 Thỏ bị hủy ghép 105 Sau tế bào bám dính ổn định khung nâng đỡ, bắt đầu bổ sung môi trường nuôi điều kiện ni cấy thích hợp Mảnh ghép tạo thành đánh giá dựa vào số tiêu chuẩn đánh giá cấu trúc mảnh ghép mô học, khảo sát đặc điểm bề mặt mảnh ghép SEM đánh giá khả tăng sinh tế bào khung Biện pháp phịng ngừa an tồn Xử lý tất thành phần thí nghiệm tủy xương, hóa chất xem vật liệu truyền nhiễm gây độc Đeo trang, mang găng găng vơ trùng q trình vận chuyển thao tác xử lý mẫu Xử lý mẫu thủ tao tác đạt tiêu chuẩn cho yêu cầu nuôi cấy tế bào người động vật Thiết bị vật liệu 6.1 Thiết bị  Tủ lạnh -200C (Sanyo)  Tủ lạnh -800C (Sanyo)  Nồi hấp khử trùng (Nuaire)  Tủ lạnh Sanyo SR 4170  Tủ lạnh Sanyo SR 4170  Máy quay ly tâm lạnh, Universal 320R, Hettich  Tủ ủ ấm CO2, Heraeus  Máy đo pH  DTX 880 (Beckman Coulter) 6.2 Vật liệu  Tube quay ly tâm 15 ml, 50 ml (Corning)  Flask 25cm2 (Corning)  Đĩa nuôi tế bào (6 wells)  Cell Strainer 70µl  Pasteur pipette (Wheaton)  Găng (MERUFA)  Găng vô trùng (MERUFA)  Bơm tiêm (Vinahankook)  Đĩa petri  Màng lọc 0.2um  Becher 50, 100, 250ml  Ependorff  Đầu type 1000 µl  Đầu type 100µl  Pipetman 10 - 1000µL (Gilson, The Netherlands)  Bình định mức (100ml, 250ml, 500ml)  Màng lọc 0.2um  Buồng đếm Naubauer cải tiến 6.3 Hóa chất  PBS (Gibco)  DMEM/F12 (Gibco)  FBS (Gibco)  Pen/strep 10X (Gibco)  Trypsin 2,5% (Gibco)  Dexamethasone (Gibco)  Ascorbic acid (Sigma)  Beta-glycerol phosphate powder (Sigma)  Vitamin D2 (Sigma)  FGF-9 (Gibco)  Fast Red violet LB salt (Sigma)  Naphthol AS-MX phosphate disodium salt (Sigma)  Ethanol (Merck)  Formalin  Ethanol (Merck)  Nước cất Mẫu nghiên cứu  Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương theo quy trình thu nhận thiết lập theo tiêu chuẩn ISCT [1],[2],[3],[4],[5],[7],[8]  Khung san hơ (lồi Porites lutea) xử lý chế tạo theo tiêu chuẩn vật liệu ghép Phịng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch [12] Quy trình tạo mảnh ghép từ tế bào gốc trung mô khung san hô [6],[9],[11]  Tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba sử dụng để chuyển lên mảnh san hô để tạo mảnh ghép xương  Tế bào tách rời khỏi chai nuôi dung dịch Trypsin-EDTA  Cặn tế bào sau thu nhận cho vào tube sạch, vô trùng Bổ sung ml môi trường nuôi, dịch huyền phù tế bào chuyển lên khối san hơ (kích thước mẫu san hô 0,5x0,5x0,5 cm) với mật độ tế bào khoảng 105 tế bào/ml cách cho mẫu san hô vào tube có sẵn tế bào  Huyền phù quay ly tâm tốc độ 1000 vòng/phút vòng phút Lập lại bước lần  Lấy mẫu san hô cho vào chai nuôi, bổ sung môi trường nuôi Mảnh san hô có mang tế bào ni tủ ấm 370C, 5%CO2  Sau ngày nuôi cấy, tiến hành biệt hóa theo quy trình cảm ứng biệt hóa tạo thành nguyên bào xương  Quan sát theo dõi q trình ni cấy kính hiển vi đảo ngược, thay mơi trường biệt hóa tạo ngun bào xương ngày/1lần Đánh giá kết quả: Mảnh ghép thay xương phải mang tế bào gốc trung mơ, tế bào tăng trưởng phát triển tốt mảnh ghép, biệt hóa thành nguyên bào xương trực tiếp khung san hô để tham gia tạo mảnh ghép thay xương Để đánh giá mảnh ghép thay xương đạt tiêu chí cần phải đánh giá số đặc điểm sau: + Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát bề mặt khối san hô khả bám dính phát triển tế bào mảnh ghép + Mảnh ghép nhuộm mô học (H&E) hóa mơ miễn dịch huỳnh quang: để đánh giá khả bám dính, tăng trưởng phát triển tế bào bên khối san hô + Mảnh ghép nhuộm với thuốc nhuộm Fast Red Violet LB salt để đánh giá hoạt động enzyme alkaline phosphatase (một marker thị cho nguyên bào xương) nhằm định danh nguyên bào xương + Thiết lập đường cong tăng trưởng tế bào khối san hô để đánh giá khả tăng trưởng tế bào mảnh ghép (theo phân tích MTT Assays) Phương pháp phân tích MTT Assay dựa hoạt động enzyme dehydrogenase ty thể tế bào sống Sau ủ tế bào với dung dịch MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) với nồng độ 0,5 mg/ml sau bổ sung dung dịch isopropanol:HCl (1:1) Kết hình thành tinh thể formazan, tinh thể đánh giá phương pháp đo mật độ quang OD bước sóng 546 nm, kết đo phản ánh số lượng tế bào sống đĩa nuôi cấy 10 Tài liệu tham khảo Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG (2001), Bone marrow stromal stem cells: Nature, biology, and potential applications, Stem Cells, 19:180–92 Boxall SA, Jones E (2012), Markers for characterization of bone marrow multipotential stromal cells, Stem Cells International, 975871,1-12 Conget, P A & Minguell, J J (1999), Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells, Journal of Cellular Physiology, 1181: 67-73 Dominici, M, Le Blanc, K, Mueller, I, Slaper-Cortenbach, I, Marini, F, Krause, D, Deans, R, Keating, A, Prockop, D, and Horwitz, E (2006), Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells, The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy, 8(4):315–317 Fennema EM, Auke J S Renard, Anouk Leusink, Clemens A van Blitterswijk, Jan de Boer (2009), The effect of bone marrow aspiration strategy on the yield and quality of human mesenchymal stem cells, Acta Orthopaedica, 80(5): 618–621 6 Gravel M, Gross T, Vago R, Tabrizian M (2006), Responses of mesenchymal stem cell to chitosan-coralline composites microstructured using coralline as gas forming agent, Biomaterials, 27:1899–1906 Huang, Shuo; Xu, Liangliang; Sun, Yuxin; Wu, Tianyi; Wang, Kuixing; Li, Gang (2015), An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Journal of Orthopaedic Translation, 3(1):26-33 Hye Jin Jin, Yun Kyung Bae, Miyeon Kim, Soon-Jae Kwon, Hong Bae Jeon, Soo Jin Choi, Seong Who Kim, Yoon Sun Yang, Wonil Oh and Jong Wook Chang (2013), Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, International Journal of Molecular Sciences, 14:17986-18001 Major A.K, Boehm C.A, Nitto H, Midura R.J, Muschler G.F (1997), Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation, Orthopaedic Research, 15(4), 546-557 10 Mora F, Ouhayoun JP (1995) Clinical evaluation of natural coral and porous hydroxyapatite implants in periodontal bone lesions, results of one year follow-up, J Clin Periodontal, 22(11):877-884 11 Tran Cong Toai, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Huynh Minh Tuan and Luis Filgueira, et al (2011), Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells, Cell and Tissue Banking, 12:247261 12 Trương Đình Kiệt, Trần Công Toại (2003), Nghiên cứu sử dụng san hô vùng biển Việt Nam làm vật liệu sinh học thay xương y học, Báo cáo tổng kết đề tài NCKH, Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM XÂY DỰNG MƠ HÌNH ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM KHUYẾT HỔNG XƯƠNG TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ GIÁ THỂ SAN HÔ VÀ TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Mục tiêu 2 Phương pháp Định nghĩa số thuật ngữ Nguyên tắc Biện pháp phòng ngừa an toàn Thiết bị vật liệu Mẫu nghiên cứu Quy trình thực Đánh giá kết 10 Tài liệu tham khảo XÂY DỰNG MƠ HÌNH ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM KHUYẾT HỔNG XƯƠNG TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ KHUNG SAN HÔ VÀ TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Mục tiêu Quy trình thiết kế theo quy trình thực chuẩn (Standard Operation Procedure – SOP), mô tả phương pháp xây dựng mô hình điều trị thực nghiệm khuyết hổng xương thỏ mảnh ghép thay xương từ kết hợp tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương khung san hơ (lồi Porites lutea) Phương pháp Để xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm khuyết hổng xương thỏ cần phải có tế bào gốc trung mô từ tủy xương thỏ để kết hợp khung san hô tạo mảnh ghép thay xương thực ghép mảnh ghép vào vùng khuyết xương thân xương đùi thỏ Phương pháp thực thực nghiệm – mơ tả Mơ tả lại quy trình thực điều trị khuyết hổng xương mảnh ghép công nghệ để chuẩn hóa mơ hình điều trị khuyết xương động vật Định nghĩa số thuật ngữ MSC: Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell) TBG: Tế bào gốc Nguyên tắc Đối với mô hình này, tiến hành thu nhận tủy xương thỏ, sau tiến hành ni cấy định danh TBG trung mô Tiếp theo tạo mảnh ghép kết hợp khung san hô TBG trung mô Mảnh ghép sau ghép vào thân xương đùi thỏ Do đó, mơ hình xây dựng dựa quy trình nghiên cứu: Thứ nhất, quy trình phân lập, ni cấy định danh TBG trung mơ từ tủy xương thỏ, nhằm mục đích thu nhận nguồn tế bào ghép tự thân để tạo mảnh ghép thay xương Thứ hai, quy trình tạo mảnh ghép từ kết hợp TBG trung mô khung san hơ, nhằm mục đích tạo mảnh ghép thay xương kỹ nghệ mô để ứng dụng việc tái tạo khuyết hỗng xương thỏ Thứ ba, quy trình ghép mảnh ghép thay xương có mang tế bào tạo xương (nguyên bào xương) tự thân vùng xương đùi thỏ, nhằm đánh giá hiệu tiềm mảnh ghép lĩnh vực tái tạo khuyết hổng xương Đây giai đoạn nghiên cứu bỏ qua theo tiêu chuẩn nước quốc tế mảnh ghép tiến hành thực nghiệm người phải thực nghiên cứu, đánh giá hiệu mơ hình động vật trước triển khai thực lâm sàng Biện pháp phịng ngừa an tồn Xử lý tất thành phần thí nghiệm tủy xương, hóa chất xem vật liệu truyền nhiễm gây độc Đeo trang, mang găng găng vơ trùng q trình vận chuyển thao tác xử lý mẫu Xử lý mẫu thủ tao tác đạt tiêu chuẩn cho yêu cầu nuôi cấy tế bào người động vật Thiết bị vật liệu 6.1 Thiết bị  Tủ lạnh -200C (Sanyo)  Tủ lạnh -800C (Sanyo)  Nồi hấp khử trùng (Nuaire)  Tủ lạnh Sanyo SR 4170  Tủ lạnh Sanyo SR 4170  Máy quay ly tâm lạnh, Universal 320R, Hettich  Tủ ủ ấm CO2, Heraeus  Máy đo pH  DTX 880 (Beckman Coulter)  Hệ thống thao tác phẫu thuật động vật  Hệ thống chuồng trại chăm sóc động vật sau phẫu thuật 6.2 Vật liệu  Tube quay ly tâm 15 ml, 50 ml (Corning)  Flask 25cm2 (Corning)  Đĩa nuôi tế bào (6 wells)  Pasteur pipette (Wheaton)  Găng (MERUFA)  Găng vô trùng (MERUFA)  Bơm tiêm (Vinahankook)  Đĩa petri  Màng lọc 0.2um  Becher 50, 100, 250ml  Ependorff  Đầu type 1000 µl  Đầu type 100µl  Pipetman 10 - 1000µL (Gilson, The Netherlands)  Bình định mức (100ml, 250ml, 500ml)  Màng lọc 0.2um  Buồng đếm Naubauer cải tiến  Kéo cong, kéo thẳng  Nẹp tách  Nẹp, vít phẫu thuật  Cưa phẫu thuật xương  Dao mổ phẫu thuật  Chỉ khâu phẫu thuật 6.3 Hóa chất  PBS (Gibco)  DMEM/F12 (Gibco)  FBS (Gibco)  Pen/strep 10X (Gibco)  Trypsin 2,5% (Gibco)  Dexamethasone (Gibco)  Ascorbic acid (Sigma)  Beta-glycerol phosphate powder (Sigma)  Vitamin D2 (Sigma)  FGF-9 (Gibco)  Fast Red violet LB salt (Sigma)  Naphthol AS-MX phosphate disodium salt (Sigma)  Ethanol (Merck)  Formalin  Ethanol (Merck)  Nước cất  Betadine  Gentamicine Mẫu nghiên cứu  Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương theo quy trình thu nhận thiết lập theo tiêu chuẩn ISCT [2],[3],[4],[5],[7],[8]  Khung san hơ (lồi Porites lutea) xử lý chế tạo theo tiêu chuẩn vật liệu ghép Phịng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch [15]  Thỏ nâu: + Được cung cấp từ trang trại, thỏ chọn thỏ đực + Thỏ chọn thỏ khỏe mạnh, trọng lượng trung bình từ 2,00 – 2,5 kg + Tuổi thỏ chọn khoảng tháng tuổi Xây dựng mơ hình điều trị khuyết hổng xương thỏ mảnh ghép từ khung san hô tế bào gốc trung mô từ tủy xương thỏ 8.1 Phân lập, nuôi cấy định danh TBG trung mô từ tủy xương thỏ [12],[17]  Thu nhận khoảng - ml tủy xương thỏ tube chứa sẵn 300µl heparin để chống đông Tế bào thu nhận phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với dung dịch Ficoll-Paque (Amersham, Germany) Đếm mật độ tế bào thuốc nhuộm Trypan Blue buồng đếm Neubauer  Tiến hành nuôi tế bào mật độ khoảng 105 - 106 tế bào/ml môi trường gồm DMEM/F12 (Gibco), 10% FBS, kháng sinh (Pen-Strep)  Tế bào nuôi tủ ấm 370C, 5%CO2 Rửa tế bào bám dính với dung dịch PBS thay môi trường nuôi - ngày  Các tế bào bám dính có dạng hình thoi, diện dạng tế bào riêng lẻ ngày thứ - quan sát kính hiển vi đảo ngược Trong vòng - ngày, tế bào tăng sinh đạt 65 - 70% diện tích chai ni vịng tuần  Sau tuần ni sơ cấp, rửa tế bào với dung dịch PBS ủ tế bào với trypsin-EDTA (0,25% - 0,02%) khoảng phút tủ ủ ấm Trung hịa enzyme với mơi trường ni thu tế bào để quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút phút  Thu phần cặn lắng huyền phù tế bào với môi trường nuôi mới, chuyển tế bào lên chai ni mới, quan sát theo dõi bám dính tăng trưởng tế bào kính hiển vi đảo ngược  Thay môi trường nuôi ngày Thông thường, tế bào đạt mật độ cấy chuyền vịng ngày ni cấy Đánh giá kết quả: Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ đánh giá theo tiêu chí ISCT dựa vào đặc điểm bám dính, khả biểu marker bề mặt tiềm biệt hóa in vitro 8.2 Tạo mảnh ghép thay xương từ kết hợp TBG trung mô từ tủy xương thỏ khung san hô Porites lutea  Tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba sử dụng để chuyển lên mảnh san hô để tạo mảnh ghép xương  Tế bào tách rời khỏi chai nuôi dung dịch Trypsin-EDTA  Cặn tế bào sau thu nhận cho vào tube sạch, vô trùng Bổ sung ml môi trường nuôi, dịch huyền phù tế bào chuyển lên khối san hô với mật độ tế bào 105 tế bào/ml, cho mẫu san hô vào tube (kích thước mẫu 0,5×0,5×0,5 cm)  Huyền phù quay ly tâm tốc độ 1000 vòng/phút vòng phút Lập lại bước lần  Lấy mẫu san hô cho vào chai nuôi, bổ sung mơi trường ni Mảnh san hơ có mang tế bào nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2  Sau ngày nuôi, tiến hành cảm ứng biệt hóa tạo thành nguyên bào xương  Quan sát theo dõi q trình ni cấy kính hiển vi đảo ngược, thay mơi trường biệt hóa tạo nguyên bào xương ngày/1lần Đánh giá kết quả:  Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát bề mặt khối san hô khả bám dính phát triển tế bào mảnh ghép  Mảnh ghép nhuộm mô học (H&E) Giemsa: để đánh giá khả tế bào bám dính, tăng trưởng phát triển bên khối san hô  Mảnh ghép nhuộm với thuốc nhuộm Fast Red Violet LB salt để đánh giá hoạt động enzyme alkaline phosphatase 8.3 Ghép mảnh ghép thay xương kỹ nghệ có mang nguyên bào xương tự thân vùng thân xương đùi mơ hình thỏ [1],[4],[14]  Chọn thỏ đực khoảng tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuôi điều kiện dinh dưỡng chăm sóc  Tiến hành lấy tủy xương thỏ cách chọc hút khoảng 0,5 ml tủy xương, chuyển phịng thí nghiệm thực theo quy trình thu nhận chuẩn hóa để nhân khối sau tạo mảnh ghép  Thực lơ thí nghiệm song song nhau, lơ thí nghiệm ghép mảnh san hơ khơng có mang tế bào lơ thí nghiệm ghép san hơ có mang ngun bào xương tự thân Lơ thí nghiệm ghép san hơ xem lơ thí nghiệm đối chứng  Tiến hành ghép mảnh ghép mô xương thỏ, thỏ gây mê Ketamin liều 10 – 15 mg/kg thể trọng, sau cắt bỏ lơng sát trùng Betadine vùng phẫu thuật  Sử dụng dao mổ phẫu thuật để bọc lộ phần bám xương Bộc lộ phần thân xương đùi  Loại bỏ phần thân xương đùi có kích thước tương đương với khối san hơ cần ghép (khối san hơ có kích thước 0,5x0,5x0,5 cm) Chèn khối san hơ có khơng có mang nguyên bào xương vào phần thân xương bị lấy đi, cố định mảnh ghép nẹp, ốc phẫu thuật  Sau dùng phẫu thuật khâu phần mơ để cố định mẫu san hô ghép khâu lại vết mổ  Sát trùng lại vết mổ Betadine chích kháng sinh Gentamicin với liều lượng mg/kg thể trọng liên tục vòng ngày để chống nhiễm trùng vết mổ  Các thỏ ghép chăm sóc ni dưỡng với chế độ dinh dưỡng suốt trình nghiên cứu  Mỗi giai đoạn 1, tháng tiến hành chụp ảnh X-Quang thu nhận mảnh ghép để làm mô học (nhuộm H&E) nhằm đánh giá kết mọc mảnh ghép Đánh giá kết quả: Mảnh ghép thay xương phải mang tế bào gốc trung mô, tế bào tăng trưởng phát triển tốt mảnh ghép, biệt hóa thành nguyên bào xương trực tiếp khung san hô để tham gia tạo mảnh ghép thay xương Quy trình phẫu thuật ghép mảnh ghép vào phần thân xương đùi thỏ phải đảm bảo vô trùng, kỹ thuật, mảnh ghép cố định tốt Thỏ chăm sóc tốt giống hai nhóm nghiên cứu Thỏ nuôi đánh giá thời gian nghiên cứu mốc thời gian 1, tháng Tại mốc cần phải thực chụp phim X-quang thu nhận sinh thiết mẫu ghép để làm mô học đánh giá tiến trình tái tạo xương mảnh ghép 10 Tài liệu tham khảo A Piattelli, G Podda, A Scarano (1997), Clinical and histological results in alveolar ridge enlargement using coralline calcium carbonate, Biomaterials, 18(8):623-627 Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG (2001), Bone marrow stromal stem cells: Nature, biology, and potential applications, Stem Cells, 19:180–92 Boxall SA, Jones E (2012), Markers for characterization of bone marrow multipotential stromal cells, Stem Cells International, 975871,1-12 Castaneda S, Largo R, Calvo E, Rodriguez-Salvanes F, Marcos ME, Diaz-Curiel M, Herrero-Beaumont G (2006), Bone mineral measurements of subchondral and trabecular bone in healthy and osteoporotic rabbits, Skeletal Radiol, 35:34-41 Conget, P A & Minguell, J J (1999), Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells, Journal of Cellular Physiology, 1181: 67-73 Dominici, M, Le Blanc, K, Mueller, I, Slaper-Cortenbach, I, Marini, F, Krause, D, Deans, R, Keating, A, Prockop, D, and Horwitz, E (2006), Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells, The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy, 8(4):315–317 Fennema EM, Auke J S Renard, Anouk Leusink, Clemens A van Blitterswijk, Jan de Boer (2009), The effect of bone marrow aspiration strategy on the yield and quality of human mesenchymal stem cells, Acta Orthopaedica, 80(5): 618–621 Gravel M, Gross T, Vago R, Tabrizian M (2006), Responses of mesenchymal stem cell to chitosan-coralline composites microstructured using coralline as gas forming agent, Biomaterials, 27:1899–1906 Huang, Shuo; Xu, Liangliang; Sun, Yuxin; Wu, Tianyi; Wang, Kuixing; Li, Gang (2015), An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Journal of Orthopaedic Translation, 3(1):26-33 10 Hye Jin Jin, Yun Kyung Bae, Miyeon Kim, Soon-Jae Kwon, Hong Bae Jeon, Soo Jin Choi, Seong Who Kim, Yoon Sun Yang, Wonil Oh and Jong Wook Chang (2013), Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, International Journal of Molecular Sciences, 14:17986-18001 11 Major A.K, Boehm C.A, Nitto H, Midura R.J, Muschler G.F (1997), Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation, Orthopaedic Research, 15(4), 546-557 12 Masoud Soleimani, Samad Nadri (2009), A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Nature Protocols, 4(1):102-106 13 Mora F, Ouhayoun JP (1995) Clinical evaluation of natural coral and porous hydroxyapatite implants in periodontal bone lesions, results of one year follow-up, J Clin Periodontal, 22(11):877-884 14 Newman et al, 199 Newman E, Turner AS, Wark JD (1995), The potential of sheep for the study of osteopenia: current status and comparison with other animal models, Bone, 16:277S-284S 15 Tran Cong Toai, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Huynh Minh Tuan and Luis Filgueira, et al (2011), Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells, Cell and Tissue Banking, 12:247261 16 Trương Đình Kiệt, Trần Công Toại (2003), Nghiên cứu sử dụng san hô vùng biển Việt Nam làm vật liệu sinh học thay xương y học, Báo cáo tổng kết đề tài NCKH, Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM 17 Wei L, Lei GH, Yi HW, Sheng Py (2014), Bone formation in rabbit's leg muscle after autologous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing human bone morphogenic protein-2 Indian Journal of Orthopaedics, 48:347-53 10 ... điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân? ?? Mục đích nghiên cứu luận án sử dụng san hô làm khung xương để mang tế bào gốc tự thân thu nhận từ tủy xương. .. kết hợp khung san hô tế bào gốc trung mô từ tủy xương người Xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm khuyết hổng xương thỏ mảnh ghép từ khung san hô tế bào gốc tự thân từ tủy xương thỏ Chương TỔNG... GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH DUY THẢO NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI