Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (d-loop) hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre .pdf

Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (d-loop) hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre .pdf

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -0o0 -

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -0o0 -

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nông Văn Hải

Thái Nguyên - 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nông Văn Hải đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Đăng Tôn, KS Vũ Hải Chi, CN Địch Thị Kim Hương và tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Đề tài được hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhánh thuộc đề tài "Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội" do PGS TS Lê Thị Thuý, Viện Chăn

nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ nhiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU……… 01

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… ……… 04

1.1 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ 04

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU…… 06

1.3.1.3 Cơ chế di truyền của mtDNA………… ………….……….….… 13

1.3.2 Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền ……… ……… 14

1.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM……… ……… …… 16

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới……….… 16

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam……… 20

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Thiết bị 22

2.1.3 Hoá chất 23

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu……….…… 23

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ……….…… 24

2.2.1 Điện di trên gel agarose………… ……….…… 24

2.2.2 Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)……… …… … ……… … 26

2.2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR…… ……….………… ……….… 28

2.2.4 Giải trình tự vùng D-loop……….….……… 29

2.2.5 Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.……….……… 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN… ……….……… 31

3.1 Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR…… ……… 31

3.2 Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank…… ……… …….… 36

3.3 Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà… …….…… 56

3.4 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu … 56

3.5 So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á……… ……… … 58

3.6 Xây dựng cây phát sinh chủng loại…… ……… ….……… 60

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO…… …… ……… ……… 65

TAE Tris – acetate – EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Thành phần phản ứng khuếch đại DNA………….…… … 34 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR……… 35

Bảng 3.3 Các điểm đa hình trong vùng D-loop của 3 giống gà

nghiên cứu 51 Bảng 3.4 Sự phân bố của 71 mẫu gà nghiên cứu theo các kiểu đơn

Bảng 3.5 Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu….…… 58 Bảng 3.6 So sánh mức độ đa dạng di truyền của gà Việt Nam với một

số quần thể gà châu Á 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc của ty thể 09 Hình 1.2 Sơ đồ mtDNA gà……….…… 12 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên

MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề

Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là giống vật nuôi phổ biến nhất trên

thế giới Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Thế giới (FAO), số lượng gà trên toàn cầu năm 2007 ước tính đạt khoảng 17 tỉ con, hơn một nửa trong số đó là ở châu Á Đây là một trong những nguồn thực phẩm thiết yếu của con người, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, cung cấp gần như toàn bộ nhu cầu về thịt và trứng cho những vùng nông thôn hẻo lánh và khoảng 20% nhu cầu cho khu vực đô thị [31] Ngoài mục đích làm thực phẩm, gà nhà còn được nuôi làm cảnh, chọi gà hay làm thuốc Không những thế, gà còn là đối tượng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh [29], [59]

Trong ngành nông nghiệp nước ta, chăn nuôi gà chiếm tới 72 - 73% tổng đàn gia cầm hàng năm Năm 2006, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã xây dựng chiến lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 - 2015 Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32% tổng sản lượng thịt các loại, trong đó sản lượng thịt gà chiếm 88% tổng đàn gia cầm, đạt 350 triệu con, khối lượng thịt 1.992.000 tấn, sản lượng trứng 9,236 tỷ quả [3]

Để đạt được mục tiêu trên thì cần thiết phải cải thiện nguồn con giống, đồng thời phải bảo tồn và phát triển những giống gia cầm quý của địa phương Ở nước ta có 27 giống gà, trong đó có tới 16 giống gà nội Các giống gà nội như gà Ri, gà Đông Tảo, gà H’Mông, gà Tre là các giống có phẩm chất thịt trứng thơm ngon, khả năng chịu đựng kham khổ, khả năng chống chịu bệnh tật cao, là nguồn gen quý và cần được đầu tư chọn tạo để nâng cao năng suất và dùng lai tạo với các giống khác để cải tiến năng suất, tạo con lai năng suất cao cung cấp con giống cho sản xuất [2], [3], [11]

Tuy nhiên, do truyền thống chăn nuôi nhỏ lẻ theo hộ gia đình, các giống gà này thường được chăn thả tự do cùng với các giống gà nội khác ở các địa

phương, cùng với sự du nhập của vật liệu di truyền mới do việc nhập khẩu một cách ồ ạt các giống nhập ngoại nên chúng đứng trước nguy cơ bị lai tạp, mất dần Do đó, vấn đề bảo tồn nguồn gen các giống gia cầm quý là một yêu cầu bức thiết của thực tế Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống vật nuôi là bước đầu tiên trong quy trình tiến tới mục tiêu bảo tồn, cải tiến và sử dụng nguồn giống

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã được tiến hành ở cấp độ DNA - vật chất di truyền của sự sống Cũng như các loài động vật có xương sống khác, hệ gen của gà cũng gồm hệ gen nhân và hệ gen ty thể (mtDNA) Do kích thước của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tượng nghiên cứu đa dạng di truyền có một số nhược điểm Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại được di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn Bởi vậy, DNA ty thể với những lợi thế của mình như tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lượng bản sao lớn và khá đồng nhất đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và phát sinh chủng loại [15], [30], [50], [57]

Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại được gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không được dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài [25]

Do đó, xác định và so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng D-loop là phương pháp có độ tin cậy cao được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di

truyền quần thể [30], [34], [36], [49] Kể từ khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà được Desjardins và Morais (1990) công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự được đăng ký trên GenBank Trình tự hệ gen ty thể đã được sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới [27], [41], [46], [52] Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà.

Ở Việt Nam, việc giải mã hệ gen ty thể nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các giống gà vẫn còn là vấn đề mới Các nghiên cứu về hệ gen ty thể nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, mang tính cá thể và không đặc trưng cho quần thể Với mục đích góp phần vào việc giải mã hệ gen ty thể của các giống gà địa phương Việt Nam và nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống gà, trên cơ sở phân tích trình tự vùng điều

khiển (D-loop), chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với mục tiêu chính như sau:

Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre trên cơ sở phân tích trình tự vùng D-loop của 71 mẫu cá thể

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài bao gồm các nội dung chính như sau:

- Khuếch đại vùng D-loop của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ

Trong hệ thống phân loại, chi Gallus gồm 4 loài gà rừng khác nhau: 1 Gà rừng đỏ G gallus (Red junglefowl - RJF) thường gặp ở Đông Dương, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài nước khác 2 G lafayetti (Lafayette's JF) ở

vùng Sri Lanka, loài này còn có tên gọi là gà rừng Ceylon (Cyelon junglefowl

- CJF) 3 Gà rừng màu xanh G varius (Green junglefowl - GrJF) phổ biến ở vùng Java nên còn gọi là gà rừng Java 4 G sonneratii (Grey junglefowl - GJF), còn gọi là gà rừng màu xám, thường gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ

Trong 4 loài trên thì phổ biến nhất là loài gà rừng đỏ G gallus (RJF) Hiện nay, loài này gồm 5 phân loài: G g gallus (Southeast Asian Red junglefowl - SE Asian RJF), G g spadiceus, G g bankiva, G g murghi (Indian RJF) và G g jabuoillei [49] Sự phân loại này chủ yếu dựa trên các

đặc điểm kiểu hình và khu vực phân bố địa lí của các quần thể Ở Việt Nam có ba phân loài của gà rừng đỏ với số lượng còn tương đối nhiều: G gallus gallus (1), G gallus jabouibi (2), G gallus spadiceus (3) Phân loài 1: phân

bố từ phía nam tỉnh Hà Tĩnh vào đến Nam Bộ Phân loài 2: phân bố ở vùng Đông Bắc nước ta Phân loài 3: phân bố ở vùng Tây Bắc nước ta [8], [10]

Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau:

Giới Động vật (Animalia)

Ngành Động vật có xương sống (Chordata) Lớp Chim (Aves)

Bộ Gà (Galiformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus

Loài Gallus gallus

Phân loài Gallus gallus domesticus

Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và được nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi chưa được thống nhất và vẫn đang được tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên

Thuyết đơn nguyên cho rằng tổ tiên của tất cả các loại gia cầm là phân

loài Gallus gallus gallus của gà rừng đỏ sống ở Đông Nam Á (SE Asian RJF)

[26], [27] Trong khi nhiều tác giả lại đưa ra bằng chứng chứng tỏ rằng gà nhà có nhiều tổ tiên khác nhau theo dòng mẹ, có tới 3 phân loài của gà rừng đỏ có

thể là tổ tiên trực tiếp của gà nhà gồm G g gallus, G g murghi và G g spadiceus Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ giả

thuyết này [34], [42], [43], [50]

Boruxenco (1953) và Valilop (1993) cho rằng Nam Á, Ấn Độ, Đông Dương… là một trong những trung tâm châu Á đầu tiên thuần dưỡng nhiều loài vật nuôi trong đó có gà nhà [5] Từ các khu vực rừng nhiệt đới Đông

Nam Á và Ấn Độ, gà rừng đỏ Gallus gallus đã lan rộng ra các vùng khác trên

thế giới khi con người thuần hóa chúng, kết quả là tạo ra nhiều giống gà khác nhau [61] Tiếp theo quá trình thuần hóa là các chương trình chọn giống rộng rãi đã tạo ra 4 dòng gà khác biệt: lấy trứng, lấy thịt, làm cảnh và chọi gà

Trước đây, Ấn Độ được coi là trung tâm của quá trình thuần hóa gà nhà Quá trình này diễn ra tại các vùng thung lũng Ấn Độ vào khoảng năm 3200 trước Công nguyên Tuy nhiên những bằng chứng địa chất gần đây đã chỉ ra rằng quá trình này diễn ra sớm hơn rất nhiều ở đại lục Trung Quốc vào khoảng năm 6000 trước Công nguyên [27], [36]

Gà được đưa sang châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII - XIX và nhờ tiến bộ của công tác chọn giống, các giống gà bản địa của châu Á đã được lai tạo thành những giống cho năng suất cao hơn

Trước đây, phần lớn các tác giả đều cho rằng gà được đưa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên Một giả thuyết khác cho rằng gà được đưa trực tiếp từ

lục địa hoặc các đảo ở Đông Nam Á vào Nam Mỹ từ khoảng 3300 năm trước, tuy nhiên không có bằng chứng địa chất nào làm sáng tỏ giả thuyết trên Những nghiên cứu gần đây liên quan tới việc phân tích trình tự mtDNA gà từ các mẫu vật thời tiền sử đã góp phần làm sáng tỏ giả thuyết thứ ba cho rằng gà được đưa vào Nam Mỹ từ quần đảo Polynesia [62], điều đó cũng cho thấy vai trò vô cùng quan trọng của trình tự vùng D-loop ty thể trong việc xác định lịch sử thuần hóa của gà nhà [34]

Ở Việt Nam, gà rừng được thuần hóa và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của giống gà Ri hiện nay, nhân dân ta đã lai tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo…

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU

1.2.1 Gà Ri

Phân bố rộng rãi ở mọi miền đất nước, trong đó phổ biến là ở miền Trung và miền Bắc Đây là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta, khoảng 85% giống gà địa phương là gà Ri, được chăn thả ở các vùng nông thôn [11] Gà

Ri có nguồn gốc từ nhóm gà rừng Gallus gallus bankiva Gà có ngoại hình

thon nhỏ, đầu mỏ nhỏ, mào cờ đơn có răng cưa, màu đỏ tươi; tích và dái tai màu đỏ, có khi xen lẫn ánh bạc trắng; cổ thanh nhỏ dài vừa phải; ngực lép, bụng thon mềm; chân có hai hàng vẩy màu vàng có khi xen lẫn màu đỏ tươi Màu sắc lông có nhiều loại, gà Ri thuần chủng có màu lông vàng rơm Gà mọc lông sớm, tốc độ mọc lông nhanh hơn gà Đông Tảo, gà Mía nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh [2], [6]

Gà Ri nhỏ con (trọng lượng sơ sinh: 23,5 - 31,8 g; 6 tuần tuổi đạt bình quân 327,6 g; 12 tuần tuổi: 824,4 - 1163,0 g; 16 tuần tuổi: 1057,4 - 1862,3 g; 19 tuần tuổi: 1192,6 - 2050,0 g), tiêu tốn thức ăn/ đơn vị tăng trọng hoặc chục quả trứng còn cao (2 tuần tuổi: 2,47 kg/ 1 kg thịt; 4 tuần tuổi: 3,68 kg/ 1 kg thịt; 6 tuần tuổi: 3,91 kg/ 1 kg thịt) [6]

Gà trống lông màu đỏ thẫm là phổ biến nhất, đầu lông cánh và lông đuôi có lông đen ánh xanh, lông bụng màu đỏ nhạt hoặc vàng đất, dáng chắc khỏe, ngực vuông và mào đứng, sớm phát triển; ba tháng đã biết gáy Gà trống trưởng thành (một năm tuổi) cho trọng lượng 1,5 - 2 kg/ con [2], [6]

Gà mái phổ biến nhất là màu lông vàng rơm, vàng đất hoặc nâu nhạt, xung quanh cổ đôi khi có hàng lông đen, có đốm đen đuôi và đầu cánh, mào không phát triển Gà mái trưởng thành trọng lượng 1,2 - 1,4 kg/ con Gà 4 - 5 tháng tuổi bắt đầu đẻ Sức đẻ năm đầu 100 - 110 trứng, tỷ lệ đẻ không ổn định trong 1 chu kỳ đẻ, trứng nặng 40 - 45 g, vỏ màu trắng Gà đẻ theo từng đợt 15 - 20 trứng thì nghỉ đẻ và đòi ấp Nuôi con khéo [2]

Các nghiên cứu trước đây đều cho thấy gà Ri có ưu điểm thích nghi tốt với đặc điểm khí hậu của Việt Nam, rất dễ nuôi, thích hợp với nuôi chăn thả, không đòi hỏi kỹ thuật cao, chuồng trại thức ăn đơn giản, tận dụng thức ăn của địa phương, chịu đựng tốt điều kiện thức ăn nghèo dinh dưỡng Gà có khả năng kiếm thức ăn ngoài tự nhiên Thuộc loại gà lấy trứng, thịt Thịt thơm ngon Vốn đầu tư thấp, khả năng kháng bệnh cao Nhược điểm của gà Ri là tầm vóc nhỏ, tốc độ sinh trưởng chậm, sản lượng trứng không cao do bản năng đòi ấp mạnh, khối lượng trứng nhỏ [6]

1.2.2 Gà Đông Tảo (Ðông Cảo)

Có nguồn gốc và phân bố nhiều ở thôn Đông Tảo, huyện Khóai Châu, tỉnh Hưng Yên Gà có đặc điểm nổi bật là dáng to, thô, đùi và ống chân rất to, ngón chân múp míp, chân có vảy thịt, mào kép, mào nụ, da màu vàng Thân hình to, ngực sâu, lườn rộng, dài Xương to, dáng đi chậm chạp, nặng nề [2], [6]

Gà trống hầu hết có màu lông mận chín pha lẫn lông đen, đỉnh đuôi và cánh có màu lông đen ánh xanh Mào kép, nụ, hoa hồng, bèo dâu Tích và dái tai màu đỏ, kém phát triển Thể chất khoẻ, xương to, điển hình chân to cao, cơ ngực và cơ đùi phát triển Chân to màu vàng có 3 hàng vải trở lên, xù xì,

nhiều hoa dâu Khi trưởng thành, con trống có thể nặng tới 5 - 6 kg [2], [6]

Gà mái trưởng thành có lông màu vàng nhạt hoặc màu nâu nhạt, khối lượng giai đoạn trưởng thành của gà mái là 3 - 3,5 kg Bắt đầu đẻ lúc 160 ngày tuổi Nếu để gà đẻ rồi tự ấp, 10 tháng đẻ 70 quả Khối lượng trứng 48 - 55 g/ quả Tính đòi ấp mạnh nhưng ấp và nuôi con không khéo Gà mới nở có lông trắng đục Khối lượng mới nở 38 - 40 g/ con Gà con chậm mọc lông, chậm lớn [2], [6]

Gà có tốc độ sinh trưởng nhanh, nhưng sinh sản (đẻ và ấp nở, nuôi con) thấp Gà Ðông Tảo là giống gà thịt ở nước ta, có khả năng sinh trưởng nhanh, sức khỏe tốt, đây là vốn gen quí dùng để lai với các giống gà khác sẽ cho gà Broiler có năng suất cao [6]

1.2.3 Gà Tre

Giống gà địa phương có lâu đời ở vùng Đông Nam Bộ Hiện nay phân bố ở Long An, thành phố Hồ Chí Minh và một số ít tỉnh phía Bắc Con trống có màu lông sặc sỡ: tía đen, nâu sáng, vàng chuối, đuôi và cổ đen Lông đuôi dài, mào nụ, chân cao, săn chắc Con mái thường kém sặc sỡ hơn, có màu đen

(ô), đốm hoa mơ, vàng, nâu đất, thấp chân [2]

Đặc điểm nổi bật: gà trống và mái nhỏ hơn gà Ri, con trống nặng 1,2 - 1,3 kg/ con, con mái nặng 0,8 - 0,9 kg/ con [2]

Tập tính: hay bay và đậu trên hàng rào Nuôi làm cảnh Mỗi năm đẻ 5 - 7 lứa, mỗi lứa đẻ 8 - 10 quả/ mái [2]

1.3 ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ

1.3.1 Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà

1.3.1.1 Đặc điểm cấu trúc ty thể

Ty thể (hình 1.1) được mô tả lần đầu tiên bởi Altmann vào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi của ty thể đã được nghiên cứu chi tiết bởi Palade (1952) và Sjostrand (1953) [23] Đây là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, kích thước 2 - 5 m Toàn bộ cấu trúc của ty thể được bao bọc bởi hai lớp

màng Lớp màng ngoài bao trùm, tạo nên ranh giới ngoài của ty thể; lớp màng trong tạo thành các nếp gấp (mào - cristae) hướng vào tâm và là nơi khu trú của các enzyme hô hấp Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lượng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) [30], [40] Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lượng dưới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP Đây là dạng năng lượng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào.

1.3.1.2 Cấu trúc hệ gen ty thể gà

Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% DNA của tế bào Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần lớn động vật có xương sống vào khoảng 16,8 kb, tuy

nhiên có thể sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào, hoặc do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp Kích thước mtDNA gà là 16.775 bp [22] Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn

Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và bởi vì mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn Trong tế bào trứng động vật có xương sống, ước tính con số này lên đến 108 Với số lượng bản sao lớn như vậy nên có thể thu được DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một số lượng ít tế bào

DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân [18] - Số lượng bản sao lớn [34], [47], [57]

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp [32], [47], [57]

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài [15], [32] [34], [47]

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [33], nên sử dụng mtDNA như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi [28], [30], [45], [49], [50]

Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng, gồm hai chuỗi:

chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine

Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn

Hệ gen ty thể gà mang những đặc trưng của hệ gen ty thể động vật có xương sống và có độ tương đồng rất cao khi so sánh với mtDNA của lưỡng cư và động vật có vú, tức là cũng gồm hai vùng là vùng mã hóa và vùng điều khiển (D-loop) Vùng không mã hóa chiếm khoảng 7% mtDNA, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng (OH) và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (PH và PL), khoảng 90% phần DNA không mã hóa của ty thể nằm trong vùng này

Vùng mã hóa chứa 37 gen và không có khoảng trống giữa các gen, mã hóa cho 13 polypeptide, 2 rRNA và 22 tRNA [20], [38] Trong đó, chuỗi nặng chứa 12 trong 13 gen mã hóa polypeptide (trừ một tiểu phần ND6 của phức hệ I là được phiên mã từ chuỗi nhẹ), 14 trong số 22 gen tRNA và cả hai gen rRNA (12S và 16S) 13 chuỗi polypeptide được mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hô hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3,

4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi polypepetide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b - Cytb) trong số 11 chuỗi

polypeptide của phức hệ III (Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (CO I, II, III) trong số

13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase) [24]

Còn tất cả các protein khác của ty thể bao gồm tất cả 4 tiểu đơn vị của phức

hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase  của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi DNA nhân [60].

Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này được thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các taxon bậc bộ trở lên Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng được sử dụng như một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [43] Một số gen mã hóa protein hoặc tRNA có khung đọc nằm gối lên nhau một phần (overlapping gene)

Ngoài các đặc điểm trên, hệ gen ty thể gà có một số đặc điểm đáng chú ý, khác biệt với lớp thú và lưỡng cư [22]:

- Thứ nhất, theo chiều 5’ - 3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop

là các gen Cyt b, tRNAThr, tRNAPro, ND6 và tRNAGlu, trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần hơn với vùng điều khiển Trật tự này được

bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes)

- Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với

trình tự nằm giữa hai gen tRNACys

và tRNAAsn đều có ở tất cả động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này

- Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay

vì ATG

Sơ đồ chi tiết của hệ gen ty thể gà được trình bày ở hình 1.2.

Hình 1.2 Sơ đồ mtDNA gà

1.3.1.3 Cơ chế di truyền của mtDNA

MtDNA đƣợc di truyền theo dòng mẹ thông qua tế bào chất của noãn bào [34], [40] Trong quá trình hình thành hợp tử, tinh trùng cung cấp cho trứng genome nhân của nó, không cung cấp hoặc đóng góp rất ít tế bào chất, mtDNA vào hợp tử Kết quả là hầu nhƣ tất cả ty thể trong phôi đều có nguồn gốc từ trứng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi vào trứng Một số cơ chế đƣợc đƣa ra nhằm giải thích hiện tƣợng thú vị này đó là: (1) do sự phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin, (2) do hiện tƣợng pha loãng, phân hủy mtDNA của tinh trùng, (3) do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng Tuy nhiên, những cơ chế này vẫn chƣa phải là những lời giải thích thoả đáng và thật sự thuyết phục

DNA ty thể đƣợc sao chép từ hai điểm khởi đầu Sự tái bản DNA bắt đầu từ OH sử dụng một primer RNA tổng hợp từ bản mã sao của chuỗi nhẹ Tổng hợp chuỗi nặng đƣợc tiếp tục cho tới hai phần ba vòng của của phân tử mtDNA, chuỗi mới sẽ thay thế chuỗi nặng ban đầu cho đến khi nó tìm đƣợc điểm khởi đầu của chuỗi nhẹ (OL) Khi đƣợc bộc lộ ra trên chuỗi nặng đã thay thế, OL cuộn thành cấu trúc vòng móc (stem - loop) và sự tổng hợp chuỗi nhẹ bắt đầu, tiếp tục quay trở lại dọc theo sợi khuôn H

Năm 2005, Reyes và đồng tác giả (đtg) [53] khi nghiên cứu quá trình tái bản ở mtDNA gà đã đề xuất rằng phần lớn hệ gen ty thể gà (thậm chí toàn bộ mtDNA) đều có các điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng các điểm này tập trung nhiều nhất ở khu vực gần vùng D-loop, đặc biệt là ở gen ND6

Phiên mã của mtDNA đƣợc khởi đầu từ 2 promoter trong vùng D-loop Quá trình phiên mã bắt đầu từ cả 2 promoter (PH, PL) trong vùng D-loop và liên tục theo mạch vòng của phân tử DNA Hai sợi phiên mã theo 2 chiều ngƣợc nhau quanh một vòng để hình thành những phân tử RNA polycistronic

Các tRNA được tạo thành nhờ ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng được cuộn xoắn trong các bản phiên mã và được phân cắt Các mRNA và rRNA tự do được polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA được biến đổi thêm CCA vào đầu cuối 3' [21], [58]

1.3.2 Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền

Phân loại học cổ điển trên các đối tượng thuộc bộ Gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không được coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài Khi đó, mtDNA và đặc biệt là vùng D-loop với những ưu điểm nổi bật đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu Thuật ngữ D-loop được dùng để chỉ một vùng có chức năng điều khiển nằm trong mtDNA Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự mở đầu tái bản của mtDNA Ở gà nhà, vùng này có kích thước 1227 bp [26], nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

Về mặt cấu trúc, D-loop của gia cầm có thể được chia thành ba vùng chính là vùng ngoại biên I và III có khả năng biến đổi cao và vùng II là vùng trung tâm ít biến đổi [55] Vùng I nằm ở đầu 5' vùng điều khiển, kích thước khoảng 400 bp, vùng này chứa chuỗi cytosine (C-stretch), đó là một chuỗi trình tự gồm toàn nucleotide cytosine; chuỗi C là đặc điểm đặc trưng cho đầu 5' của vùng điều khiển hệ gen ty thể của nhiều họ trong lớp Chim Vùng I còn chứa trình tự kết thúc quá trình tái bản hệ gen ty thể (TAS) là hộp TATAT hoặc TACAT Vùng II bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không

thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ, vùng này chứa các cụm trình tự bảo thủ (hộp F, E, D, C và BSB) [19], [54] Trong phần giữa của hộp E và hộp D có những trình tự ngắn (Rebox và Mt-3) tương ứng với các trình tự có khả năng bám vào các nhân tố phiên mã trong nhân mà có liên quan tới việc điều chỉnh phản ứng oxy hóa phosphoryl hóa Vùng II kích thước khoảng 500 bp, vùng này có tốc độ tiến hóa chậm hơn so với vùng I và vùng III từ 10 - 20 lần [35] Thông thường, vùng thứ III là vùng biến đổi nhiều nhất và có trình tự giống với động vật có vú Vùng này nằm ở đầu 3' của vùng điều khiển, kích thước

khoảng 350 bp và bắt đầu với cụm trình tự bảo thủ 1 (Conserved Sequence Block - CSB-1) Yếu tố phiên mã của ty thể có thể bám vào trình tự này và

chuyển mtDNA từ quá trình phiên mã sang quá trình tái bản khi một yếu tố khác kết hợp vào phức hệ mtTFA - CSB-1 [51] Vùng này còn chứa Promoter định hướng hai chiều cho quá trình phiên mã nằm giữa CBS-1 và trình tự lặp lại cuối cùng của hệ gen ty thể [39] Hiện tượng mất đoạn hoặc chèn đoạn thường tập trung chủ yếu ở phần cuối của vùng III ảnh hưởng đến kích thước vùng điều khiển cũng như mtDNA Phần lớn các biến đổi tập trung ở vùng I và vùng III nên trình tự nucleotide của chúng thường được phân tích để xác định các kiểu đơn bội trong vùng điều khiển [64]

Phân tích mtDNA trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc tìm hiểu sự tiến hóa của loài do những đặc tính riêng biệt của nó như số lượng bản sao lớn, không tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và di truyền gần như tuyệt đối theo dòng mẹ Các vùng khác nhau của mtDNA tiến hóa với các tỷ lệ khác nhau [55], trong đó vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn từ 3 đến 10 lần so

với các vùng khác của hệ gen ty thể [17] Điều này làm cho nó đặc biệt có ý

nghĩa trong các phân tích chủng loại phát sinh [14], [17] Phần lớn các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền đều căn cứ vào trình tự vùng D-loop thông qua việc phân tích các đa hình nucleotide đơn (SNP - single nucleotide polymorphism) Đây là những nghiên cứu phức tạp do tỷ lệ thay thế rất khác

nhau giữa các vị trí Qua đó đưa ra các dữ liệu phù hợp với sự đánh giá tỷ lệ đột biến và tính toán được thời gian của các sự kiện tiến hóa Thông tin thu được từ việc nghiên cứu sự đa dạng trình tự vùng D-loop cũng như vùng mã hóa của mtDNA rất hữu ích trong việc phân tích các đột biến gây bệnh, xây dựng cây phát sinh chủng loại và mô tả lại sự di cư của các quần thể

Như vậy, các gen trong hệ gen ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại phân tử Chính vì thế mà DNA ty thể được coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể

1.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Kể từ năm 1990, khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà được công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự được đăng ký trên GenBank Trình tự hệ gen ty thể đã được sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới. Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể được tiến hành trên một số loài thuộc bộ Gà

(Galliformes)

Trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đã được Desjardins và Morais công bố năm 1990 [22] Nó cho thấy có sự tương đồng rất lớn khi so sánh với mtDNA của các động vật có xương sống khác Các gen mã hóa protein rất giống với các gen tương ứng ở động vật có vú và lưỡng cư, chúng đều sử dụng các mã di truyền giống nhau trong quá trình dịch mã Guanine thường vắng mặt ở vị trí thứ ba của các mã di truyền Nhiều gen gối nhau và nhiều gen tận cùng với bộ ba kết thúc không hoàn chỉnh gồm toàn adenine

Năm 2002, tổng số 539 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop ty thể của 5

giống gà địa phương (Gallus gallus domesticus) ở tỉnh Zhejiang (Trung

Quốc) và gà White Leghorn đã được giải trình tự và so sánh với gà rừng đỏ

(Gallus gallus), gà rừng xám (Gallus sonneratii), gà rừng xanh (Gallus varius) và gà rừng Lafayettei (Gallus lafayettei) đã được đăng ký trên

GenBank Cây chủng loại phát sinh cho những mẫu gà này đã được xây dựng

dựa trên trình tự của vùng D-loop Kết quả cho thấy có 4 loài của chi Gallus có những sự khác biệt rất lớn với nhau, gà nhà G g domesticus có quan hệ họ

hàng gần gũi nhất với gà rừng đỏ ở Thái Lan và những vùng giáp với nước này Từ đó các nhà khoa học cho rằng gà nhà Trung Quốc có lẽ có dạng tổ tiên trong các khu vực này [49]

Ở Nhật Bản, có một nhóm gà chọi đặc biệt có tên là Shamo Tuy nhiên,

quá trình mở rộng khu phân bố của loại gà này ở Nhật Bản nhìn chung còn chưa được biết rõ Năm 2003, Komiyama và đtg [37] đã tiến hành nghiên cứu về tiến hóa ở mức phân tử của gà chọi để có được những đánh giá sâu hơn

không chỉ về khởi nguồn tiến hóa của Shamo mà còn của cả văn hóa chọi gà

Trong nghiên cứu này đã sử dụng các mẫu máu của gà chọi từ 11 chủng

Shamo khác nhau Tiếp đó, cây chủng loại phát sinh được xây dựng bằng việc sử dụng tổng số 42 trình tự vùng D-loop Kết quả cho thấy gà Shamo được

tách biệt rõ thành hai nhóm khác nhau: một nhóm gồm các mẫu từ đảo Okinawa và nhóm thứ hai gồm các mẫu từ Kyushu và Honshu Điều đó có

nghĩa là gà Shamo phải được mang vào Nhật Bản từ hai dạng tổ tiên khác

nhau Những điều tra về lịch sử của gà Shamo đã cho thấy những phân tích

chủng loại phát sinh là phù hợp với quan điểm cho rằng gà Shamo có tổ tiên

độc lập từ khu vực Đông Nam Á và lục địa Trung Quốc, nhưng sau đó đã bị tạp giao ít nhiều về phương diện địa lý

Những con gà có tiếng gáy dài thường được ưa chuộng trên khắp thế giới và những người am hiểu vật nuôi đã giữ lại các giống gà có đặc điểm

này Ở Nhật Bản có 3 giống gà Naganakidori rất đặc biệt được nuôi để phát

triển tiếng gáy dài khác thường tới trên 15 giây Nhằm làm sáng tỏ quá trình thuần hóa và nguồn gốc phát sinh của chúng, năm 2004, vùng D-loop

ty thể gà Naganakidori đã được giải trình tự Các mẫu máu của 9 con gà có

tiếng gáy dài và 74 con gà từ 11 giống gà địa phương đã được thu thập Dữ liệu về trình tự DNA của 2 loài gà rừng cũng đã được thu thập từ GenBank Tiếp theo, cây chủng loại phát sinh đã được thiết lập, kết quả cho thấy cả 3

giống gà Naganakidori đều có tổ tiên chung từ gà chọi Shamo bất chấp

việc chúng có nhiều đặc điểm khác nhau rõ rệt và thú vui nuôi gà có tiếng gáy dài có thể đã được đến trước bởi thú chơi gà chọi Hơn nữa, những chủng gà này lần đầu tiên tách biệt khỏi gà chọi ở đảo Okinawa, nơi có vị trí gần với miền Nam Trung Quốc và Đông Dương hơn so với lục địa Nhật Bản (Honshu/ Kyushu) Điều này cho thấy rằng có thể tổ tiên của những con gà có tiếng gáy dài lần đầu tiên được mang vào lục địa Nhật Bản qua đảo Okinawa là những con gà chọi từ các khu vực xung quanh ở miền Nam Trung Quốc hoặc Đông Dương [36]

Năm 2005, Nishibori và đtg (Nhật Bản) [48] đã xây dựng cây chủng loại

phát sinh của các loài gà thuộc chi Gallus dựa trên phân tích trình tự D-loop

ty thể và dùng nó để chứng minh cho giả thuyết rằng gà rừng đỏ (Red junglefowl - RJF) là tổ tiên trực tiếp của gà nhà Vị trí chủng loại phát sinh

của gà nhà và các loài gà khác thuộc chi Gallus là rất quan trọng khi có ý định

gìn giữ và cải tiến các giống gà bằng chuyển gen từ hệ gen của các chủng hoang dã Các phân tích chủng loại phát sinh dựa trên trình tự mtDNA đã khám phá ra rằng hai chủng gà rừng xám (GJF) là cùng một nhánh với gà rừng đỏ (RJF) và gà nhà và chỉ có một chủng gà rừng xám nằm ở vị trí xa hơn cùng với gà rừng Cyelon (CJF)

Quá trình thuần hóa của gà được tin rằng đã diễn ra ở Nam Á, đặc biệt là châu thổ Ấn Độ Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trước đó lại không bao gồm

gà rừng đỏ Ấn Độ Gallus gallus murghi (RJF), do đó đã tạo ra một khoảng

trống lớn về mối quan hệ di truyền với nhóm này Tháng 6 năm 2008, Kanginakudru và đtg [34] đã công bố kết quả nghiên cứu bổ sung vấn đề này

nhờ việc phân tích 76 mẫu gà Ấn Độ bao gồm 56 gà rừng đỏ G g murghi (RJF), 16 gà nhà G g domesticus và 4 gà rừng xám G sonneratii (GJF) có sử

dụng cả các marker vi vệ tinh và trình tự vùng D-loop ty thể gà Các nhà khoa học cũng đã so sánh trình tự vùng D-loop của các loại gà này với 779 trình tự thu thập được từ GenBank Các kết quả chỉ ra rằng sự thuần hóa của gà đã diễn ra một cách độc lập trong các địa phương khác nhau của châu Á trong đó có Ấn Độ Các tác giả cũng đã phát hiện ra bằng chứng về sự thuần hóa của

gà Ấn Độ từ G g spadiceus và G g gallus cũng như từ G g murghi, qua đó

đã củng cố thêm các dữ liệu về nguồn gốc đa dạng của gà nhà Ấn Độ và các loại gà nhà khác

Trước đây có giả thuyết cho rằng gà được đưa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên Một giả thuyết khác cho rằng gà được đưa trực tiếp từ lục địa hoặc các đảo ở Đông Nam Á vào Nam Mỹ từ khoảng 3300 năm trước Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây liên quan tới việc phân tích trình tự mtDNA gà từ các mẫu vật thời tiền sử đã góp phần làm sáng tỏ giả thuyết thứ ba cho rằng gà được đưa vào Nam Mỹ từ quần đảo Polynesia [62]

Năm 2008, Muchadevi và đtg (Zimbawean) [46] khi nghiên cứu đa hình trình tự đoạn 440 bp vùng D-loop hệ gen ty thể của 283 mẫu gà thuộc 14 quần thể đã đề xuất rằng gà Zimbawean bắt nguồn từ hai khu vực là Đông Nam Á và Ấn Độ

Cùng năm 2008, Razafindraibe và đtg [52] đã giải trình tự đoạn siêu biến I của vùng D-loop hệ gen ty thể 77 mẫu gà bản địa Madagascar Khi so sánh với các trình tự tương ứng của gà châu Phi và gà châu Á các tác giả đã kết luận rằng gà Madagascar có hai nguồn gốc tách biệt, trong đó có một dạng tổ tiên từ Indonesia

1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hệ gen ty thể gà nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, phần lớn mang tính cá thể và không đặc trưng cho quần thể Mục đích chủ yếu của các nghiên cứu này là tìm hiểu đa hình trình tự nucleotide ở một vài cá thể Năm 1997, trình tự 641 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop 3 mẫu gà Việt Nam (1 mẫu gà nhà và 2 mẫu gà rừng đỏ phân

loài G g gallus) đã được Miyake (Nhật Bản) xác định [44] Đây là tác giả

nước ngoài đầu tiên tiến hành nghiên cứu đa hình trình tự vùng D-loop trên đối tượng gà Việt Nam, các trình tự này sau đó được đăng ký trên GenBank

với các mã số là AB009435 (G gallus domesticus), AB009434 (G gallus gallus) và AB009449 (G gallus gallus)

Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và đtg [9] đã nghiên cứu về sự khác

biệt ở ba loài thuộc giống gà Lôi: gà Lôi lam đuôi trắng Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis), Trĩ bạc (L nycthemera) và gà Lôi lông tía (L diardi) Tác giả đã

chỉ ra sự thay đổi nucleotide trên vùng D-loop ty thể của chúng dựa trên vị trí

nhận biết của các enzyme giới hạn SmaI và EcoRI

Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và đtg [4] sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 đã nhân được đoạn D-loop có kích thước 1,3 kb từ DNA genome của

2 mẫu gà Lôi lam đuôi trắng (Lophura hatinhensis) và gà Lôi lam mào trắng (Lophura edwardsi), sau đó gắn thành công vùng D-loop ty thể của 2 cá thể

này vào vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc tiến hành phân tích trình tự nucleotide vùng D-loop để nhằm so sánh quan hệ di truyền giữa 2 loài

Năm 2007, Lê Đức Long và đtg [7] đã giải trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 cá thể gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch, qua đó đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà nghiên cứu

Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và đtg [12] đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 2 mẫu gà Ri và gà Mông, phát hiện được 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotide khi so sánh với trình tự gà WhiteLeghorn gốc Nhật Bản mang mã số AB114078 trên GenBank

Năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn và đtg [47] đã xác định trình tự 300 nucleotide từ vị trí 131 đến vị trí 430 của 80 mẫu thuộc 4 giống gà Ri, Tre, Chọi và Tàu Vàng (mỗi giống 20 mẫu), qua đó xác định được 21 vị trí đa hình nucleotide

Năm 2009, Berthouly và đtg [16] đã sử dụng 30 marker vi vệ tinh trên 1082 mẫu gà để nghiên cứu về cấu trúc di truyền của quần thể gà H’mong thuộc tỉnh Hà Giang và đưa ra bằng chứng di truyền về hiện tượng tạp giao

của nhóm gà này với gà rừng G gallus

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển D-loop của 71 mẫu cá thể gà địa phương Việt Nam thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre (các cá thể này không bao gồm 40 cá thể gà Ri và gà Tre đã sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Đăng Tôn và đtg), sau đó sản phẩm PCR sẽ được dùng để giải trình tự tự động Các số liệu đa hình thu được về vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre sẽ được so sánh với trình tự chuẩn AP003580 đã được công bố trên GenBank, từ đó phân loại các mẫu này vào các kiểu đơn bội khác nhau

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng trong đề tài này là 71 mẫu DNA tổng số gồm 31 mẫu gà Ri (Hà Nội), 22 mẫu gà Đông Tảo (Hưng Yên), 18 mẫu gà Tre (Long An), các mẫu DNA này do viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cung cấp

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm:

- Máy PCR PTC-100 (MJ Research, Inc., Mỹ), GeneAmp PCR System 9700 (ABI, Mỹ)

- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer (ABI, Mỹ)

- Pipetman các loại (Gilson, Pháp)

- Bể điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Tempette Junior Techne) - Máy khuấy trộn Vortex (OSI Rotolab) - Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ) - Lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản)

- Máy chụp ảnh (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy làm khô chân không (Automatic Environmental Speed-VacSystem, AES 1010, Savant, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Biofuge, Sorvall)

- Máy li tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, CHLB Đức) - Tủ lạnh sâu -20oC, -80C (Sanyo, Nhật Bản)

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có:

- Bộ hóa chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA

polymerase… của hãng Fermentas

- Cặp mồi H1255 và L16725 được đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen + H1255: 5’- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3’

+ L16725: 5’- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3’ - Hóa chất chạy điện di:

+ Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr)

- Bộ hóa chất thôi gel: Kit Wizard SV gel and PCR Clean - up System của hãng Promega:

 Dung dịch MBS (Membrane Binding Solution)

 Dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 95%

- BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied BioSystems (ABI, Mỹ) phục vụ cho giải trình tự vùng D-loop

- Ethanol 100% và 70%

- Nước khử ion vô trùng

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tạiPhòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu H1255 và L16725 để nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể từ các mẫu DNA tổng số Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và tinh sạch để đọc trình tự trực tiếp Kết quả đọc trình tự được xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng Các phương pháp sử dụng được trình bày sau đây

2.2.1 Điện di trên gel agarose

Nguyên tắc chung:

Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA sản phẩm của PCR [13]

Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH = 7) do sự có mặt của gốc PO4

3- Do đó, khi đặt nucleic acid trong điện trường với cường độ và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ dịch chuyển qua bản gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) Trên cùng một bản gel, với cùng một cường độ dòng điện, những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau cùng một khoảng thời gian Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamide Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp làm hiện hình Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng EtBr Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại Như vậy cho phép dễ dàng phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt được phân tử DNA trên cùng một bảng gel Đối với gel polyacrylamide, các phân tử thường được đánh dấu bằng

đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng trên bản gel sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi [13]

Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lượng phân tử, hoặc trích li được các DNA khác nhau [13]

- Để nguội đến khoảng 50 - 55oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược Đợi thạch đông và ổn định

- Sau khi gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm Ở đây, chúng tôi dụng đệm TAE 1X

- Tra mẫu DNA: trộn một lượng mẫu thích hợp với 3 l dung dịch đệm tra mẫu (loading dye), sau đó tra vào các giếng trên bản gel Tra DNA chuẩn vào một giếng, đậy nắp bản gel và cắm điện cực

- Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 - 120 V, cường độ 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút

- Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và nhuộm bản gel trong EtBr 10 g/ ml Lấy bản gel ra sau 5 - 10 phút và rửa trong nước sạch

- Quan sát và chụp ảnh gel trên máy Bio-Rad

2.2.2 Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary

Mullis và đtg phát minh vào năm 1985, được xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử PCR được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng như trong nghiên cứu phân loại học phân tử

Nguyên tắc:

Kỹ thuật PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng

hợp DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các

đoạn gen lên hàng triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại [1], [13]

Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên người ta phải biết được các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu Trong điều kiện thích hợp và môi trường có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn [1], [13]

Thành phần phản ứng PCR:

- Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần nhân bản và chỉ cần biết trình tự

nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide

- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA Đây

là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ - 3’) của enzyme DNA - polymerase Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung

- Bốn loại dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP

- Dung dịch đệm cung cấp ion Mg2+ và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase

- Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [1], [13]

Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 µl

Các giai đoạn:

Phản ứng PCR gồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây [1], [13]:

- Giai đoạn biến tính DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng

sợi đơn (single strands) Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) trong giai đoạn này đều bị dừng lại Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào

 Nhiệt độ: 94 - 95o

C, tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự đứt gãy của các liên kết hydro

 Thời gian: khoảng 1 phút

- Giai đoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn

Các mồi được gắn vào vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và đứt gãy liên tục giữa mồi sợi đơn và DNA khuôn sợi đơn Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính

xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (DNA khuôn và mồi) Taq

polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu

 Nhiệt độ: ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thể rất rộng tuỳ thuộc vào trình tự nucleotide của mồi, thông thường khoảng 55o

C, nhưng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68o

C  Thời gian: 20 giây đến 2 phút

- Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lúc này được nâng lên đến 72oC, đây là

nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ

sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có mồi gắn vào theo chiều 5’ - 3’ Ở nhiệt độ này, các mồi bắt cặp chính xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi đó các mồi ở các vị trí bắt cặp không chính xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt độ cao) do đó không tổng hợp được DNA từ những mồi này Thời gian của giai đoạn này từ 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn DNA cần nhân bản

Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép ban đầu tổng hợp được 2 sợi DNA kép mới Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 - 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 - 10 phút sao cho tất cả các phản ứng enzyme diễn ra hoàn toàn Sau đó nhiệt độ được hạ xuống 4oC để bảo quản sản phẩm

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 - 2 %

Hiện nay, kỹ thuật PCR đã được phát triển, cải tiến so với ban đầu Người ta đưa vào thêm một số bước phụ như khởi động nóng nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4o

C

2.2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR

Để thu được các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự trực tiếp, chúng tôi tiến hành cắt gel (thạch) sau đó tinh sạch bằng Kit Wizard SV Gel and PCR clean-up system của hãng Promega theo quy trình kỹ thuật sau:

- Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA để thu lấy băng DNA quan tâm Thêm 10 l dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) đối với mỗi 10 mg gel và ủ hỗn hợp ở 50 - 65o

C cho tới khi thạch tan hoàn toàn

- Đặt cột nhỏ vào trong ống thu Chuyển hỗn hợp sản phẩm PCR và dung dịch bám màng vào trong cột nhỏ và để 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa

- Bổ sung 700 l dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 100% Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC, đổ dịch thừa

- Lặp lại bước trên với 500 l dung dịch MWS, ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút

- Chuyển cột nhỏ sang ống 1,5 ml sạch Sấy khô sản phẩm PCR trong máy làm khô chân không, thời gian 5 phút Thêm 30 l nước cất hai lần, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 - 10 phút Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4o

C, sau đó giữ mẫu DNA tinh sạch ở -20o

Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau Thành phần của phản ứng nhân bản DNA để đọc trình tự bao gồm: mồi

L16725: 3,2 pmol, 200 ng DNA khuôn (sản phẩm PCR đã tinh sạch), BigDye 0,5X, đệm 1X và H2O với tổng thể tích 15 l

Chu trình nhiệt:

Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại DNA trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 như sau: 96oC - 4 phút; 25 chu kỳ (96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây, 60oC - 4 phút) Sản phẩm được giữ ở 4oC

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/ EDTA:

- Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 l EDTA 125 mM (pH = 8); 60 l EtOH 100% Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở -20oC, 3 giờ Sau đó ly tâm 12000 rpm, 15 phút để tủa DNA trong đó

- Loại bỏ EtOH và rửa tủa bằng 60 l EtOH 70% Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút

- Làm khô tủa và bổ sung 10 l Hi-Di TM Formamide để làm tan tủa và biến tính ở 95o

C trong 5 phút

Sau bước này các mẫu được đưa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di trong ống mao quản 80 cm x 50 m chứa POP-4™ của hãng ABI, Mỹ Vùng điều khiển D-loop được xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer

2.2.5 Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng

Dữ liệu về trình tự vùng D-loop được xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape® v2.6 và BioEdit v7.0.9

Trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự chuẩn bằng thuật toán ClustalW Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu được tính toán bằng phương pháp Maximum Composite Likelihood Cây phát sinh chủng loại của 71 mẫu gà được xây dựng theo phương pháp NJ (Neighbor-Joining) và phương pháp ML (Maximum Likelihood) Tất cả các phân tích trên đều được thực hiện thông qua phần mềm Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) v4.0 [63].

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR

D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xương sống Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của DNA ty thể Với đặc trưng tích luỹ các đột biến cao gấp 5 - 10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA nhân, D-loop trở thành vùng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật Chính vì thế, nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Đông Tảo và Tre, chúng tôi chọn trình tự nucleotide của vùng D-loop hệ gen ty thể làm đối tượng nghiên cứu

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR thành công khi phản ứng có tính đặc hiệu cao Do đó, để cho ra sản phẩm tốt nhất thì điều kiện phản ứng phải được tối

ưu hóa Để nhân vùng D-loop cần có DNA khuôn, mồi, các dNTP, Taq DNA

polymerase, MgCl2, dung dịch đệm và một chu trình nhiệt thích hợp

* Thành phần của phản ứng PCR

- Dung dịch đệm (Buffer): phản ứng PCR được thực hiện trong môi

trường đệm có pH 7,2 để ổn định hoạt động của Taq polymerase Trong thí

nghiệm này, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+

nhưng không chứa Mg2+ của hãng Fermentas, đệm này phù hợp cho hoạt động của Taq

polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2 Hơn nữa, loại đệm này cho chất lượng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không chứa NH4+

- Nồng độ Mg2+: trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đệm không chứa Mg2+

để có thể khảo sát mức độ ảnh hưởng của nó tới phản ứng Nồng độ ion Mg2+

(được cung cấp dưới dạng MgCl2) có thể ảnh hưởng tới nhiệt độ

biến tính (Tm) của DNA khuôn, hoạt tính của Taq polymerase và độ chính