Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ex murray) trevis) thu tại lào cai và lâm đồng TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: - Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam -Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Lê Thị Bích Thủy Viện Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TS Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS TS Khuất Hữu Trung Phản biện 2: GS TS Lê Mai Hương Phản biện 3: TS Nguyễn Thị Lan Hoa Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, trước tác động lớn biến đổi khí hậu, dịch bệnh khai thác mức người, vấn đề nghiên cứu bảo tồn phát triển nguồn gen lồi trồng nói chung, có loại dược liệu vấn đề khoa học xã hội quan tâm Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) loại dược liệu quý, thuộc danh sách "đỏ" Chương trình Nghiên cứu bảo tồn phát triển nguồn gen quý thuốc Hoạt chất Thạch tùng cưa huperzine A (HupA) có tác dụng việc chữa trị bệnh trí nhớ, đặc biệt bệnh Alzheimer người già Kết nghiên cứu phát tác dụng tuyệt vời HupA cho thấy triển vọng phát triển loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài Trên giới Việt Nam, số lượng người có vấn đề suy giảm trí nhớ nói chung người mắc bệnh Alzheimer nói riêng ngày tăng cao, nhu cầu thuốc thảo dược có chứa hoạt chất HupA khơng ngừng tăng, ngun nhân dẫn đến việc khai thác mức làm suy giảm nghiêm trọng nguồn gen loài dược liệu quý tự nhiên Do đó, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân ni cấy mơ nhằm bảo tồn phát triển nguồn gen lồi Các nghiên cứu cho thấy, loài Thạch tùng cưa sinh trưởng tốt rừng với đất mùn ẩm ướt, độ cao 350 - 1700 m, lượng mưa 1500 mm/ năm, độ ẩm 78% Ở nước ta, Thạch tùng cưa tìm thấy vùng cao số khu vực Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An, Tây Nguyên, Quảng Trị… Trong đó, Lâm Đồng Lào Cai hai khu vực có điều kiện khí hậu mơi trường sống thích hợp cho phát triển loài Thạch tùng cưa so với khu vực khác nước Tuy nhiên, Thạch tùng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm, khả sinh sản kém, mức khai thác nguồn trồng tự nhiên lớn làm dần nguồn gen quý nước ta, dẫn đến loài Thạch tùng cưa không đáp ứng nhu cầu nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm Do vậy, để chủ động nguồn dược liệu cho chiết xuất hoạt chất HupA dùng làm thuốc, việc nghiên cứu số đặc điểm sinh học để lựa chọn giống có khả sinh tổng hợp HupA cao, từ tìm phương pháp để tái sinh nhân giống nhằm bảo tồn phát triển nguồn gen loài vô cần thiết Hơn nữa, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu thành cơng nhân giống lồi Thạch tùng cưa với quy mơ lớn Xuất phát từ thực tế nhận định trên, lựa chọn hai vùng Lâm Đồng Lào Cai để thực đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nhân giống loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb Ex Murray) Trevis) thu Lào Cai Lâm Đồng” Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích số đặc điểm sinh học xác định điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, ni cấy mơ) lồi Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen loài Thạch tùng cưa Việt Nam 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học tính đa hình DNA lồi Thạch tùng cưa i Đặc điểm hình thái, giải phẫu lồi Thạch tùng cưa ii Đặc điểm sinh thái học loài Thạch tùng cưa iii Tính đa hình DNA loài Thạch tùng cưa Xác định hàm lượng huperzine A Thạch tùng cưa tự nhiên thu thập Lào Cai Lâm Đồng Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng cưa i Nhân giống Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân ii Nhân giống Thạch tùng cưa hình thức ni cấy mơ Xác định hàm lượng huperzine A Thạch tùng cưa nuôi cấy mơ Những đóng góp đề tài Luận án nghiên cứu có hệ thống kết hợp lúc phương pháp phân tích hình thái, giải phẫu thực vật sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen loài Thạch tùng cưa hai vùng Lào Cai Lâm Đồng Xác định hàm lượng HupA mẫu nguồn gen loài Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng, đó, mẫu Thạch tùng cưa thu Lâm Đồng có hàm lượng HupA (90,23 µg/g) cao so với mẫu thu Lào Cai (76,28 µg/g); hàm lượng HupA cao thân rễ; thạch tùng cưa thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA (92,50 µg/g) cao thu hái vào mùa xuân (tháng 3) (75,10 µg/g) Đã xác định số khâu làm sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống lồi Thạch tùng cưa phương pháp giâm hom thân (tại Lào Cai Lâm Đồng) với tỉ lệ hồi xanh sau đạt 97,78% phương pháp nuôi cấy mô với tỉ lệ sống sót giá thể đạt 97%; đồng thời, xác định hàm lượng HupA nuôi cấy mô đạt 300 µg/ g khối lượng khơ 4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết luận án cung cấp thông tin khoa học đặc điểm hình thái, tính đa dạng hệ gen, hàm lượng HupA Thạch tùng cưa hai vùng Lào Cai Lâm Đồng Cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhân giống, mở triển vọng đáp ứng nguồn giống đồng chất lượng cho phát triển nguồn gen loài Thạch tùng cưa Việt Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học có ý nghĩa định hướng cho cơng tác bảo tổn phát triển nguồn gen lồi Thạch tùng cưa Việt Nam Xác định thời điểm thu hoạch phận thu hái Thạch tùng cưa để nhận hàm lượng HupA cao phục vụ cho y học; đồng thời, giảm thiểu việc khai thác dẫn đến dần nguồn gen Thạch tùng cưa tự nhiên Thành công phương pháp nhân giống góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen loài Thạch tùng cưa vùng có khả trồng Việt Nam, cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều trị bệnh rối loạn trí nhớ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái học Thạch tùng cưa 1.1.3 Đặc điểm sinh thái, sinh học Thạch tùng cưa 1.1.4 Đặc điểm sinh sản 1.1.5 Đặc điểm hóa sinh 1.1.6 Các nghiên cứu đa dạng di truyền loài Thạch tùng cưa 1.2 Huperzine A, hoạt chất Thạch tùng cưa 1.2.1 Các nguồn tự nhiên có chứa HupA 1.2.2 Thành phần, cấu tạo tính chất vật lý, hóa học HupA 1.2.3 Các nghiên cứu tách chiết xác định hàm lượng HupA 1.2.4 Vai trò HupA y học 1.2.5 Dược động học HupA 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb Ex Murray) Trevis) TS Nông Văn Duy xác định tên khoa học 2.1.2 Hóa chất thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất Hóa chất tách chiết DNA tổng số; hóa chất PCR; hóa chất chạy TLC; hóa chất chạy HPLC; hóa chất sử dụng cho nhân giống (mua từ hãng Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ)…) 2.1.2.2 Thiết bị Sử dụng máy móc thiết bị phịng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.1.3 Môi trường nuôi cấy Sử dụng môi trường MS, WPM Gamborg B5 2.1.4 Thời gian địa điểm thí nghiệm Thời gian: từ tháng 12/ 2015 đến 11/ 2019 Địa điểm: Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Vườn Quốc gia Hoàng Liên; Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học nguồn gen loài Thạch tùng cưa 2.2.1.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm thực vật học Sử dụng phương pháp phương pháp kế thừa; phương pháp thu mẫu; phương pháp nội nghiệp; phương pháp quan sát đặc điểm hình thái; phương pháp đo kích thước, phương pháp vi phẫu 2.2.1.2 Phương pháp đánh giá mức độ đa dạng di truyền a Phương pháp tách chiết DNA tổng số DNA tổng số tách từ mẫu non theo phương pháp Saghai Maroof cộng (1984) có cải tiến b Phương pháp PCR với mồi RAPD Mười sáu mồi ngẫu nhiên sử dụng phản ứng RAPD cung cấp hãng Operon, Mỹ Phản ứng PCR thực theo phương pháp Williams cộng (1990) c Phân tích số liệu đa dạng di truyền Sử dụng phần mềm NTSYSpc Version 2.0 2.2.1.3 Xác định hàm lượng HupA Thạch tùng cưa Phương pháp tách chiết HupA: HupA tách chiết theo Ma cộng (2005) có cải tiến a Định tính hàm lượng HupA phương pháp TLC b Xác định hàm lượng HupA phương pháp HPLC 2.2.2 Phương pháp nhân giống Thạch tùng cưa 2.2.2.1 Phương pháp nhân giống vơ tính hình thức giâm hom thân Các thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, lần nhắc lại Mỗi công thức giâm 120 hom thân/ lần nhắc lại bầu giâm có kích thước cm x 10 cm Số liệu xử lý phần mềm Microsoft excel 2013 IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05) Tỉ lệ hom thân hồi xanh (%) = Số hom thân hồi xanh/ ∑ số hom thân giâm Tỉ lệ rễ (%) = Số hom thân rễ/ ∑ số hom thân giâm Tỉ lệ có = Số hom thân mới/ ∑ số hom thân giâm 2.2.2.2 Phương pháp nhân giống vơ tính hình thức ni cấy mơ Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu nuôi cấy Mẫu cấy khử trùng EtOH 70% 30 giây, xử lý tiếp HgCl2 với nồng độ 0,05 - 0,15% thời gian - phút, lắc NaOCl 20% phút Mỗi thí nghiệm tiến hành với 120 mẫu lần lặp lại Nhân giống hình thức nuôi cấy mô thực phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh nuôi cấy mô sẹo Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Microsoft excel 2013 IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) = số mẫu cấy vô trùng / ∑ số mẫu cấy Tỉ lệ mẫu bật chồi (%) = Số mẫu bật chồi / ∑ số mẫu vô trùng Tỉ lệ chồi rễ (%) = Số chồi rễ/ ∑ số chồi cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) = Số mẫu tạo mô sẹo / ∑ số mẫu cấy CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá đặc điểm sinh học nguồn gen loài Thạch tùng cưa 3.1.1 Đánh giá đặc điểm hình thái Thạch tùng cưa Hình 3.1 Hình thái Thạch tùng cưa thu Lâm Đồng Kết nghiên cứu cho thấy, Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng có dạng thân thảo, chiều cao trung bình khoảng 28 cm đến 29 cm, thân có dạng trịn, đường kính thân trung bình 0,23 cm Lá hình bầu dục, mép có cưa, rõ gân giữa, chiều dài trung bình cm, chiều rộng trung bình 0,32 cm Túi bào tử hình thận, màu vàng, mọc nách lá, rễ dạng chùm Kết phù hợp với nghiên cứu Võ Văn Chi Trần Hợp (1999), Phạm Hoàng Hộ (2003, 2006) Một số Thạch tùng cưa có biến đổi mặt hình thái phù hợp với mơi trường sống Trong tự nhiên, Thạch tùng cưa chủ yếu sinh sản mầm 3.1.2 Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng cưa Hình 3.5 Vi phẫu thân Thạch tùng cưa thu Lào Cai 11 Tuy nhiên, đa dạng di truyền mẫu khu vực nghiên cứu thấp (hệ số sai khác di truyền từ 0,06 đến 0,20) Do đó, cần có kế hoạch bảo tồn khai thác Thạch tùng cưa cách hợp lý khoa học 3.1.5 Xác định hàm lượng HupA Thạch tùng cưa Lào Cai Lâm Đồng 3.1.5.1 Xác định hoạt chất Huperzine A phương pháp TLC Qua kết chạy TLC, nhận định sơ hàm lượng HupA tổng hợp từ Thạch tùng cưa cao so với thân rễ Đồng thời, mẫu thu hái vào mùa thu có hàm lượng HupA cao mẫu thu hái vào mùa xuân Hình 3.14 Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng cưa thu Lào Cai CC: HupA chuẩn, 1: dịch chiết từ mùa thu, 2: dịch chiết từ thân mùa thu, dịch chiết từ thân mùa xuân, Dịch chiết từ mùa xuân Mũi tên vị trí vạch HupA 3.1.5.2 Xác định hàm lượng HupA phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng HupA mẫu Thạch tùng cưa thu hái Lâm Đồng cao so với Lào Cai Hàm lượng HupA cao thu từ mẫu mùa thu (tháng 9) 92,50 µg/g mẫu khơ mẫu mùa xn 75,40 µg/g mẫu khơ (tháng 3) Như vậy, hàm lượng HupA mẫu Thạch tùng cưa thu hái vào mùa thu (tháng 9) cao so với mẫu thu hái vào mùa xuân (tháng 12 3) 17,10 µg/ g khối lượng khơ Do đó, thời điểm thu hoạch Thạch tùng cưa thích hợp vào mùa thu (tháng 9), nên thu hái thân để phục vụ cho việc thu nhận hoạt chất HupA thay thu hái tồn Kết có ý nghĩa việc lựa chọn phận thời điểm thu hái Thạch tùng cưa để tách chiết thu hợp chất HupA cao từ loài này, đồng thời sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu Bảng 3.5 Hàm lượng HupA rễ, thân Thạch tùng cưa Tên mẫu DL1 DL2 DL3 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 Hàm lượng HupA (µg/g mẫu khô) Tháng năm 2015 Tháng năm 2015 Rễ Thân Lá Rễ Thân Lá 17,20 ± 47,70 ± 75,40 ± 18,20 ± 48,70 ± 92,50 ± 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 15,40 ± 42,30 ± 73,2 ± 17,30 ± 45,20 ± 83,50 ± 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 16,10 ± 44,70 ± 73,50 ± 17,80 ± 47,80 ± 90,20 ± 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 15,30 ± 39,50 ± 72,30 ± 16,80 ± 44,60 ± 78,40 ± 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 14,80 ± 34,70 ± 61,50 ± 15,70 ± 38,20 ± 66,10 ± 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 13,10 ± 35,10 ± 59,80 ± 16,10 ± 38,10 ± 62,40 ± 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 15,20 ± 37,30 ± 70,60 ± 16,30± 40,60 ± 73,50 ± 0,01 0,01 0,02 0,004 0,01 0,02 14,90 ± 35,20 ± 69,50 ± 16,60 ± 39,50 ± 70,70 ± 0,01 0,01 0,01 0,004 0,01 0,01 3.2 Nhân giống Thạch tùng cưa 3.2.1 Nghiên cứu nhân giống giâm hom thân 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chiều dài hom thân Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng hom thân có chiều dài cm cho hiệu tốt nhân giống vô tính lồi Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân hai vùng Lâm Đồng Lào Cai 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể giâm 13 Đối với nghiên cứu này, giá thể CT2 với hỗn hợp đất rừng + phân chuồng hoai mục + trấu hun (tỉ lệ 3:1:1) giá thể thích hợp cho hom thân Thạch tùng cưa phát triển so với giá thể lại 3.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng Bảng 3.9 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến phát triển Thạch tùng cưa sau tháng giâm hom Lào Cai Chất điều hòa Nồng độ (ppm) sinh trưởng (ngâm nước) 500 α-NAA 1500 (Xử lý – 2500 giây) 3500 5% LSD (ngâm nước) 10 α-NAA 20 (Xử lý phút) 30 40 5% LSD (ngâm nước) 50 IAA 70 (Xử lý 30 phút) 90 120 5% LSD (ngâm nước) 500 IBA 1000 (Xử lý 30 phút) 2000 3000 5% LSD Tỉ lệ rế (%) 31,11d 57,78c 70,00b 83,33a 61,11c 5,61 30,00d 57,78c 80,00a 67,78b 62,22c 4,99 32,22e 51,11d 71,11b 81,11a 63,33c 7,34 31,11d 57,78c 84,44a 67,78b 62,22bc 7,98 Số rễ Số 1,39 ± 0,09e 1,66 ± 0,07d 1,83 ± 0,08c 2,36 ± 0,06a 1,99 ± 0,06b 0,10 1,37 ± 0,09d 1,69 ± 0,07c 1,97 ± 0,06a 1,91 ± 0,06ab 1,8 ± 0,07b 0,12 1,38 ± 0,05d 1,58 ± 0,07c 1,48 ± 0,05c 1,98 ± 0,07a 1,82 ± 0,06b 0,14 1,36 ± 0,09c 1,42 ± 0,07c 2,38 ± 0,06a 2,07 ± 0,05b 1,97 ± 0,07b 0,11 1,57 ± 0,07e 1,97 ± 0,08d 2,12 ± 0,09c 2,59 ± 0,06a 2,34 ± 0,08b 0,06 1,58 ± 0,07c 2,04 ± 0,08c 2,33 ± 0,07a 2,29 ± 0,08a 2,19 ± 0,08b 0,09 1,57 ± 0,07d 1,96 ± 0,08c 1,92 ± 0,09c 2,38 ± 0,06a 2,14 ± 0,08b 0,05 1,58 ± 0,08e 1,64 ± 0,08d 2,61 ± 0,06a 2,43 ± 0,07b 2,18 ± 0,09c 0,09 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05 Kết nghiên cứu vùng Lâm Đồng Lào Cai cho thấy nhóm chất điều hồ sinh trưởng α - NAA nồng độ cao sử dụng 14 α - NAA 2500 ppm (4 - giây) cho hiệu tốt nồng độ lại; nhóm chất điều hồ sinh trưởng α – NAA nồng độ thấp sử dụng α – NAA 20 ppm (5 phút) cho hiệu tốt hơn; sử dụng IBA 1000 ppm (30 phút) kích thích tạo tạo rễ hom thân giâm tốt so với nồng độ khác lơ thí nghiệm; Đối với IAA nên sử dụng nồng độ 90 ppm (30 phút) để thúc đẩy sinh trưởng Thạch tùng cưa Bảng 3.10 So sánh hiệu chất điều hòa sinh trưởng đến phát triển hom thân Thạch tùng cưa hai vùng nghiên cứu Chất Nồng Thời gian điều hòa độ xử lý sinh (ppm) Lâm trưởng Đồng α - NAA 2500 - giây α - NAA 20 phút IAA 90 30 phút IBA 1000 30 phút 5% LSD α - NAA 2500 - giây α - NAA 20 phút Lào IAA 90 30 phút Cai IBA 1000 30 phút 5% LSD Tỉ lệ rễ (%) Số rễ Số 87,78a 81,11b 83,33a 88,89a 6,56 84,44a 81,11b 82,22b 85,56a 2,22 2,86a ± 0,07 2,07b ± 0,10 2,04b ± 0,09 2,81a ± 0,10 0,13 2,38a ± 0,07 1,96b ± 0,07 1,97b ± 0,07 2,38a ± 0,06 0,03 2,80a ± 0,08 2,33b ± 0,10 2,44b ± 0,11 2,73a ± 0,10 0,072 2,58a ± 0,06 2,35b ± 0,07 2,37b ± 0,06 2,64a ± 0,06 0,07 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05 Kết so sánh ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng tốt hai vùng Lâm Đồng Lào Cai cho thấy sử dụng α - NAA 2500 ppm (4-6 giây) IBA nồng độ 1000 ppm (xử lý 30 phút) cho hiệu tốt so với hai chất điều hoà sinh trưởng (α - NAA 20 ppm IAA 90 ppm) trình sinh trưởng hom thân Thạch tùng cưa (Bảng 10) Do đó, nghiên cứu giâm hom thân Thạch tùng cưa, xử lý hom thân α - NAA nồng độ 2500 ppm thời gian - giây IBA 1000 ppm vịng 30 phút trước 15 trồng để kích thích phát triển hom thân Thạch tùng cưa 3.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng độ sâu hom thân giâm Kết nghiên cứu cho thấy độ sâu hom thân giâm giâm xuống giá thể CT2 3,5 cm tốt cho sinh trưởng hom thân Thạch tùng cưa so với độ sâu hom thân giâm xuống cm, 2,5 cm, cm cm mức sai khác có ý nghĩa thống kê Do đó, độ sâu hom thân giâm thích hợp cho phát triển hom thân Thạch tùng cưa 3,5 cm 3.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ bón phân Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng phân chuồng (phân bị) để bón thúc cho sau tháng giâm hom thân thúc đẩy sinh trưởng Thạch tùng cưa tốt so với loại phân bón khác phân NPK, phân xanh phân vi sinh Sông Gianh 3.2.1.6 Nghiên cứu thời điểm loài Thạch tùng cưa Kết nghiên cứu cho thấy thời điểm ngơi thích hợp sau tháng giâm hom thân đạt chiều cao - cm; đường kính thân 0,19 - 0,25 cm, có thêm - mới, khỏe mạnh Từ kết trên, đưa số khâu quy trình nhân giống Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân sau: Sử dụng hom thân có chiều dài cm, cắt vát đầu Sau đó, hom thân xử lý dung dịch chất điều hòa sinh trưởng α - NAA 2500 ppm thời gian - giây ngâm dung dịch IBA 1000 ppm thời gian 30 phút Tiếp theo, hom thân giâm vào bầu đất với giá thể CT2 (hỗn hợp giá thể đất rừng trộn phân chuồng hoai mục trấu hun với tỉ lệ 3:1:1), đưa vào bầu, giâm hom thân xuống độ sâu 3,5 cm so với gốc hom thân Bầu ươm Thạch tùng cưa chăm sóc theo dõi vườn ươm cho thấy 16 khả sinh trưởng tốt Hình 3.19 Cây Thạch tùng cưa vườn ươm Lâm Đồng 3.2.2 Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa nuôi cấy mô 3.2.2.1 Nhân giống in vitro Thạch tùng cưa phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh a Ảnh hưởng chất khử trùng đến mẫu cấy Kết khử trùng mẫu Thạch tùng cưa cho thấy sử dụng HgCl2 0,10% phút cho tỉ lệ mẫu bệnh 13,61% tỉ lệ mẫu tạo chồi 46,08% tương đối tốt so với cơng thức thí nghiệm cịn lại (Bảng 3.16) Bảng 3.16 Ảnh hưởng chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng cưa sau 30 ngày nuôi cấy Nồng độ (%) 0,05 C2H5OH 0,05 70 % 0,05 30 giây 0,10 0,10 0,10 0,15 0,15 0,15 5% LSD HgCl2 Thời gian (phút) 7 Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) bật chồi (%) 4,44h 66,22a NaClO 5,28g 47,62b f 20% 8,89 40,30bc f phút 8,06 48,52b e 13,61 46,08b d 13,89 31,99cd c 16,39 27,11de b 17,22 22,62de a 25,56 18,46e 0,73 9,81 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P< 0,05 Vì vậy, chúng tơi lựa chọn khử trùng mẫu Thạch tùng cưa 17 dung dịch C2H5OH 70% 30 giây, HgCl2 0,10% phút cuối dung dịch NaClO 20% phút Các mẫu Thạch tùng cưa vô trùng chuyển vào nuôi cấy môi trường MS Sau 30 ngày nuôi cấy, mẫu cấy cho tỉ lệ bật chồi cao, thân xanh, phát triển tốt (Hình 3.22) Hình 3.22 Mẫu Thạch tùng cưa sau 30 ngày nuôi cấy môi trường MS b Ảnh hưởng mơi trường khống đến ni cấy Thạch tùng cưa Bảng 3.17 Ảnh hưởng mơi trường khống đến ni cấy chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy Mơi Chiều Số Kích thước trường cao chồi nuôi cấy (cm) (lá) Dài Rộng (cm) (cm) MS 1,70d 4,67b 0,75c 0,20c 1/2MS 1,94b 6,33a 0,86b 0,23b 1/4MS 2,19a 7,33a 0.94a 0,24a 1/6MS 1,78c 5,00b 0.73d 0,19d WPM 1,54f 2,33c 0.64f 0,18d B5 1,57e 2,67c 0,69e 5% LSD 0,01 1,03 0,01 0,18d 0,01 Đặc điểm chồi Phát triển chậm nhiều chồi dị dạng, thân có màu xanh vàng, quăn Phát triển mức trung bình, thân xanh, xanh Phát triển tốt, thân mập khỏe, xanh đậm Phát triển chậm, nhiều chồi dị dạng, thân có màu xanh vàng, quăn Không phát triển, vàng chết Không phát triển, vàng chết Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P< 0,05 Kết nghiên cứu cho thấy, mơi trường thích hợp cho 18 sinh trưởng phát triển Thạch tùng cưa ¼ MS với chiều cao chồi (2,19 cm), số (7,33 lá), kích thước lá: dài 0,94 cm, rộng 0,24 cm, chất lượng chồi tốt, mập, xanh đậm (Bảng 3.17) Hình 3.23 Chồi Thạch tùng cưa ni cấy mơi trường ¼ MS Mơi trường 1/4 MS lựa chọn làm môi trường cho nghiên cứu nhân nhanh chồi Thạch tùng cưa in vitro (Hình 3.23) c Ảnh hưởng BA kinetin đến tạo cụm chồi Khi sử dụng chất điều hoà sinh trưởng BA nồng độ 0,5 mg/ l, kết cho thấy số mẫu tạo cụm chồi (75,67 chồi), số chồi phát sinh/ mẫu (5,65 chồi), chiều cao chồi (1,60 cm), chất lượng chồi tốt sai khác có ý nghĩa thống kê so với nồng độ BA lại (Bảng 3.18) Bảng 3.18 Ảnh hưởng BA đến tạo cụm chồi Thạch tùng cưa Số chồi Chiều Đặc điểm cụm chồi chồi Chất điều Nồng Số mẫu phát cao hòa sinh độ tạo cụm sinh/mẫu chồi trưởng (mg/l) chồi cấy (cm) Đối Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, thân chứng 36,33d 3,34d 0,91d xanh, phát triển chậm Tạo cụm chồi trung bình, chồi ít, BA 0,1 41,33c 4,06c 1,21d thân xanh, phát triển chậm Tạo cụm chồi nhanh, chồi nhiều, BA 0,5 75,67b 5,65a 1,60a thân xanh đậm, phát triển tốt Tạo cụm chồi nhanh, chồi nhiều, BA 1,0 76,67ab 5,20b 1,58b thân nhỏ, thân mảnh Tạo cụm chồi nhanh, chồi nhiều, BA 1,5 77,67a 5,12b 1,44c thân nhỏ, thân mảnh 5% LSD 1,03 0,10 0,02 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P< 0,05 19 Đối với Kinetin, sử dụng nồng độ mg/ l cho hiệu tốt nồng độ khác mức sai khác có ý nghĩa tạo chồi Thạch tùng cưa với số mẫu tạo cụm chồi đạt 77,33 chồi, số chồi phát sinh/ mẫu 6,02 chồi chiều cao chồi 1,61 cm (Bảng 3.19) Bảng 3.19 Ảnh hưởng Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng cưa Số chồi Chất điều Nồng Số mẫu Chiều phát hòa sinh độ tạo cụm cao chồi sinh/mẫu trưởng (mg/l) chồi (%) (cm) cấy Đối chứng 36,33e 3,34e Kinetin 0,1 39,33d 3,54d Kinetin 0,5 55,67c 4,91c Kinetin 1,0 77,33b 6,02a Kinetin 1,5 79,67a 1,46 5,78b 0,06 5% LSD Đặc điểm cụm chồi chồi Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, 0,91e thân xanh, phát triển chậm Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, 1,21d thân xanh, phát triển chậm Tạo cụm chồi trung bình, 1,37c chồi ít, thân xanh, phát triển chậm Tạo cụm chồi nhanh, chồi 1,61a nhiều, thân xanh đậm, phát triển tốt Tạo cụm chồi nhanh, chồi 1,52b nhiều, thân xanh 0,02 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05 Hình 3.24 Cụm chồi Thạch tùng cưa ni cấy mơi trường ¼ MS có bổ sung mg/l kinetin Kết so sánh hiệu tác động hai chất điều hòa sinh trưởng BA 0,5 mg/l kinetin mg/l cho thấy sử dụng kinetin mg/l 20 cho số lượng chồi/ mẫu (6,02) cao so với sử dụng BA 0,5 mg/l (5,61) mức sai khác có ý nghĩa thống kê 95% Do đó, mơi trường thích hợp cho việc nhân nhanh chồi Thạch tùng cưa mơi trưịng1/4 MS có bổ sung kinetin mg/l (Hình 3.24) d Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến rễ chồi Thạch tùng cưa Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng nồng độ IBA 1,0 mg/ l NAA 1,0 mg/ l có hiệu tốt cho trình phát triển rễ Thạch tùng cưa so với công thức lại (bảng 3.21 3.22) Bảng 3.21 Ảnh hưởng IBA đến rễ chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy Chất điều Nồng Tỉ lệ hòa sinh độ chồi trưởng (mg/l) rễ (%) ĐC 0 IBA 0,1 IBA 0,5 13,62c IBA 1,0 24,92b IBA 1,5 25,80a 5% LSD 0,73 Số rễ/ Chiều dài Chất lượng rễ chồi rễ TB (rễ) (cm) 0 Không rễ 0 Không rễ 1,31c 0,83c Rễ ngắn, thân rễ nhỏ Rễ dài, thân rễ to 2,33b 1,17a 2,64a 0,91b Rễ dài trung bình, thân rễ nhỏ 0,02 0,01 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05 Bảng 3.22 Ảnh hưởng α - NAA đến rễ chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy Chất điều Nồng Tỉ lệ Số rễ/ Chiều dài Chất lượng rễ hòa sinh độ chồi chồi rễ trung trưởng (mg/l) rễ (%) (rễ) bình (cm) ĐC 0 0 Khơng rễ α - NAA 0,1 0 không rễ α - NAA 0,5 8,99c 1,19c 0,86c Rễ dài trung bình, thân rễ nhỏ Rễ tương đối dài, thân rễ α - NAA 1,0 19,42b 1,82b 1,12a trung bình α - NAA 1,5 20,58a 2,08a 0,81b Rễ ngắn, thân rễ nhỏ 5% LSD 0,79 0,04 0,01 Chú ý: Trong cột, chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05 Kết so sánh ảnh hưởng IBA 1,0 mg/ l NAA 1,0 mg/ l 21 phát triển rễ chồi Thạch tùng cưa cho thấy tiêu phát triển rễ (tỉ lệ chồi rễ, số rễ/ chồi, chiều dài rễ) sử dụng IBA mg/l (lần lượt 24,64 %; 2,34 rễ 1,17 cm) cao α NAA mg/l (20,00%; 1,83 rễ 1,13 cm) Vì vậy, chất điều hoà sinh trưởng IBA mg/l sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích phát triển rễ chồi Thạch tùng cưa (Hình 3.25) Hình 3.25 Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi môi trường 1/4 MS có bổ sung mg/l IBA Các Thạch tùng cưa in vitro có chiều cao chồi từ - cm cấy chuyển sang giá thể CT2 dễ dàng phát triển khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót đạt 97% (Hình 3.26) Hình 3.26 Cây Thạch tùng cưa sau 120 ngày nuôi cấy giá thể CT2 3.2.2.2 Nhân giống loài Thạch tùng cưa nuôi cấy mô sẹo a Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến hình thành mơ sẹo Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường ¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/ l kinetine + mg/ l glutamin mơi trường thích hợp cho ni cấy mơ sẹo lồi Thạch tùng cưa b Tái sinh chồi từ mô sẹo đỉnh chồi cảm ứng mơi trường ¼ MS Hình 3.29 Cụm chồi Thạch tùng cưa hình thành từ mơ sẹo sau tháng ni cấy 22 Kết thí nghiệm chuyển mơ sẹo sang mơi trường 1/4 MS có bổ sung mg/l kinetin cho thấy khối mô sẹo tạo mầm đa chồi Sau tháng cấy chuyển, tất mô sẹo tạo đa chồi với số chồi trung bình đạt 22,46 chồi/ mơ sẹo, chiều cao chồi từ 0,90 - 2,40 cm Thân chồi xanh đậm, mập mạp, phát triển tốt (Hình 3.29) Sau đó, cụm chồi chuyển sang mơi trường ¼ MS bổ sung mg/l IBA để cảm ứng tạo rễ Sau tháng cấy chuyển, kết cho thấy cụm chồi Thạch tùng cưa tạo rễ (Hình 3.30) Hình 3.30 Cây Thạch tùng cưa in vitro ni cấy mơi trường ¼ MS + mg/l IBA 3.2.2.3 Xác định hàm lượng HupA Thạch tùng cưa nuôi cấy mô phương pháp HPLC Hàm lượng HupA Thạch tùng cưa nuôi cấy mô thu tương đối cao (300 µg/g khối lượng khơ ) cao so với tự nhiên, nguồn vật liệu tiềm cho việc thu nhận hoạt chất HupA Kết phù hợp với nghiên cứu Szypula cộng (2005), Ma Gang (2008) công bố nuôi cấy mô sản xuất hàm lượng HupA cao so với trồng tự nhiên Từ nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa phương pháp nuôi cấy mô, rút số nhận xét sau: Mơi trường thích hợp cho ni cấy chồi đỉnh mơi trường ¼ MS, cho ni cấy mơ sẹo đỉnh chồi môi trường 1/4 MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + mg/l glutamin Môi trường để nhân nhanh chồi Thạch 23 tùng cưa tạo rễ mơi trường ¼ MS có bổ sung mg/l kinetin mơi trường ¼ MS có bổ sung mg/l IBA Cây Thạch tùng cưa nhân giống nuôi cấy mô giữ hoạt chất HupA với hàm lượng cao KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Cây Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng phân bố độ cao 900 m so với mực nước biển Cây Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng phân bố độ cao 900 m Chúng có đặc điểm tương đồng hình thái giải phẫu, số có biến đổi hình thái để thích nghi với điều kiện mơi trường sống Các mẫu Thạch tùng cưa vùng nghiên cứu có độ đa dạng di truyền thấp với hệ số sai khác di truyền từ 0,06 đến 0,20 Các mẫu Thạch tùng cưa phân bố hai khu vực Lào Cai Lâm Đồng hình thành nhóm riêng, hệ số đa dạng di truyền hai nhóm cao mẫu nhóm (dao động từ 0,33 đến 0,48) Kết có ý nghĩa định hướng cho việc bảo tồn phát triển nguồn gen loài Thạch tùng cưa Hàm lượng HupA mẫu Thạch tùng cưa thu Lâm Đồng cao mẫu thu Lào Cai; hàm lượng HupA cao so với thân rễ; Thạch tùng cưa thu hái vào mùa thu có hàm lượng HupA cao so với thu hái vào mùa xuân Kết có ý nghĩa định hướng việc lựa chọn phận thời điểm thu hái Thạch tùng cưa để tách chiết thu hợp chất HupA cao Đã xác định số khâu làm sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống lồi Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân nuôi cấy mô 24 Một số yêu cầu vật liệu phương thức giâm hom thân xác định bao gồm: sử dụng hom thân dài cm, xử lý α - NAA 2500 ppm (4 - giây) IBA 1000 ppm (30 phút) Hom thân giâm sâu 3,5 cm vào giá thể chứa đất rừng, phân chuồng hoai mục, trấu hun với tỉ lệ 3:1:1 Tỷ lệ sống sót sau ngơi đạt 97,78% Đã xác định mơi trường thích hợp cho ni cấy chồi đỉnh mơi trường ¼ MS; môi trường tạo mô sẹo đỉnh chồi môi trường 1/4 MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + mg/l glutamin; môi trường nhân nhanh chồi ¼ MS có bổ sung mg/l kinetin; mơi trường tạo rễ ¼ MS có bổ sung mg/l IBA Phương pháp nuôi cấy mô sẹo cho hệ số nhân chồi cao gấp 3,5 lần so với phương pháp ni cấy chồi đỉnh Tỉ lệ sống sót giá thể đạt 97% Cây Thạch tùng cưa in vitro có chứa hàm lượng Hup A cao (300 µg/ g khối lượng khô) KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng cưa hình thức ni cấy bào tử hình thức sinh sản hữu tính giúp cải thiện vốn gen tăng đa dạng di truyền quần thể Tiếp tục nghiên cứu phương pháp ni cấy mơ sẹo có khả sinh phơi mơ phơi soma lồi Thạch tùng cưa để nhân giống nguồn gen Thạch tùng cưa với quy mô lớn Xây dựng quy trình trồng, chăm sóc thu hoạch Thạch tùng cưa Lào Cai Lâm Đồng với quy mô lớn DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Vũ Thị Ngọc, Phạm Thị Hạnh, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Tiến Đạt, Lê Thị Bích Thủy, Định tính định lượng Huperzine A Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2016, 14 (3), 473-478 Ho Thi Huong, Ngo Thi Thuy Linh, Le Thi Lan Anh, Le Thi Bich Thuy, Evaluation of the genetic diversity of Huperzia serrate by RADP markers, Academia Journal of Biology, 2018, 40 (4), 85-90 Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Bùi Tuấn Anh, Hồ Thị Hương, Ngô Thị Thùy Linh, Lê Thị Bích Thủy, Nguyễn Đức Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài Thạch tùng cưa Huperzia serrata phương pháp giâm cành, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ, 2018, 1411-1416 Le Thi Lan Anh, Bui Tuan Anh, Giang Xuan Sang, Ton That Huu Dat, Ho Thi Huong, Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, A study on vegetative propagation of Huperzia serrata by cuttings in Sa Pa, Lao Cai, Academia Journal of Biology, 2019, 41 (3), 107113 Le Thi Lan Anh, Ho Thi Huong, Ngo Thi Thuy Linh, Ton That Huu Dat, Le Thi Bich Thuy, Nguyen Duc Thanh, Tissue culture of Huperzia serrata by shoot tip culture technique, CASEAN-6proceedings, 2019, ISBN 978-604-931-088-5, pp 197-202 ... nhân giống loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb Ex Murray) Trevis) thu Lào Cai Lâm Đồng? ?? Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích số đặc điểm sinh học xác định... đa hình DNA lồi Thạch tùng cưa Xác định hàm lượng huperzine A Thạch tùng cưa tự nhiên thu thập Lào Cai Lâm Đồng Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng cưa i Nhân giống Thạch tùng cưa hình thức giâm... Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học tính đa hình DNA loài Thạch tùng cưa i Đặc điểm hình thái, giải phẫu lồi Thạch tùng cưa ii Đặc điểm sinh thái học loài Thạch tùng cưa iii