Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men từ quả hồng xiêm (manilkara zapota (l ) p royen) có khả năng chịu được ethanol ở nồng độ cao để lên men rượu vang sapo

Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 11 - 2021 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG NẤM MEN TỪ QUẢ HỒNG XIÊM (Manilkara zapota (L.) P Royen) CÓ KHẢ NĂNG CHỊU ĐƯỢC ETHANOL Ở NỒNG ĐỘ CAO ĐỂ LÊN MEN RƯỢU VANG SAPO Nguyễn Văn Bá*, Nguyễn Thị Thu Thảo, Nguyễn Thành Luân, Phạm Thanh Chính Châu Nhựt Thắng Khoa Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Tây Đô (*Email: nguyenvanba84@gmail.com) Ngày nhận: 18/12/2020 Ngày phản biện: 12/01/2021 Ngày duyệt đăng: 20/02/2021 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập tuyển chọn dòng nấm men từ dịch hồng xiêm (sapo) để lên men rượu vang sapo, góp phần đa dạng hóa rượu vang trái Nghiên cứu phân lập dòng nấm men từ dịch sapo lên men; khảo sát khả lên men đường saccharose dòng nấm men phân lập; khảo sát khả chịu ethanol dòng nấm men; xác định dòng nấm men lên men tốt dịch sapo Kết nghiên cứu phân lập 21 dịng nấm men, có dịng nấm men có khả lên men đường saccharose có khả chịu ethanol 12% v/v; Khảo sát hoạt tính lên men dịng nấm men tuyển chọn cho thấy nghiệm thức dịch lên men 24oBx, pH 4,5, nấm men S6 sau 17 ngày lên men cho rượu vang sapo có nồng độ ethanol đạt 10,1% v/v, pH lượng đường sót 4,3 8,23 g/ L khác biệt so với nấm men thương mại dòng nấm men lại (P50% kính hiển vi sau 24 g môi trường lỏng chứa nổng độ ethanol tương ứng Khả lên men rượu vang sapo nâm men cách so sánh độ rượu chưng cất 100 mL đo 20 oC tính theo khối lượng rượu vang sapo Số 11 - 2021 Số liệu thu thập phân tích thống kê phần mềm SPSS 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm nhận dạng sơ dòng nấm men phân lập Theo mơ tả hình thái, phân loại giống nấm men Saccharomyces khóa phân loại theo Kreger, (1984), Lương Đức Phẩm, (2006), dòng nấm men phân lập nhận diện thuộc giống Saccharomyces (Bảng 1) Bảng Hình dạng, kích thước, đặc điểm dịng nấm phân lập Dịng nấm men Hình dạng nấm men S1 Elip ngắn S2 Elip ngắn S3 Kích thước nấm men (Dài x rộng) (m) 2,5 x Hình thức sinh sản Đặc điểm khuẩn lạc Nẩy chồi tròn đều, màu trắng đục, bìa cưa, mơ, bề mặt sần sùi, đường kính mm 1,7 x 0,5 Nẩy chồi trịn đều, màu trắng đục, bìa cưa, bề mặt sần sùi, đường kính 2,5 mm Bầu dục nhỏ 2,5 x Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, lài, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S5 Elip ngắn x 1,5 Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính mm S6 Bầu dục lớn 3x2 Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S7 Elip ngắn 2,5 x 1,7 Sinh nội bào tử khơng trịn đều, màu trắng đục, bìa cưa, mơ, bề mặt sần sùi, đường kính 2,5 mm S8 Elip ngắn x 1,8 Sinh nội bào tử khơng trịn đều, màu trắng đục, bìa cưa, lài, bề mặt sần sùi, đường kính mm S9 Bầu dục nhỏ 1,5 x Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S10 Bầu dục nhỏ x 1,8 Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, lài, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,7 mm 220 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 11 - 2021 S11 Elip dài 5x2 Sinh nội bào tử khơng trịn đều, màu trắng đục, bìa cưa, lài, bề mặt sần sùi, đường kính mm S12 Bầu dục nhỏ 1,5 x Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính mm S13 Bầu dục nhỏ x 1,5 Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S14 Elip ngắn 2x1 Nẩy chồi khơng trịn đều, màu trắng đục, bìa cưa, lài, bề mặt sần sùi, đường kính mm S15 Elip ngắn 2,5 x 1,5 Sinh nội bào tử tròn đều, màu trắng đục, bìa cưa, mơ, bề mặt sần sùi, đường kính mm S16 Bầu dục nhỏ 1,5 x Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S17 Bầu dục nhỏ 1,8 x Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 1,5 mm S18 Bầu dục nhỏ 1,5 x Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính mm S19 Bầu dục nhỏ 1,5 x 1,2 Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính mm S20 Bầu dục lớn 2x1 Nẩy chồi tròn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính 2,5 mm S21 Bầu dục x 1,5 Nẩy chồi trịn đều, màu trắng sữa, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn bóng, đường kính mm Dựa vào hình dạng tế bào, nhóm đặc trưng thể Hình a b c Hình Hình dạng nhóm nấm men đặc trưng a) Hình bầu dục nhỏ, b) Hình elip dài, c) Hình elip ngắn, d) Bầu dục lớn 221 d Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 11 - 2021 nấm men phân lập có khả lên men đường saccharose 1% 3.2 Khả lên men saccharose dòng nấm men phân lập Kết Bảng cho thấy có dịng S20, S2, S6 S4 tổng số 21 dịng Bảng Chiều cao cột khí CO2 chng Durham số dịng nấm men lên men dịch đường saccharose 1% theo thời gian Dòng nấm men S20 S2 Chiều cao cột khí CO2 chuông Durham (mm) 13 25 33 49 3,10b 0,79 1,70a 0,17 6,27b 0,64 1,77a 0,25 8,60b 0,52 2,17a 0,28 12,10b 1,49 - 13,83b 2,46 - - S6 1,50a 0,86 1,77a 0,92 - 0,77  0,75 0,83  0,76 3,60a 3,38 - - S4 2,70a 1,8 - - - a a Ghi chú: số cột mang chữ khác có khác biệt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 3.3 Khả chịu ethanol dòng nấm men phân lập Khả chịu ethanol 21 dòng nấm men trình bày Bảng Kết cho thấy, tất dòng nấm men sống, phát triển mơi trường Hansen có nồng độ 8% ethanol (+ đến +++) Ở nồng độ 12% ethanol, lại dòng S20, S5, S7 phát triển, dịng cịn lại sống yếu chết, nghĩa khơng có khả lên men tiếp tục nồng độ nảy, đáng ý có dịng S6 có khả lên men saccharose Do có bốn dịng nấm men có khả chịu ethanol đến 12% đươc chọn để lên men rượu vang sapo 222 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 11 - 2021 Bảng Kết xác định khả chịu ethanol dòng nấm men phân lập Dòng nấm men S12 S16 S19 S14 S15 S8 S17 S18 S9 S10 S21 S13 S20 S5 S2 S11 S6 S1 S3 S7 S4 8% +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ + + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Nồng độ ethanol 10% + ++ ++ ++ ++ ++ 12% + + + + + + 14% - + + ++ ++ + + + + + ++ + + + + - + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ Chú thích: “+++”: tế bào sống 100%, “++” 50% tế bào sống; “+“: 50% tế bào sống, “-“: tế bào nấm men chết hoàn toàn 3.4 Khả lên men dịch sapo dòng nấm men phân lập Khả lên men dịch sapo dòng nấm men tuyển chọn thể Bảng Sau đầu lên men, chiều cao cột khí CO2 chng Durham bắt đầu có khác biệt ý nghĩa khả lên men 21 dòng nấm men, đến thứ 33 có dịng nấm men sinh khí CO2 chứa đầy chng Durham (các dịng S8, S17, S18, S9, S21 S20), đến thứ 37, có đến 15 dịng nấm men sinh khí CO2 chứa đầy chng Durham, có dịng S6 223 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 11 - 2021 Bảng Chiều cao cột khí CO2 chng Durham theo thời gian lên men dịch sapo dịng nấm men phân lập Chiều cao cột khí CO2 chng Durham (mm) theo thời gian Dịng nấm men 13 29 33 37 S12 4,50fg 0,50 16,83h 1,04 21,00g 1,32 22,86fg 1,10 24,00 S16 S19 S14 S15 S8 S17 S18 S9 S10 S21 S13 S20 S5 S2 S11 S6 S1 S3 S7 S4 1,00ac 1,00 6,00h 1,00 3,33def 0,57 4,50fg 0,50 1,00a 1,00 4,50fg 0,50 5,16gh 0,76 1,50abc 1,32 2,16abcd 0,76 3,00de 1,00 4,16efg 0,76 4,83gh 0,76 0,91a 0,14 2,83cde 0,76 2,50bcd 0,50 0,93a 0,90 1,16ab 0,76 1,50abc 0,50 0,76a 0,25 2,83cde 0,28 6,27bc 1,41 15,60gh 1,96 7,50c 1,32 12,50def 2,29 3,33a 1,44 14,00efg 1,00 14,33efgh 1,89 4,83ab 1,04 7,43c 0,60 14,93fgh 0,90 16,83h 0,76 15,17gh 1,25 13,60efg 1,50 6,83bc 1,04 13,50efg 1,80 7,50c 0,86 6,50bc 1,50 10,16d 0,76 5,50abc 1,32 11,83de 1,04 13,27bc 1,10 22,83ghi 1,04 10,60a 2,25 13,83bcd 3,01 23,67ghi 0,57 23,93i 0,11 23,60ghi 0,69 23,67ghi 0,57 14,60cde 2,15 23,33ghi 1,15 21,17gh 0,76 23,83hi 0,28 18,43f 0,92 11,33ab  2,08 21,83ghi 0,76 13,66bcd 1,75 12,60abc 1,50 16,00def 1,00 13,83bcd 1,75 16,66ef  1,52 19,76bcd 1,50 23,26fg 0,64 20,86cde 1,10 21,16de 1,60 24,00g 0,00 24,00g 0,00 24,00g 0,00 24,00g 0,00 21,93ef 0,90 24,00g 0,00 23,50fg 0,50 24,00g 0,00 23,66fg 0,57 19,43bc 0,60 23,50fg 0,50 19,60bcd 1,50 18,83ab 1,60 22,50efg 1,32 17,83a 1,04 20,26bcd 0,64 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 24,00 Ghi chú: số liệu kết trung bình lần lặp lại, số cột mang chữ khác có khác biệt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 3.5 Hoạt tính lên men rượu vang sapo dòng nấm men chọn Trên sở bước nghiên cứu, dòng nấm men (S2, S4, S6, S20) chọn để đánh giá khả lên men dịch sapo bổ sung saccharose Kết Bảng cho thấy hoạt tính lên men rượu vang sapo thể qua hàm lượng chất khơ hịa tan (HLCKHT) giảm sau 17 ngày lên men Ở nghiệm thức có 24 o Bx với dịng nấm men S6, sau 17 ngày lên men, rượu vang sapo đạt 10,10 % (v/v) ethanol, hàm lượng chất khơ hịa tan 9,17 oBx, đường sót vừa phải 8,23g/L cho vị hài hịa, cảm quan (Kurtzman and Fell, 1998), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với sản phẩm rượu vang sapo nấm men thương mại dòng nấm men cịn lại So sánh với nghiên 224 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ cứu trước Nguyễn Minh Thủy ctv., (2011), lên men sản xuất rượu vang nốt có hàm lượng ethanol đạt 13,36% v/v; Nguyễn Minh Thủy ctv., (2014) nghiên cứu lên men sản xuất rượu vang sim có hàm lượng ethanol đạt 13,43% v/v; Huỳnh Xuân Phong ctv., (2017), rượu vang khóm đạt 10,03% v/v ethanol; Đồn Thị Kiều Tiên ctv., (2018), rượu vang trái giác đạt 9,9% v/v ethanol; Nguyễn Thị Niềm ctv., (2018), rượu vang cà na đạt 7,44% v/v ethanol; Tống Thị Ánh Ngọc ctv., (2018), lên men rượu vang xơ mít Thái đạt 15% v/v ethanol So sánh với kết Số 11 - 2021 cho thấy, nguồn nguyên liệu, chủng nấm men tuyển chọn điều kiện lên men có ảnh hưởng quan trọng đến hàm lượng ethanol sản phẩm Do cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp sưu tầm, tuyển chọn thêm nấm men lên men tốt Giá trị pH sản phẩm rượu vang sapo giảm sau 17 ngày lên men Hiện tượng giảm pH hoạt động nấm men q trình lên men kỵ khí sinh CO2 số acid hữu sinh làm giảm pH, giá trị pH 4,31 rượu vang sapo tương đối hài hòa (Lương Đức Phẩm, 2006) Bảng Hoạt tính lên men rượu vang sapo dòng nấm men qua tiêu độ cồn, hàm lượng chất khơ hịa tan (HLCKHT), pH đường sót sau 17 ngày lên men HLCKHT trước lên men (oBx) 18 22 24 Mẫu HLCKHT sau lên men (oBx) pH sau lên men Độ cồn % (V/v) Đường sót sau lên men (g/ L) ĐC S2 S4 S6 S20 ĐC S2 S4 S6 S20 7,17 0,4a 6,23 0,25bc 6,17 0,28bc 5,90 0,1ab 6,50 0,3c 9,63 0,15d 9,00 0,20c 9,37 0,35b 9,60 0,20a 9,37 0,15cd 3.90 0,03ab 4.01 0,56ab 4.37 0,04b 4.36 0,06b 3.65 0,05a 3.69 0,08a 3.78 0,01b 4.37 0,03c 4.32 0,02c 3.67 0,02a 6,83 0,28b 6,17 0,28a 7,17 0,28b 9,07 0,11c 7,17  0,28b 7,50 0,50a 8,37 0,32b 8,53 0,05b 9,33 0,28c 8,17 0,28b 3,27 0,42c 3,73 0,07b 2,65 0,18a 1,88 0,12a 2,38 0,34a 8,25 0,47c 8,00 0,20b 9,01 0,65e 8,75 0,05a 9,10  0,20d ĐC S2 S4 S6 S20 12,27 0,25d 10,20 0,20b 11,30 0,30c 9,17 0,15a 13,47 0,25c 3.73 0,03b 4.27 0,03c 3.65 0,04a 4.31 0,02c 3.65 0,04a 8,07 0,11b 8,93 0,11c 8,07 0,11b 10,10 0,10d 7,50 0,50a 10,17 0,35b 9,83 0,58b 10,15 0,31b 8,23 0,26a 12,00 0,70c (Ghi chú: chữ a,b,c cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức mức ý nghĩa P < 0,05 225 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 3.6 Định danh nấm men phân lập S6 phương pháp giải trình tự gen Chủng nấm men S6 định danh phương pháp giải trình tự phân tích trình tự gen 28S rRNA Kết giải trình tự đoạn gen 28S rRNA chủng nấm men S6 sau: GGAGCGGACGACGTGTAAAGA GCGTCGGACCTGCGACTCGCCTGA AAGGGAGCGAAGCTGGCCGAGCG AACTAGACTTTTTTCAGGGACGCT Số 11 - 2021 TGGCGGCCGAGAGCGAGTGTTGC GAGACAACAAAAAGCTCGACCTC AAATCAGGTAGGAATACCCGCTG AACTTAAGCAT Trình tự đoạn gen so sánh với gen 28S rRNA nấm men ngân hàng gen NCBI phần mềm BLAST, kết cho thấy, đoạn gen 28S rRNA dịng nấm men S6 có độ tương đồng đến 98.84%so với trình tự gen 28S rRNA Saccharomyces cerevisiae (MF662380.1) (Hình 2) Hình So sánh trình tự gen 28S rRNA S6 chủng Saccharomyces cerevisiae với số đăng ký MF662380.1 KẾT LUẬN Từ 21 dòng nấm men phân lập từ dịch sapo lên men, S6 dịng nấm men có ưu điểm nhất, dịng nẩm men lên men rượu vang sapo có triển vọng Dòng nấm men S6 định danh Saccharomyces cerevisiae phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA Do nghiên cứu thực ngắn hạn, nghiên cứu cần tiếp tục sưu tầm thêm dòng nấm men lên men rượu vang sapo khảo sát điều kiện lên men để đạt hiệu cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Huỳnh Xuân Phong, Danh Minh Lợi, Nguyễn Ngọc Thạnh, Lê Phan Đình Q, Bùi Hồng Đăng Long, Pornthap Thanonkeo, Mamoru Yamada Ngô Thị Phương Dung, 2017 Tạp chí Khoa họcTrường Đại học Cần Thơ 51 (B): 717 Kreger-van Rij N.J.W., 1984 The yeast, a taxonomic study, 3th ed., Elsevier, Amsterdam Kurtzman, C.P and Fell, J.W (eds), 1998 The Yeast: A TaxonomicStudy, 4th edn, revised and enlarged Amsterdam, The Netherlands: Elsevier Science Publisher Lương Đức Phẩm, 2006 Nấm men công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 226 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành Bùi Thị Thúy Ngân, 2011 Tuyển chọn dòng nấm men phân lập từ nước nốt Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 18b 117126 Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Phú Cường, Nguyễn Thị Mỹ Tuyền, Đinh Cơng Dinh, 2014 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 12 (1): 89-97 Số 11 - 2021 lập, tuyển chọn nấm men từ nước nốt thu hoạch Tri Tơn Tỉnh An Giang Tạp chí Khoa học 22a: 203-212 Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế Nguyễn Thị Mỹ Tuyền, 2013 Phân lập, tuyển chọn nám men lên men rượu vang khóm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy Neáng Thơi, 2012 Phân ISOLATION AND SELECTION OF YEAST HIGH ETHANOL TOLERANCE STRAINS FROM FERMENTED JUICE OF Manilkara zapota (L.) P Royen FOR SAPOTE WINE FERMENTATION Nguyen Van Ba*, Nguyen Thi Thu Thao, Nguyen Thanh Luan, Phạm Thanh Chinh and Chau Nhut Thang Faculty of Applied Biology, Tay Do Universsity (*Email: nguyenvanba84@gmail.com) ABSTRACT The aim of this study was to isolate and select the yeast strains from the fermented sapote juice for sapote wine fermentation, contributing to diversify of fruit wines The research was carried out by isolation of yeast strains from the fermented sapote juice; Evaluating the isolated yeast strains which can produce saccharose; Evaluating the ability of ethanol tolerance of the isolated yeast strains; Selecting the suitable yeast strains for sapote wine fermentation The results showed that among 21 yeast strains have been isolated, four strains had ability of saccharose fermentation and ethanol tolerance at 12% concentration etc After 17 days fermentation, the S6 yeast strain produced the good quality of sapote wine: ethanol content 10.10% v/v concentration, pH 4.31 and the sugar residue 8.23 g/L, significant difference in comparison with commercial yeast and the others (P< 0.05) The S6 yeast strain was named Saccharomyces cerevisiae by the genetic analysis method with 28S rRNA Keywords: Ethanol tolerance, saccharose fermentation, sapote-wine fermentation 227 ... rượu vang sapo dòng nấm men phân l? ?p Khảo sát khả sử dụng saccharose để lên men dòng nấm men phân l? ?p môi trường chứa saccharose 1% vô trùng, lần l? ?p lại, chọn dòng nấm men để lên men rượu vang sapo. .. vang trái sapo hạn chế Đề tài thực nhằm mục tiêu phân l? ?p tuyển chọn dòng nấm men từ dịch sapo để lên men rượu vang sapo g? ?p phần đa dạng hóa rượu vang trái PHƯƠNG PH? ?P NGHIÊN CỨU Giống sapo Mặc... bào nấm men chết hoàn toàn 3.4 Khả lên men dịch sapo dòng nấm men phân l? ?p Khả lên men dịch sapo dòng nấm men tuyển chọn thể Bảng Sau đầu lên men, chiều cao cột khí CO2 chng Durham bắt đầu có