Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn PGS TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực phần đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc Chương trình “Khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020” mà tơi có tham gia đồng ý Chủ nhiệm đề tài NCS PhạmVăn Kiền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình có hiệu nhiều cá nhân, tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm ơn PGS TS Đồn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS TS Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ mơn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, thầy, cô Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Bộ Cơng thương cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS TS Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài anh, chị, em đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực nghiệm để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành ơn gia đình tơi người bạn, đồng nghiệp ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2021 NCS Phạm Văn Kiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) .3 1.1.1 Vị trí phân loại Ba kích 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng dược lý .5 1.1.6 Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích .5 1.2 Monotropein nystose .6 1.2.1 Monotropein 1.2.2 Nystose 1.3 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 12 1.3.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose giới Việt Nam 12 1.3.2 Phân lập, tinh chế monotropein nystose từ Ba kích 13 1.4 Phương pháp phân tích trình tự ADN định danh lồi Morinda officinalis How 15 1.4.1 Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật .15 1.4.2 Phương pháp khuếch đại gen (PCR) 16 1.4.3 Các trình tự gen thường dùng cho thực vật 18 1.4.4 Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How 22 1.6 Tính cấp thiết luận án 23 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tượng nghiên cứu .25 2.2 Phương tiện nghiên cứu .25 2.2.1 Chất chuẩn dược liệu chuẩn .25 2.2.2 Hóa chất thuốc thử .25 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose .27 2.3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 37 2.3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 39 2.3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 44 2.3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam về số tiêu định tính, định lượng .48 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .49 3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 49 3.1.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein 49 3.1.2 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose 54 3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu rễ Ba kích phương pháp sắc ký lớp mỏng 59 3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích60 3.2.1 Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein nystose .60 3.2.2 Phân lập tinh chế monotropein 61 3.2.3 Phân lập tinh chế nystose 63 3.2.4 Xác định liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 65 3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 67 3.3.1 Thiết lập chất chuẩn monotropein 67 3.3.2 Thiết lập chất chuẩn nystose 75 3.3.3 Định tính, định lượng monotropein nystose dược liệu rễ Ba kích 83 3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .85 3.4.1 Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu 85 3.4.2 Nhân đoạn gen 86 3.4.3 Giải trình tự gen định danh dược liệu 87 3.4.4 Phân tích trình tự gen .89 3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng 93 3.5.1 Bổ sung tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam .93 3.5.2 Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam VI .94 CHƯƠNG BÀN LUẬN 101 4.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 101 4.1.1 Phương pháp định tính, định lượng monotropein nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích 101 4.1.2 Phương pháp định tính, định lượng nystose nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích .103 4.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu TLC 105 4.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 105 4.2.1 Chiết cao toàn phần 105 4.2.2 Phân lập, tinh chế monotropein 106 4.2.3 Phân lập, tinh chế nystose .107 4.2.4 Xác minh cấu trúc monotropein nystose tinh chế 108 4.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 109 4.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .112 4.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính, định lượng 118 4.5.1 Bổ sung tiêu định tính 118 4.5.2 Bổ sung tiêu định lượng 120 4.6 Những đóng góp luận án 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .123 Kết luận 123 Kiến nghị 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc APG II : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng lồi thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng mã gene FHH : Diễn đàn hòa hợp thuốc thảo dược nước Tây Thái Bình Dương HPLC-DAD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector mảng diod HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector tán xạ bay FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế i IGS : Intergenic spacer – vùng chen gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến WHO : World health organization - Tổ chức Y tế giới ii ... Ba kích Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dược liệu rễ Ba kích. .. chuẩn từ nước Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kơng Dược điển Việt Nam có chun luận dược liệu rễ Ba kích Trong đó, chun luận Ba. .. dược liệu rễ Ba kích Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kơng Dược điển Việt Nam V có chun luận dược liệu rễ Ba kích Các tiêu kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích Dược điển