Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây kim tiền thảo (desmodium styracifolium (osb ) merr ) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY KIM TIỀN THẢO (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH:8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HÀ BÍCH HỒNG Hà Nội, 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học TS Hà Bích Hồng Các kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học - cơng nghệ, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Hiên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp,Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Bích Hồng PGS TS Nguyễn Văn Việt tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Hiên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Kim tiền thảo 1.1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật Kim tiền thảo 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.1.4 Giá trị dược liệu 1.1.5 Các nghi n cứu h a sinh h c dược h c Kim tiền thảo 1.1.6 Một số thuốc dân gian Kim tiền thảo 1.2 Tình hình nhân giống số loài thuộc chi Desmodium 10 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật 12 1.3.1 Cơ sở khoa h c phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật 12 1.3.2 Các giai đoạn ch nh phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 13 1.4 Tổng quan ADN mã vạch .14 1.4.1 Giới thiệu ADN mã vạch (DNA barcoding) 14 1.4.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 16 1.4.3 nh h nh nghi n cứu ADN mã vạch thực vật 21 1.4.3 Ứng dụng ADN mã vạch 27 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 30 2.1.1 Mục ti u tổng quát 30 2.1.2 Mục ti u cụ thể 30 2.2 Nội dung nghiên cứu 30 2.3 Vật liệu nghiên cứu .30 iv 2.3.1 Đối tượng nghi n cứu 30 2.3.2 hiết bị dụng cụ .31 2.3.3 H a chất 31 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Xác định số ADN mã vạch để xác định loài Kim tiền thảo 32 2.4.2 Nghi n cứu nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo .35 2.5 Phương pháp thu thập xử lí số liệu 39 2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu .39 2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 40 2.5.3 Địa điểm thời gian bố tr th nghiệm 40 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch cho lồi Kim tiền thảo 41 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 41 3.1.2 Kết nhân tr nh tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo 42 3.1.3 Kết giải tr nh tự so sánh tr nh tự đoạn ADN mã vạch 45 3.1.4 o sánh hiệu giám định loài Kim tiền thảo số tr nh tự ADN mã vạch 54 3.2 Kết nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo 55 3.2.1 Kết nghi n cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu tái sinh chồi in vitro .55 3.2.2 Kết nghi n cứu ảnh hưởng nồng độ chất ĐH đến nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 57 3.2.3 Kết nghi n cứu ảnh hưởng hàm lượng chất hữu đến khả nhân nhanh chồi 60 3.2.4 Kết nghi n cứuảnh hưởng chất ĐH đến khả rễ Kim tiến thảo 62 3.2.5 Kết ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống, sinh trưởng Kim tiền thảo 64 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ BIỂU v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng đề tài 31 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 34 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR 34 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu hạt Kim tiền thảo 36 Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 36 Bảng 2.6: Ảnh hưởng hàm lượng chất hữu đến khả nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 37 Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm rễ Kim tiền thảo 37 Bảng 2.8: Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống sinh trưởng 38 Bảng 3.1: Các trình tự đoạn gen matK tương ứng với tên loài tương đồng với đoạn trình tự matK mẫu Kim tiền thảo 48 Bảng 3.2: Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống tái sinh chồi 56 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 58 Bảng 3.4: Ảnh hưởng hàm lượng chất hữu đến khả nhân nhanh chồi 60 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ α-NAAvà than hoạt tính đến khả 62 rễ 62 Bảng 3.6: Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống, sinh trưởng Kim tiền thảo 64 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) Hình 1.2: Hình thái Kim tiền thảo Hình 3.1: Kết tách chiết ADN tổng số từ mẫu Kim tiền thảo .41 Hình 3.2: Kết điện di sản ph m PCR đoạn trình tự ADN mã vạch 42 Hình 3.3: Trình tự nucleotide đoạn gen MatK mẫu Kim tiền thảo 46 Hình 3.4: Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK mẫu Kim tiền thảo (query với lồi Desmodium styracifolium NCBI (sbjct) 47 Hình 3.5: Cây quan hệ di truyền mẫu Kim tiền thảo với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 49 Hình 3.6: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL mẫu Kim tiền thảo 50 Hình 3.7: Cây quan hệ di truyền mẫu Kim tiền thảo với trình tự tương đồng NCBI dựa trình tự đoạn gen rbcL 51 Hình 3.8: Trình tự nucleotide đoạn gen ITS mẫu Kim tiền thảo 52 Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền mẫu Kim tiền thảo với trình tự tương đồng ngân hàng gen trình tự ITS 52 Hình 3.10: Trình tự nucleotide đoạn gen ycf1b mẫu Kim tiền thảo 53 Hình 3.11: Cây quan hệ di truyền mẫu Kim tiền thảo với trình tự tương đồng ngân hàng gen dựa trình tự đoạn gen ycf1b 54 Hình 3.12: Hạt Kim tiền thảo khử trùng công thức sau tuần nuôi cấy 57 Hình 3.13: Cụm chồi Kim tiền thảo môi trường nhân nhanh NN1 (A MN2 (B) 59 Hình 3.14: Cụm chồi Kim tiền thảo môi trường NC1 sau tuần nuôi cấy 61 Hình 3.15: Cây Kim tiền thảo nuối cấy với cơng thức R5 64 Hình 3.16: Cây Kim tiền thảo nuôi cấy công thức B3 66 vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỉ lệ mẫu tỉ lệ nảy mầm công thức khử trùng 56 Biểu đồ 3.2: Hệ số nhân chồi tỉ lệ chồi hữu hiệu môi trường 59 Biểu đồ 3.3: Hệ số nhân chồi tỉ lệ chồi hữu hiệu công thức môi trường có bổ sung chất hữu khác .61 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng Chất ĐHST đến tỉ lệ chồi rễ (A số rễ trung bình, chiều dài rễ cơng thức thí nghiệm (B 63 Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ sống chiều cao TB Kim tiền thảo nuối cấy cơng thức thí nghiệm .65 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện hợp chất tự nhiên phân lập từ dược liệu sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực ph m mĩ ph m… Trong hệ thống loài thực vật Việt Nam, có nhiều lồi thuộc họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, dùng để bào chế làm thuốc chữa bệnh, có Kim tiền thảo Đối với Kim tiền thảo phận như: rễ, thân, sử dụng Các nghiên cứu dược lý đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp, tăng tiết mật, giảm đau ống mật, tăng lưu lượng máu thận, tăng tuần hoàn máu não động mạch đùi… Song công dụng chủ yếu lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng, chữa bệnh trĩ, chữa viêm mật (Đỗ Tất Lợi, 1999) Tuy nhiên, hầu hết nguồn dược liệu nhập từ nước ngồi chưa có nghiên cứu đầy đủ nhân giống, gieo trồng, chế biến Kim tiền thảo nên suất chất lượng cịn hạn chế Để có nguồn dược liệu Kim tiền thảo chất lượng tốt, bền vững đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe người đồng thời đảm bảo hàm lượng hoạt tính dược liệu sản ph m sau thu hoạch, cần phải có biện pháp hữu hiệu bảo tồn phát triển loài dược liệu đa tác dụng Vì vậy, nhân giống lồi Kim tiền thảo phương pháp nuôi cấy in vitro giúp tạo số lượng lớn thời gian ngắn, đáp ứng nguồn giống cho vùng sản xuất dược liệu, nhằm nâng cao thu nhập cho người dân phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen thuốc Mặt khác, để giám định hay định danh xác lồi Kim tiền thảo phục vụ cho lựa chọn loài đưa vào nhân giống in vitro phương pháp ADN mã 75 61 Xie H, Li J (2018), Gao H (2009) Total flavone of Desmodium styracifolium relieved apoptosis ADN autophagy of COM-induced HK-2 cells by regulating KIM-1 via p38/MAPK pathway Mol Cell Biochem,442(12):169-175 62 Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu, Hongxi Xu, Linfang Huang, Shilin Chen (2011 , “Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification”.Cladistics 27 (2) 63 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010 , “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants ADN animals”, PLoS ONE, 5: 13102 64 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L ADN Hui Y (2010 , “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique” Journal of Medicinal Plants Research 4(24): 2706-2709 65 Yu, J., Xue J.H., ADN Zhou S.L (2011 , “New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms”, Journal of Systematics ADN Evolution, 49 (3): 176-181 66 Zhou J, Jin J, Li X, Zhao Z, Zhang L, Wang Q, Li J,Zhang Q, Xiang S (2018 ,“Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy-L-proline-induced calcium Urolithiasis, 46(3): 231-241 WEBSITE 67 http://www.barcodinglife.org/ 68 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi oxalate urolithiasis in rats” PHỤ BIỂU Phụ biểu Kết kiểm tra tỉ ệ mẫu hạt Kim tiền thảo công thức khử trùng khác CT * SOMAUSACH CT * SOMAUSACH Crosstabulation Count CT1 % within CT Count CT CT2 % within CT Count CT3 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0,0%) have expected count less than The minimum expected count is 19,05 Phụ biểu Kết kiểm tra tỉ ệ nảy mầm hạt Kim tiền thảo công thức khử trùng khác Case Processing Summary CT * SOHATNAYMAM CT * SOHATNAYMAM Crosstabulation Count 1,00 % within CT Count CT 2,00 % within CT Count 3,00 % within CT Count Total % within CT Phụ biều Kết kiểm tra tỉ ệ chồi hữu hiệu Kim tiền thảo sử dụng tổ hợp chất ĐHST nồng độ khác Case Processing Summary CT * CHOIHUUHIEU CT * CHOIHUUHIEU Crosstabulation Count NN1 % within CT Count NN2 % within CT Count NN3 % within CT Count CT NN4 % within CT Count NN5 % within CT Count NN6 % within CT Count ĐC % within CT Count Total % within CT Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0,0%) have expected count less than The minimum expected count is 38,41 Phụ biểu Phân tích phƣơng sai số nhân tố ảnh hƣởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ANOVA SOCHOI TB/MAU Between Groups Within Groups Total Phụ biểu Kết kiểm tra tỉ ệ chồi hữu hiệu Kim tiền thảo sử dụng hàm ƣợng chất hữu bổ sung khác Case Processing Summary CT * CHOIHUUHIEU CT * CHOIHUUHIEU Crosstabulation Count NC1 % within CT Count CT NC2 % within CT Count NC3 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0,0%) have expected count less than The minimum expected count is 132,26 Phụ biểu Phân tích phƣơng sai số nhân tố ảnh hƣởng hàm ƣợng chất hữu bổ sung đến khả nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ANOVA SOCHOI TB/MAU Between Groups Within Groups Total Phụ biều Kết kiểm tra tỉ ệ rễ Kim tiền thảo sử dụng chất ĐHST nồng độ khác CT * SOCAYRARE CT * R1 R2 R3 CT R4 R5 R6 Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count Total % within CT Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0,0%) have expected count less than The minimum expected count is 34,32 Test of Homogeneity of Variances CHIEUDAIRE Phụ biều Kết phân tích phƣơng sai số nhân tố chiều dài rễ Kim tiền thảokhi sử dụng tổ hợp chất ĐHST nồng độ khác ANOVA CHIEUDAIRE Between Groups Within Groups Total Phụ biểu Kết phân tích phƣơng sai số nhân tố số rễ trung bình/ chồi Kim tiền thảo sử dụng tổ hợp chất ĐHST nồng độ khác ANOVA SORE Between Groups Within Groups Total Phụ biều 10 Kết kiểm tra tỉ ệ sống Kim tiền thảo sử dụng thành phần ruột bầu khác Case Processing Summary Cases CT * SOCAYSONG CT * SOCAYSONG Crosstabulation Count RB1 % within CT Count RB2 % within CT Count CT RB3 % within CT Count RB4 % within CT Count RB5 % within CT Count Total % within CT Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0,0%) have expected count less than The minimum expected count is 33,96 Phụ biểu 11 Kết phân tích phƣơng sai số nhân tố chiều dài rễ Kim tiền thảo sử thành phần ruột bầu khác ANOVA CHIEUDAIRE Between Groups Within Groups Total ... ADN mã vạch cho loài nhằm đảm bảo độ tin cậy xác nhân giống Cây Kim tiền thảo thực đề tài: ? ?Nghiên cứu xác định số trình tự ADN mã vạch nhân giống Cây Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb. ). .. trình nghiên cứu nhân giống Kim tiền thảo phương pháp nuôi cấy in vitro 1.1.6 Một số thuốc dân gian Kim tiền thảo Chữa mụn nhọt, ghẻ lở: Kim tiền thảo + xa tiền thảo tươi, giã nát, cho rượu vào,... cụ thể Xác định đến đoạn trình tự ADN mã vạch để giám định lồi Kim tiền thảo Xác định cơng thức khử trùng tạo mẫu sinh chồi Kim tiền thảo Xây dựng môi trường nhân nhanh chồi Kim tiền thảo Xây