Nhân giống cây tục đoạn (dipsacus japonicus miq) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHAN THỊ THU TRANG NHÂN GIỐNG CÂY TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học1: Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: PGS.TS BÙI VĂN THẮNG TS KHUẤT THỊ HẢI NINH Hà Nội, 2018 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đề tài nghiên cứu “Nhân giống Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” tơi nhóm nghiên cứu thực hiện, chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với công nghiên cứu công bố, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018 Ngƣời cam đoan Phan Thị Thu Trang ii LỜI CÁM ƠN Đề tài nghiên cứu đƣợc thực Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện để công việc chuyên môn đề tài đƣợc tiến hành thuận lợi Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng TS Khuất Thị Hải Ninh tận tình hƣớng dẫn tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm cán nghiên cứu Viện Công nghiệp sinh học lâm nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Đồng thời, nhận đƣợc động viên, quan tâm giúp đỡ nhiệt tình bạn bè đồng nghiệp nơi công tác Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ngƣời thân ln bên tơi, động lực để tơi vƣợt qua khó khăn để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Phan Thị Thu Trang iii MỤC LỤC TRANG LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 Giới thiệu chung Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học, phân bố giá trị kinh tế Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.2 Tình hình bảo tồn, khai thác phát triển Tục Đoạn 1.1.3 Các phương pháp nhân giống Tục Đoạn (D japonicus Miq) .10 1.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn (D japonicus Miq) 12 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn giới 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn Việt Nam 13 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro số loài dƣợc liệu Việt Nam 14 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm thu thập số liệu 21 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tạo mẫu Tục Đoạn (D japonicus Miq) 27 iv 3.1.1 Tạo mẫu từ hạt .27 3.1.2 Tạo mẫu từ chồi 29 3.2 Ảnh hƣởng chất điều hồ sinh trƣởng, mơi trƣờng dinh dƣỡng hàm lƣợng đƣờng đến khả tạo cụm chồi 31 3.2.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo cụm chồi 31 3.2.2 Ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi 35 3.2.3 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tạo cụm chồi 37 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả rễ chồi 41 3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc in vitro giai đoạn vƣờn ƣơm 44 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến khả sống non 44 3.4 Ảnh hưởng loại giá thể đến khả sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 45 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .51 STT Ký hiệu BAP CTTN ĐC CS ĐHST IBA LSD MS MS* 10 NAA 11 STT 12 Sig 13 TB 14 TDZ 15 WPM vi DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian loại hóa chất khử trùng đến khả tạo mẫu Tục Đoạn, sau tuần nuôi cấy 27 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu chồi b ng HgCl2 0,1 đến khả tạo mẫu Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy 29 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy .32 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng loại môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn in vitro 35 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng loại đƣờng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn in vitro 38 Bảng 3.6 Khả rễ chồi in vitro Tục Đoạn môi trƣờng 42 MS bổ sung NAA, IBA 42 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian huấn luyện đến khả sống .45 mô Tục Đoạn 45 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sống sinh trƣởng in vitro Tục Đoạn 46 vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ ( ) mẫu hạt Tục Đoạn nảy chồi khử trùng b ng HgCl2 0,1% NaClO với thời gian khác 28 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ mẫu Tục Đoạn nảy chồi khử trùng b ng HgCl2 0,1 với thời gian khác 30 Biều đồ 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi mơi trƣờng MS bổ sung chất điều hồ sinh trƣởng nồng độ khác nhau………………………… 31 Biều đồ 3.4 Số chồi TB/cụm Tục Đoạn mơi trƣờng MS bổ sung chất điều hồ sinh trƣởng nồng độ khác 33 Biều đồ 3.5 Chiều cao TB chồi Tục Đoạn môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng nồng độ khác .33 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng MS, MS*, WPM sau tuần nuôi cấy………………………………………………… …… .34 Biểu đồ 3.7 Số chồi TB/cụm môi trƣờng MS, MS*, WPM 36 sau tuần nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.8 Chiều cao trung bình chồi môi trƣờng MS, MS*, WPM 36 sau tuần nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ ( ) mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng bổ sung .38 Biểu đồ 3.10 Số chồi TB/cụm môi trƣờng bổ sung loại đƣờng khác (sau tuần nuôi cấy) 39 Biểu đồ 3.11 Chiều cao trung bình chồi mơi trƣờng bổ sung loại đƣờng khác (sau tuần nuôi cấy) 39 Biểu đồ 3.12 Số lƣợng trung bình rễ/chồi (sau tuần cấy) 43 Biểu đồ 3.13 Số lƣợng chiều dài trung bình rễ /chồi (sau tuần cấy) 43 Biểu đồ 3.14 Tỉ lệ sống sót giá thể khác 47 Biểu đồ 3.15 Chiều cao trung bình giá thể khác 47 viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 1.1 Cây Tục Đoạn Hình 2.1 Mẫu Tục Đoạn làm vật liệu nuôi cấy .22 Hình 3.1 Mẫu hạt Tục Đoạn nảy mầm in vitro sau tuần nuôi cấy 29 Hình 3.2 Mẫu Tục Đoạn nảy chồi sau tuần ni cấy 31 Hình 3.3 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần cấy chuyển sang môi trƣờng nhân chồi 34 Hình 3.4 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy loại môi trƣờng: A: WPM, B: MS* C: MS 37 Hình 3.5 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần ni cấy môi trƣờng hàm lƣợng đƣờng khác nhau: A: công thức D4; B: công thức D1; 40 Hình 3.6 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy môi trƣờng hàm lƣợng đƣờng khác 41 Hình 3.7 Cây Tục Đoạn hồn chỉnh mơi trƣờng MS + 0,4 mg/l NAA 44 Hình 3.8 Cây mơ Tục Đoạn giá thể GT2 .48 ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng giới, với 5.117 loài dƣới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ ngành Thực vật bậc cao có mạch, với số taxon thuộc nhóm Rêu, Tảo Nấm lớn, có cơng dụng làm thuốc (Danh lục thuốc Việt Nam, 2016) Theo Tổ chức Y tế Thế giới, 80 dân số nƣớc phát triển có nhu cầu sử dụng y học cổ truyền thuốc từ thảo dƣợc để chăm sóc bảo vệ sức khỏe Trong vài thập niên gần đây, nhiều nƣớc đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào chế sản xuất dƣợc phẩm có nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ, phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh Theo thống kê ngành Y tế, nhu cầu sử dụng dƣợc liệu Việt Nam vào khoảng 60.000 - 80.000 dƣợc liệu/năm Lĩnh vực sản xuất kinh doanh dƣợc liệu cho sản xuất thuốc, thực phẩm chức mang lại nguồn lợi lớn cho kinh tế Tuy nhiên, phần lớn khối lƣợng dƣợc liệu phải nhập khẩu, Việt Nam lại quốc gia có tiềm nguồn tài nguyên dƣợc liệu phong phú Năm 2013, theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Thủ tƣớng Chính phủ “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến năm 2020 định hƣớng đến năm 2030” định số 206/QĐ-BYT, ngày 22/1/2015 Bộ trƣởng Y tế việc ban hành danh mục dƣợc liệu ƣu tiên phát triển giai đoạn 2015 – 2020, nh m bảo tồn khai thác dƣợc liệu tự nhiên Việt Nam quy hoạch vùng dƣợc liệu trọng điểm để lựa chọn sản xuất khai thác hợp lý Trong đó, triển khai sản xuất 28 lồi dƣợc liệu địa phục vụ cho sản xuất Tục Đoạn loài dƣợc liệu đƣợc qui hoạch trồng vùng núi cao vùng núi trung bình có khí hậu Á nhiệt đới PHỤ BIỂU Phụ biểu 01 Kết kiểm tra tỷ lệ hạt nảy mầm công thức khử trùng khác Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 24.33 Phụ biểu 02 Kết kiểm tra tỷ lệ mẫu nảy chồi cơng thức thí nghiệm khác Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 12.75 Phụ biểu 03 Kết kiểm tra tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣ ng nồng độ khác gian khác Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 35.69 Phụ biểu 04 Kết kiểm tra thống kê chiều cao chồi só chồi/cụm mơi trƣờng MS bổ sung chất điều hồ sinh trƣ ng nồng độ khác gian khác ANOVA sochoi Between Groups Within Groups Total Hchoi Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 05 Kết kiểm tra thống kê tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi loại mơi trƣờng khống khác MS, MS* WPM Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 27.25 Phụ biểu 06 Kết kiểm tra thống kê chiều cao chồi só chồi/cụm loại mơi trƣờng khống khác MS, MS* WPM ANOVA sochoi Between Groups Within Groups Total Hchoi Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 07 Kết kiểm tra thống kê tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng MS có bổ sung hàm lƣợng loại đƣờng khác Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 8.62 Phụ biểu 08 Kết kiểm tra thống kê chiều cao chồi só chồi/cụm loại mơi trƣờng MS có bổ sung hàm lƣợng loại đƣờng khác ANOVA sochoi Between Groups Within Groups Total Hchoi Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 09 Kết kiểm tra chiều dài rễ, số rễ/chồi bổ sung NAA nồng độ khác ANOVA Chiều dài rễ Số lƣợng rễ Phụ biểu 10 Kết kiểm tra chiều dài rễ, số rễ/chồi bổ sung IBA nồng độ khác ANOVA Chiều dài rễ Sore Phụ biểu 11 Kết kiểm tra thống kê tỉ lệ sống sau huấn luyện vƣờn ƣơm Chi-Square Tests Pearson ChiSquare Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 24.00 Phụ biểu 12 Kết kiểm tra thống kê tỉ lệ sống vƣờn ƣơm Chi-Square Tests Pearson ChiSquare Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 68.25 Phụ biểu 13 Kết kiểm tra thống kê tỉ lệ sống loại giá thể khác Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (.0%) have expected count less than The minimum expected count is 44.00 Phụ biểu 14 Loai giathe Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 15 Thành phần môi trƣờng MS, MS* WPM TT Thành phần Muối khoáng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O KI 10 CoCl2.6H2O 11 H3BO3 12 Na2MoO4.2H2O 13 FeSO4.7H2O 14 Na2EDTA Vitamin chất hữu 15 B1 16 Nicotinic axit 17 B6 18 Glyxin 19 Myo-inositol ... ? ?Nhân giống Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro? ?? Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Mục... thuật nhân giống in vitro Tục Đoạn dẫn liệu khoa học ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển Tục Đoạn Việc nhân nhanh thành công Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. .. nghiên cứu nhân giống in vitro Tục Đoạn Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống in vitro Tục Đoạn cần thiết 1.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn (D japonicus Miq) Các cơng trình nghiên cứu Tục Đoạn chƣa