Xác định gen kháng bạc lá phổ rộng ở một số giống lúa thơm chất lượng cao

MỞ ĐẦU Lúa gạo lƣơng thực quan trọng ngƣời Trên giới, lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì diện tích sản lƣợng Ở Châu Á, lúa gạo đƣợc coi lƣơng thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu tổng số 148,4 triệu trồng lúa toàn giới Ở Việt Nam, lúa đƣợc trồng rộng rãi nguồn lƣơng thực chủ yếu ngƣời Tuy nhiên có nhiều yếu tố gây hại làm giảm suất sản lƣợng lúa Một số bệnh làm giảm đáng kể sản lƣợng lúa bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae Bệnh xuất vùng nhiệt đới lẫn ơn đới Thơng thƣờng, nịi vùng nhiệt đới có độc tính cao nịi vùng ôn đới Theo thống kê, bệnh bạc lúa gây hao hụt suất lúa cách đáng kể Tại Nhật Bản có khoảng 300.000 - 400.000 lúa bị nhiễm bệnh hàng năm Có ruộng lúa có suất giảm từ 20 đến 50% bị nhiễm bệnh bạc Ở Việt Nam, bệnh bạc làm giảm từ 6% - 60% suất bệnh xuất hầu hết vùng trồng lúa nƣớc [4] Để phòng trừ bệnh bạc lúa, đến chủ yếu sử dụng kỹ thuật canh tác cịn biện pháp hóa học chƣa có loại thuốc hóa học đặc trị Hƣớng tạo giống lúa kháng bệnh bạc đƣợc ghi nhận có hiệu nhiều mặt vừa giảm chi phí, bảo vệ môi trƣờng lại tạo đƣợc nông phẩm đảm bảo chất lƣợng Việt Nam nƣớc nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm mƣa nhiều thích hợp cho chủng vi khuẩn bạc phát triển mạnh, gây trở ngại cho cơng tác phịng trừ, mặt khác cịn giảm sản lƣợng lúa cách đáng kể Vì vậy, nâng cao ổn định sản lƣợng, đồng thời tạo giống có khả chống bệnh lâu bền sản xuất nội dung quan trọng chƣơng trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa giới nhƣ Việt Nam [12] Hiện nay, chất lƣợng sống ngày tăng, nhu cầu tiêu thụ giống lúa gạo chất lƣợng cao ngày tăng Mặc dù Việt Nam nƣớc xuất gạo đứng thứ hai giới (sau Thái Lan), nhƣng thƣờng xuất giống lúa có chất lƣợng trung bình giá thƣờng thấp giá gạo Thái Lan khoảng 10 - 20% Hơn nữa, có loại lúa thơm để đặt chân vào thị trƣờng gạo thơm giới Trong thực tế, nƣớc ta hàng năm phải nhập lƣợng gạo thơm định từ Thái Lan số nƣớc khác để bán thị trƣờng nội địa giá loại thƣờng gấp - lần giá gạo thƣờng nƣớc Ở tỉnh nƣớc, nông dân gieo trồng giống lúa thơm giống lúa cổ truyền nhƣ tám thơm, dự… số giống lúa cải tiến đƣợc nhập từ Trung Quốc: bắc thơm số 7, hƣơng thơm số 1… Tuy nhiên, giống lúa cho chất lƣợng tốt có mùi thơm vùng, địa phƣơng định Mặt khác số giống nhƣ bắc thơm số 7, AC5… lại thƣờng bị nhiễm số bệnh hại lúa: đạo ôn, bạc lá… nên việc phát triển giống lúa bấp bênh Nông dân ngƣời tiêu dùng địi hỏi có giống lúa thơm chất lƣợng cao, kháng sâu bệnh tốt phục vụ cho tiêu dùng, xuất tăng thêm thu nhập… Hiện nay, Bộ môn công nghệ sinh học, Viện lƣơng thực thực phẩm ứng dụng thành tựu CNSH đại phân tích, xác định gen kháng bạc giống lúa thơm chất lƣợng cao nhằm tạo giống lúa có suất cao, chất lƣợng ổn định, chống chịu sâu bệnh bền vững để phục vụ nhu cầu nƣớc mà tăng cƣờng thị phần xuất gạo thơm chất lƣợng cao giới Dựa sở thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Xác định gen kháng bạc phổ rộng số giống lúa thơm chất lượng cao ” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung lúa Cây lúa thuộc họ hòa thảo, thân bụi, mềm Cây lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loại khác Trong số 23 loại phân loại, có hai lồi O.glaberryma sreud Oryza sativa L đƣợc trồng cấy Loài O.glaberryma sreud đƣợc trồng chủ yếu số nƣớc miền Tây Châu Phi Loại O sativa L đƣợc trồng khắp giới đƣợc chia thành hai loại: Japonica Indica Lúa Japonica sinh trƣởng điều kiện khí hậu ơn hịa có hạt trịn, khó bị gãy vỡ, nấu chín, loại gạo thƣờng dính dẻo Lúa Indica thƣờng sinh trƣởng phát triển vùng khí hậu nóng ẩm, có hạt gạo thƣờng dài dễ bị vỡ, nấu thông thƣờng không bị kết dính Tất loại gạo có nguồn gốc từ Nam Á, bao gồm Ấn Ðộ, Thái Lan, Việt Nam Nam Trung Quốc lúa Indica [23] Lúa O sativa L có nhiễm sắc thể đơn bội n = 12 Đa số loại lúa dại lúa trồng có gen trạng thái lƣỡng bội tự thụ phấn, có khả thụ phấn chéo [23] Trên giới, lúa O sativa L có diện tích gieo trồng đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sản lƣợng đứng thứ ba sau lúa mì ngơ Lúa đƣợc trồng khắp lục địa trừ Antarctica Sản phẩm thu đƣợc từ lúa thóc Sau xát bỏ lớp vỏ ngồi thu đƣợc sản phẩm gạo Lúa gạo nguồn lƣợng thực quan trọng cho khoảng 2/3 dân số giới, lúa O sativa L trở thành loại lƣơng thực đƣợc ngƣời tiêu thụ ƣa chuộng nhiều [22] Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng giới có 15 nƣớc giới trồng lúa với diện tích hơn triệu ha, có tới 13 nƣớc Châu Á Riêng Trung Quốc Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa 56% sản lƣợng lúa tồn cầu Bangladesh, Indonexia Thái Lan, nƣớc có diện tích trồng lúa lớn tổng diện tích trồng lúa tất nƣớc Mĩ La Tinh Châu Phi có diện tích trồng lúa gần diện tích trồng lúa Việt Nam, nhƣng sản lƣợng lúa lại thấp Việt Nam từ - lần [11, 21] 1.2 Giới thiệu lúa thơm Lúa thơm loại lúa có mùi thơm đặc trƣng có vị trí đặc biệt thị trƣờng xuất gạo với giá trị kinh tế cao Căn vào thể mùi thơm hạt cơm, ngƣời ta phân kiểu gen lúa: thơm (aroma) không thơm (non-aroma) Thuật ngữ aroma phát xuất từ resine, tinh dầu cao đƣợc thị trƣờng phân hạng theo mùi thơm Và nghiên cứu giới nhƣ Việt Nam mùi thơm hạt đƣợc xác định 2.acetyl 1-pyroproline [13, 17, 18] 1.2.1 Phân loại Cũng giống nhƣ giống lúa khác, lúa thơm đƣợc phân loại theo cấu trúc, màu sắc hình dạng hạt gạo chúng Ví dụ, theo kích thƣớc hạt lúa, đƣợc phân loại thành: + Loại hạt dài: có chiều dài mm, gấp lần chiều rộng, nấu hạt cơm khơng dính, có gạo dài mà dính Lào Thái lan + Loại hạt trung bình: có kích thƣớc trung bình khoảng - 6mm + Loại hạt ngắn: có chiều dài khoảng - mm chiều dài khoảng 2,5 mm chiều rộng Về màu sắc hạt, có loại lúa thơm khác cho hạt gạo màu nâu, hạt gạo màu trắng, hạt gạo màu đỏ hạt gạo màu đen… [12] Một giống lúa thơm Thái Lan cho loại gạo hạt dài tƣơng đối dính, gạo hạt dài chứa amylopectin so với giống hạt ngắn Các loại gạo nếp gạo hạt ngắn Lúa thơm Nhật Bản loại gạo hạt ngắn dính - Ở Việt Nam: Các giống lúa thơm đƣợc gieo trồng nƣớc đƣợc chia nhiều loại chủ yếu dựa vào chiều dài hạt gạo nhƣ: + Dạng hạt dài có: Tẻ thơm, Nàng thơm, Bắc thơm, Nghi hƣơng, hƣơng cốm, hƣơng thơm số 1, AC5, AC15… + Dạng hạt trịn có : Nếp nƣơng, Nếp hoa vàng, nếp thơm chợ đào… 1.2.2 Đặc điểm hình thái nơng học lúa thơm Các giống lúa thơm có dạng hạt dài, màu nâu vàng đặc trƣng Khi gieo trồng, lúa có màu sắc xanh mƣợt (giai đoạn mạ) đến xanh đậm (khi đem gieo cấy đồng ruộng), kiểu đẻ nhánh chủ yếu xòe, thời gian sinh trƣởng khoảng 110 – 115 ngày (đối với giống hạt dài ), nên chúng đƣợc dùng để gieo trồng trà trung vụ mùa miền Bắc Còn giống lúa thơm hạt trịn có thời gian snh trƣởng dài khoảng 120 – 130 ngày Lúa thơm có mùi đặc trƣng tích trữ tất phận cây, trừ rễ 1.2.3 Các nghiên cứu gen quy định tính trạng mùi thơm lúa Gen điều khiển mùi thơm hạt gạo đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu, với nhiều kết luận khác nhau: - gen lặn (Ghose Butany, 1952; Sood Siddiq, 1978; Berner Hofl, 1986) - gen trội (Kadam Patan kar, 1938) - Hai gen lặn, hoạt động bổ sung - tỉ lệ : F2 (Tripathi Rao, 1979) - Hai gen lặn, hoạt động lặp đoạn - tỉ lệ : 15 F2 (Dhulappanvar, Mensinkai, 1969) - Hai gen lặn, gen hoạt động nhƣ yếu tố ức chế - tỷ lệ : 13 F2 (Charkravarty 1948, Tsuzuky Shimokawa, 1990) - Ba gen lặn - tỷ lệ 27 : 37 F2 (Kadam patarkar 1938, Nagarju ctv 1975, Reddy Sathynaraynaiah, 1980) - gen lặn - tỷ lệ 81 : 175 F2 (Dhulappanavar, 1976) - Đa gen (Richharia ctv, 1965) [19, 20] Tại Đại học Cornell, Ahn ctv (1992) áp dụng kỹ thuật RFPL marker để nghiên cứu gen quy định tính trạng mùi thơm lúa Đó gen lặn, ký hiệu fgr, định vị nhiễm sắc thể số 8, liên kết chặt với marker RG28 Khoảng cách di truyền marker fgr 4,5 cM Nhiều tác giả cố gắng thiết kế primer RG28, để ứng dụng kỹ thuật chọn giống lúa thơm, nhờ marker phân tử (MAS) Cho đến nay, việc lai tạo giống lúa cải tiến có mùi thơm đặc trƣng thành cơng ngƣời dân chủ yếu gây trồng giống lúa thơm truyền thống [15, 16, 17] 1.3 Bệnh bạc lúa 1.3.1 Bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv Oryzicola) Hình 1: Bệnh bạc lúa khuẩn Xanthomonas oryzae gây Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzicola gây loại bệnh nguy hiểm lúa, đặc biệt vụ mùa miền bắc Việt Nam, làm giảm suất, chất lƣợng lúa cách đáng kể [24] A B Hình 2: Khuẩn lạc Xanthomonas oryzae (A) biểu bệnh lúa (B) A Bệnh đƣợc phát Fukuoka - Nhật Bản năm 1884 Sau bệnh đƣợc phát nhiều vùng khác Nhật đến năm 1960 bệnh trở nên phổ biến Nhật Nó xuất thập kỷ 70 Ấn Độ Mỹ tạo thành nỗi lo lớn truyền bệnh phổ biến Thêm nữa, bệnh bạc cịn vấn đề nghiêm trọng vùng trồng lúa lai nhƣ Trung Quốc, Việt Nam, Myanmar, Indonesia, Ấn Độ, Srilanka, Đài Loan, Thái Lan, Philippines nhiều nƣớc khác nhƣ “Cách mạng Xanh” [25] Ở Việt Nam, bệnh bạc xuất lần vùng đồng Bắc Bộ, bệnh phổ biến tất vùng trồng lúa nƣớc từ vùng núi cao ven biển Bệnh làm giảm từ 6% - 60% suất lúa Bệnh phá hoại Đông Xuân Hè Thu Bệnh gây hại nhiều tháng nhiệt độ cao, mƣa bão điều kiện lây lan phát triển mạnh Trong năm 1970 - 1975, bệnh phát triển gây hại nặng tỉnh miền Bắc Gần nhiều giống lúa nhập nội từ Trung Quốc bị nhiễm nặng giai đoạn bị thiệt hại nhiều từ trổ đến thu hoạch [3, 5] 1.3.2 Vi khuẩn Xanthomonas Oryzae gây bệnh bạc lúa Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa vi khuẩn hình que, kích thƣớc 1,2 x 0,3 - 0,5 µm Vi khuẩn thƣờng xuất đơn độc, đơi kết đôi nhƣng không liên kết thành chuỗi Vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, ƣa khí, khơng tạo bào tử khơng có vỏ bọc (capsule) bên ngồi Nhiệt độ tối ƣu cho tăng trƣởng từ 250C - 300C Các khuẩn lạc môi trƣờng dinh dƣỡng agar (nutrient agar) có dạng vịng trịn với viền ngun vẹn, lồi, màu vàng nhạt có phát triển chất màu xanthomonadin [24] Những dòng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzicola gây bệnh bạc phân lập từ lúa cỏ dại bị nhiễm bệnh tự nhiên vi khuẩn hình gậy, có lơng roi đầu, nhuộm Gram(-) khuẩn lạc có màu vàng nhạt, trịn, ria nhẵn láng bóng háo khí Khuẩn Xanthomonas oryzae khơng phản ứng phân giải gelatin, không thủy phân tinh bột, phản ứng khử trùng nitrat, khơng tạo NH3 indol, nhƣng có phản ứng tạo H2S phân giải đƣờng glucoza, saccharoza lactoza lại tạo axit Sự phát triển khuẩn bị ức chế Triphenyl tetrazolium chloside (TTC) Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trƣởng từ 26oC-30oC, nhiệt độ tối thiểu từ 0oC - 5oC, nhiệt độ tối đa 40oC vi khuẩn chết 53oC Trong giống lúa mẫn cảm với bệnh bạc Xanthomonas oryzae xâm nhiễm qua thủy khổng, lỗ khí, vết nứt sinh trƣởng rễ mọc gốc bẹ đặc biệt qua vết thƣơng xây xát Ở mút lá, mép thƣờng đọng nƣớc nhiều nên vi khuẩn dễ dàng di động xâm nhập, sau giai đoạn tĩnh khoảng 1-2 ngày, vi khuẩn sinh trƣởng với cấp số nhân nhanh chóng tiếp cận với mơ mạch dẫn Nhờ hệ thống mạch dẫn lây nhiễm lan khắp lúa Điều kiện mƣa ẩm thuận lợi cho phát triển vi khuẩn Nhờ nƣớc mƣa, giọt dịch vi khuẩn bề mặt vết bệnh đƣợc lan truyền sang khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần thời kỳ sinh trƣởng lúa [11, 25] 1.3.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh Bệnh bạc lúa vi khuẩn phát sinh từ ruộng mạ phiến lá, nhƣng biểu bệnh rõ lúa lúa đẻ nhánh phát triển đến giai đoạn lúa trổ bơng, hạt chín sữa lúc bệnh gây hại mạnh Phiến bị khơ trắng vệt từ chót từ mép Khi bệnh nặng phiến bị khơ trắng tới 60% - 70% diện tích tồn Các giọt dịch màu vàng hình cầu li ti thƣờng xuất mặt vết bệnh vào buổi sáng Nếu bệnh bùng phát thành dịch, lúa làm địng, địng bị bệnh lúa dễ bị nghẹn đòng suất giảm tới 55% - 70%, bạc, hạt lép nhiều [10, 23] Loại vi khuẩn Xanthomonas oryzae xâm nhiễm vào lúa theo thuỷ khổng, khí khổng qua vết thƣơng lúa Nguồn cƣ trú vi khuẩn bạc qua hạt giống, cỏ dại thuộc họ hoà thảo nhƣ cỏ lồng vực, cỏ gừng, lúa chét, lúa tự mọc, đất nƣớc lƣu tồn vi khuẩn này, từ lây lan vào ruộng lúa Nhiệt độ 25oC - 30 oC ẩm độ 95% - 100% điều kiện thuận lợi để bệnh phát triển mạnh có nguy thành dịch Ở chân ruộng hẩu, ruộng trũng, chua, bị che rợp, bón đạm muộn, bón nhiều đạm, cân lân kali, diện tích bón đạm rải nhiều đợt làm cho lúa bị bệnh bạc vi khuẩn nặng 1.3.4 Triệu chứng tác hại Bệnh bạc phát sinh gây hại suốt thời kì mạ đến lúa chín, mức độ gây hại bệnh phụ thuộc vào giống, thời kì bị bệnh lúa sớm hay muộn Tác hại chủ yếu bệnh làm cho lúa sớm tàn, nhanh chóng khơ chết, xơ xác ảnh hƣởng lớn đến việc quang hợp tích lũy chất khơ, làm giảm trọng lƣợng hạt, tỷ lệ hạt lép cao dẫn đến suất giảm sút rõ rệt [25] Trong giống mẫn cảm, vết bệnh lan rộng đến bẹ phát triển đến tận phần dƣới bẹ Trên giống kháng bệnh, xuất thấy sọc vàng mép lá, tƣợng chết mô không xuất thời gian, nhƣng sau sọc biến thành màu vàng mô bị chết Ở ruộng lúa bị bệnh nghiêm trọng, hạt bị nhiễm bệnh, vỏ hạt thấy xuất đốm màu vàng nhạt xung quanh có mép viền giọt dầu [3] Cụ thể: - Bệnh xuất mép lá, cháy dọc mép từ đầu chóp cháy xuống (cịn gọi bệnh cháy bìa lá) - Bệnh lan theo chiều gió - Buổi chiều giọt keo vi khuẩn bạc khô đọng lại mép màu vàng, nhỏ nhƣ "trứng tôm" - Đêm sƣơng: giọt keo vi khuẩn tan ra, chảy chạy dài theo mép lá, gió làm xây xát lan sang khác - Bệnh nặng: lúa cháy đặc biệt đòng cháy làm lúa lép lửng cao, giảm suất nghiêm trọng [10] Bệnh thấy xuất hạt Khi hạt xanh non vết bệnh lộ rõ Khi bơng lúa chín vết bệnh có màu xám, trắng vàng nhạt [2] 1.3.5 Biện pháp phòng trừ Khi điều kiện thuận lợi, mƣa nhiều bệnh phát triển nhanh Bệnh bạc vi khuẩn khó trị để bị nặng, số biện pháp truyền thống mà ngƣời dân thƣờng dùng từ xƣa đến nay: Vệ sinh đồng ruộng để hạn chế tối đa nguồn bệnh rơm rạ, cỏ dại, lúa chét, lúa tự mọc Có thể xử lý hạt giống nƣớc ấm 54 oC 10 phút, gieo mạ vào chân ruộng cao, không bị ngập nƣớc Thƣờng xuyên kiểm tra, theo dõi tình hình sâu bệnh, điều tiết để sinh trƣởng nhanh, chăm sóc cân đối dinh dƣỡng, hợp lý chế độ nƣớc cho ruộng lúa Bón đạm gọn, khơng bón muộn kéo dài, ý kết hợp với phân chuồng, lân, kali, tro bếp Khi bệnh chớm phát sinh, giữ nƣớc ruộng 5-10cm, lúa bắt đầu làm địng tháo cạn nƣớc vài ba ngày thiết ngừng bón đạm Khi bệnh xuất với tỉ lệ 3% - 5% số bị bệnh, phải phun thuốc hoá học Sử dụng thuốc Tilt super 300ND pha 1% phun trƣớc lúa trổ đòng tuần sau lúa phơi màu xong 10 ngày, dùng Starner 20WP, pha 0,1%-0,15% phun bệnh phát sinh gia tăng vào giai đoạn lúa đẻ nhánh xong Ngồi sử dụng loại thuốc Xanthomix 20WP, Sasa 20WP, Batocide 12WP, 22WP Nếu bệnh nặng phải phun thuốc lặp lại lần 2, cách 5-7 ngày nên đổi loại thuốc khác [9] Qua thực tế cho thấy, ruộng có mực nƣớc vừa phải khoảng 6cm, đƣợc giữ ổn định hạn chế đƣợc bệnh so với ruộng ngập sâu khơ hạn thất thƣờng Tính chống chịu giống lúa ảnh hƣởng nhiều đến mức độ bệnh Những giống lúa có tính chống chịu bệnh khá, đẻ nhánh gọn, tập trung, đứng, bề ngang hẹp, giai đoạn làm địng trổ bơng ngắn tỏ chịu đƣợc bệnh Riêng giống Trung Quốc thƣờng nhiễm bệnh nặng [10] Những biện pháp thƣờng có hiệu phịng trừ kháng bệnh 10 Bảng 3.5: Kết đánh giá khả chống chịu dòng, giống lúa thơm điều kiện nhân tạo Gen kháng STT Tên dòng giống Cấp hại Khả kháng Xa-4 Xa-5 Xa-7 Tám dự Nghi hƣơng TB TB - + + - Bắc thơm HT9 TB TB - + + - Hƣơng cốm P6 Sóc trăng 4 TB TB TB - + + + - Hƣơng thơm PC5 2 K K + + + + - 10 11 12 13 LT3 PC6 90RD M08 573 M08 2 2 K K K K + + + + + + + + - 14 CNHG164 TB - + - 15 HT6 C + + - 16 CL8 K - + - 17 AC5 TB + + - 18 N46 K + + - 19 20 Basmatin AC15 K TB + - + + - 21 89RD M08 C + + - 22 23 18 M08 56 M08 C K + + + - 24 19RD M07 TB - + - 25 160 M08 TB + + - 26 98 M08 TB - + - 27 45 M08 TB - + - 28 M08 Y - - - 29 IRBB4 K + - - 30 IRBB5 K - + - 31 IRBB7 TB - - + 32 IR24 Y - - - Ghi chú: C: kháng cao, K: Kháng khá,TB: Kháng trung bình, Y: Kháng yếu 42 (nhiễm bệnh), -: khơng mang gen kháng, +: mang gen kháng; 1) Mức bệnh hại xác định phương pháp lây nhiễm nhân tạo đó: - kháng cao, kháng khá, – kháng trung bình từ trở lên kháng yếu (nhiễm nặng) Qua bảng 3.5 thấy: Có số giống mang gen kháng Xa-4, Xa-5 gen: hƣơng cốm, AC5, 56 M08, 19 RD M08… bị nhiễm bạc mức trung bình (có thể thiếu gen kháng khác), ngƣợc lại có dịng giống mang gen kháng (18 M08) nhƣng lại có tính kháng cao (cũng giống cịn mang gen kháng khác nhƣ Xa3, Xa10…) Một số dịng, giống mang đồng thời gen có khả kháng cao nhƣ: HT6, 89 RD M08 Hầu hết dịng, giống nghiên cứu có khả kháng mức trung bình Vì cần phải nghiên cứu chi tiết khả mang gen khác nghiên cứu tiếp theo, lai quy tụ nhiều gen kháng vào giống lúa thơm để nâng cao khả kháng giống 43 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, đạt đƣợc số kết nhƣ sau: Tách chiết ADN tổng số 28 dòng, giống lúa thơm phục vụ cho cơng tác nghiên cứu Đã xác định đƣợc - Có 14/28 dịng, giống mang gen Xa-4, dịng giống: : Hƣơng thơm số 1, PC5, LT3, PC6, 90 RD M08, 573 M08, HT6, AC5, N46, Basmatin, 89 RD M08, 18M08, 56 M08, 160 M08 - 26 dòng, giống lúa mang gen Xa-5, gồm: nghi hƣơng, bắc thơm, tám dự , HT9, hƣơng cốm, P6, sóc trăng, hƣơng thơm 1, PC5, LT3, PC6, 90 RD M08, 573M08, CNHG 164, HT6, N46, Basmatin, AC15, 89 RDM08, 56M08,19RDM08, 160M08, 98M08, 45M08 - Có 13/ 28 dịng giống mang đồng thời gen Xa – Xa – là: Hƣơng thơm số 1, PC5, LT3, PC6, 90 RD M08, 573 M08, HT6, AC5, N46, Basmatin, 89 RD M08, 56 M08, 160 M08 Qua kết đánh giá khả chống chịu dòng, giống điều kiện nhân tạo thấy: - Có 3/28 dịng , giống có khả kháng cao với bệnh bạc lá, là: HT6, 18 M08, 89 RD M08 - Có 10/28 dịng, giống có khả kháng gồm: Hƣơng thơm 1, PC5, LT3, PC6, 90RDM08, 573M08, CL8, N46, Basmatin, 56 M08 4.2 Đề nghị - Tiếp tục xác định gen kháng bạc khác giống lúa thơm - Nghiên cƣú kết hợp, quy tụ nhiều gen kháng vào dòng, giống lúa để tạo đƣợc giống lúa có suất, chất lƣợng tốt đồng thời chống chịu cao với nhiều nòi vi khuẩn bạc 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2002), Genom học chức công nghệ gen, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Tuất, Phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Hà Minh Trung (1983), Bệnh hại lúa, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quang Thọ (1989), Bệnh thường gặp lúa, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề (1998) Bệnh nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình (1997), Cơng nghệ sinh học chọn tạo trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Đái Duy Ban (2005), Công nghệ gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2000), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội http://www.bacninh.gov.vn 10.http://www.lrc.ctu.edu.vn 11.http://vn.answers.yahoo.com 12 http://muivi.com 13.Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2008), Áp dụng thị phân tử xác định gen thơm số giống lúa, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 14.Lê Lƣơng Tề - Bùi Trọng Thủy(2008), Nghiên cứu số Xa - gen, Đại học Nơng nghiệp - Hà Nội 15.Lê Đình Lƣơng (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 45 Tài liệu tiếng anh 16.Ahn, S.N 1992 RFLP tagging of a gene for aroma in rice Theor AAppl Genet 84: 825-828 17.Buttery R.G., Ling L.C., Juliano B.O ADN Turnbaugh J.G 1983 Cooked rice aroma ADN 2-acetyl-1-pyrroline J Agric Food Chem 31: 823–826 18.Buttery, R.G et al 1982 2-acetyl-1-purrline: an important aroma component of cooked rice Chem Ind, London Page: 958 19.Chen Saihua, Wu Juan, Yang Yi, Shi Weiwei ADN Xu Mingliang 2006 The fgr gene responsible for rice fragrance was restricted within 69 kb Plant Science 171: 505–514 20 Lorieux, M et al.1996 Aroma in rice: Genetic analysis of a quantitative traits Theo Appl Genet 93:1145- 1151 21.Theerayut Toojinda et al 2004 Breeding super Jasmine rice The 1st International Conference on Rice for the Future Kasetsart University, Bangkok page 81 22.Yajiima, I Et al 1978 Volatile flavor component of cooked rice Agric Biol Chem 42:1229 23.Khush Gs (1997), “ Origin, dispersal, Cultivation and variation of rrice” plant Mol Biol,35:25-34 24.Khush Gs, Toenniessen Gh (1991), Rice Biotechnology; Biotechnology in Agriculture, No,6 International Rice Reasearch Institute, Philippin 25.Robinson C (1998), Rice biotechnology, plant Sciences reasearch programe, USA 26.Ronald, P.C (1997), “ The molecular basis of disease resistance in rice”, plant molecular biology, 35:179-186 27.Molecularplant pathology (2006), 7(5), 303-324 27 http://microbe.dna.affrc.go.jp/Xanthomonas/xantho/index.html 46 BẢNG SỐ LIỆU Phụ biểu 01: Danh sách dòng giống nghiên cứu STT Tên dòng giống STT Tên dòng giống Tám dự 15 HT6 Nghi hƣơng 16 CL8 Bắc thơm 17 AC5 HT9 18 N46 Hƣơng cốm 19 Basmatin P6 20 AC15 Sóc trăng 21 89 RD M08 Hƣơng thơm1 22 18M08 PC5 23 56M08 10 LT3 24 19RDM07 11 PC6 25 160M08 12 90 RD M08 26 98M08 13 573 M08 27 45M08 14 CNHG164 28 1M08 Phụ luc 02: Hoá chất thiết bị sử dụng a, Hoá chất Các hoá chất dùng cho sinh học phân tử đƣợc mua hãng: New England Biolab…… Hoá chất tách chiết AND Thành phần đệm tách chiết ADN Thành phần Stock làm việc Hỗn hợp làm việc(10ml) 1M 50mM 0.5ml 0.5M 0.25mM 0.5ml NaCl 5M 300mM 0.6ml SDS 10% 1% 1ml Tris- HCl(pH=8) EDTA(pH=8) Stock mẹ H2O 7.4ml 47 Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Stock mẹ Stock làm việc Hỗn hợp làm việc Tris -HCl(pH=8) 1M 10mM 0.5ml EDTA(pH=8) 0.5M 1mM 0.1ml H2O 49.4ml b, Thiết bị Máy PCR, máy điện di, máy đo quang phổ, máy ly tâm, máy đo nồng độ ADN Nanodrop, pipet loại, máy chụp ảnh gel, máy đô mật độ vi khuẩn… 48 Phụ biểu 03: Chiều cao dòng giống nghiên cứu giai đoạn mạ (cm) STT Tên dòng, giống Tám dự Nghi hƣơng Bắc thơm HT9 Hƣơng cốm P6 Sóc trăng Hƣơng thơm1 PC5 10 LT3 11 PC6 12 90 RD M08 13 573 M08 14 CNHG164 15 HT6 16 CL8 17 AC5 18 N46 19 Basmatin 20 AC15 21 89 RD M08 22 18M08 23 56M08 24 19RDM07 25 160M08 26 98M08 27 45M08 28 1M08 Ngày 20/2 1,50 1,25 1,35 1,45 1,34 1,45 1,28 1,50 1,35 1,45 1,26 1,45 1,35 1,45 1,25 1,35 1.37 1,25 1,34 1,45 1,36 1,35 1,37 1,45 1,25 1,33 1,45 1,33 Ngày 27/2 8,50 5,60 6,80 7,50 6,90 7,40 7,40 6,75 7,60 6,70 7,45 7,50 6,85 7,55 7,50 6,80 7,50 6,80 7,55 7,50 7,60 6,50 7,40 7,45 6,50 7,50 6,80 6,70 49 Ngày 6/3 15,00 12,50 13,50 14,50 13,50 14,00 14,50 13,50 15,00 13,30 14,50 14,50 13,70 14,80 14,60 13,60 14,50 13,70 14,60 14,40 14,70 13,30 14,30 14,60 13,80 14,50 13,50 13,70 Ngày 13/3 28,50 27,50 25,60 24,70 19,50 18,50 18,40 20,50 21,50 20,70 22,40 21,40 21,00 22,40 21,50 20,50 22,50 21,40 19,80 20,50 23,40 23,50 20,40 20,50 23,40 24,50 21,60 21,60 Ngày 20/3 34,50 32,00 30,00 28,00 25,00 26,50 23,00 27,00 27,00 27,00 28,00 26,00 27,00 28,00 24,00 25,00 27,00 26,00 23,50 25,00 26,00 27,00 24,00 25,00 28,00 30,00 28,00 25,00 Phụ biểu 04: Chiều cao lúa dòng giống nghiên cứu (cm) Ngày Ngày STT Tên dòng giống 20/2 27/2 Ngày 6/3 Ngày Ngày Ngày 13/3 20/3 27/3 Ngày Ngày 3/4 10/3 Tám dự 38,40 48.80 67.70 73.30 78.20 82.80 96.90 100.80 Nghi hƣơng 34,90 47.80 67.30 75.00 79.80 84.30 93.70 100.20 Bắc thơm 35.40 45.80 65.50 73.70 78.60 82.70 91.70 108.50 HT9 35.70 45.70 66.70 71.10 74.50 79.60 87.80 Hƣơng cốm 36.80 43.80 63.20 71.60 75.60 80.20 90.70 100.40 P6 34.20 43.60 63.90 71.80 75.50 79.800 88.60 Sóc trăng 35.60 44.60 66.10 73.10 78.40 82.30 92.60 110.60 Hƣơng thơm1 36.20 44.80 65.80 71.70 76.60 81.60 92.10 110.70 PC5 35.70 45.60 64.50 75.20 79.20 84.60 95.80 112.20 10 LT3 34.60 46.10 66.80 72.80 76.90 81.20 94.50 111.80 11 PC6 34.90 45.80 67.20 73.50 77.80 82.20 95.60 112.80 12 90 RD M08 35.10 46.30 65.70 74.60 78.20 82.60 93.20 112.80 13 573 M08 35.50 46.70 64.50 75.10 80.20 84.60 95.80 114.30 14 CNHG164 36.30 47.70 65.60 72.20 76.80 80.50 92.60 110.70 15 HT6 34.40 48.10 65.20 73.80 78.80 82.60 93.60 112.40 16 CL8 35.80 46.30 63.500 73.50 79.60 83.20 94.20 111.50 17 AC5 34.90 44.90 66.80 74.40 78.20 82.40 92.50 108.50 18 N46 36.10 45.20 64.70 74.30 79.60 83.20 93.70 110.70 19 Basmatin 35.30 46.20 64.70 72.80 78.20 81.90 92.40 107.60 20 AC15 36.60 46.80 67.30 73.70 79.80 82.60 92.80 108.20 21 89 RD M08 35.70 45.70 65.80 73.20 81.20 85.20 96.50 113.40 22 18M08 34.80 45.30 63.80 73.80 81.50 85.50 95.60 112.90 23 56M08 35.60 47.30 64.20 74.50 82.50 85.70 97.80 114.20 24 19RDM07 35.60 47.30 65.10 74.00 79.80 83.20 94.30 111.70 25 160M08 34.70 48.0 63.50 72.90 78.90 82.60 93.40 110.90 26 98M08 34.50 45.20 65.50 73.40 78.60 82.60 93.70 110.10 27 45M08 35.90 46.60 64.50 72.70 77.80 81.70 92.80 108.30 28 1M08 36.10 47.20 66.20 73.50 78.70 82.80 93.80 110.80 50 98.70 98.20 Phụ biểu 04: Kết đánh giá lây nhiễm dòng giống Lần STT Tên dòng giống Lần Điểm Khả kháng Lần Điểm Khả kháng Điểm Khả kháng Tám dự TB TB TB Nghi hƣơng TB TB TB Bắc thơm TB TB TB HT9 TB TB TB Hƣơng cốm TB TB P6 K TB Sóc trăng K TB Hƣơng thơm K K TB PC5 K TB K 10 LT3 K K K 11 PC6 K TB K 12 90RD M08 K K K 13 573 M08 TB K 14 CNHG164 TB K TB 15 HT6 C C K 16 CL8 K TB K 17 AC5 TB TB K 18 N46 K TB K 19 Basmatin 2 K K 20 AC15 K TB 21 89RD M08 K C 22 18 M08 K C 23 56 M08 K K 24 19RD M07 TB K 25 160 M08 4 TB K 26 98 M08 TB TB K 27 45 M08 TB TB TB 28 M08 Y Y TB TB TB TB K K TB C C K TB TB 51 Phụ biểu 05: Chiều dài vết bệnh lây nhiễm bạc (cm) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Tên dòng Lần giống L vết bệnh Tám dự 7,50 Nghi hƣơng 7.75 Bắc thơm 5.20 HT9 5.45 Hƣơng cốm 7.50 P6 7.12 Sóc trăng 5.45 Hƣơng thơm 3.60 PC5 3.45 LT3 3.15 PC6 3.75 90 RD M08 3,30 573 M08 3.50 CNHG 164 7.45 HT6 1.55 CL8 3.45 AC5 7.50 N46 3.45 Basmatin 3.75 AC15 5.50 89 RD M08 1.60 18 M08 1.15 56 M08 5.35 19 RD M07 7.50 160 M08 7.40 98 M08 5.44 45 M08 5.85 M08 8.45 52 Lần Lần L vết bệnh L vết bệnh 5.45 6.45 7.75 5.50 7.40 5.20 7.75 6.45 6.15 5.00 4.15 7.10 3.75 745 3.45 3.45 5.55 3.45 3.40 3.20 5.75 3.50 3.45 3.45 7.45 3.30 3.40 5.40 1.20 3.20 7.40 3.40 4.00 5.75 5.15 3.20 3.45 3.45 3.45 7.30 3.45 1.45 3.20 1.10 3.50 3.50 5.45 4.00 7.55 3.20 7.45 3.45 7.00 7.50 9.50 8.10 NHẬT KÝ THỰC TẬP Ngày 15/1/09 ngâm ủ dòng, giống Ngày 20/1/09 gieo hạt dòng, giống vào chậu vại nhà kính Ngày 4/2/09 thu lúa để tách chiết ADN Ngày 20/2/09 Cấy mạ vào chậu, chăm sóc để phục vụ lây nhiễm Từ ngày 27/2 đến 30/4/09 theo dõi sinh trƣởng, phát triển dòng, giống lúa thơm Từ ngày 25/3 đến 25/4 chạy PCR kiểm tra có mặt gen kháng dòng, giống lúa Từ ngày 20/4 đến 8/5/09 Đánh giá kết lây nhiễm dòng, giống với bệnh bạc 53 DANH SÁCH CÁC HÌNH BẢNG Tên hình ảnh Hình Bệnh bạc lúa khuẩn Xanthomonas oryzae gây Hình Khuẩn lạc Xanthomonas oryzae (A) biểu bệnh lúa (B) Hình 3.1.1 Kết kiểm tra độ tinh ADN Hình 3.1.2a,b Kết kiểm tra có mặt Xa-4 dịng, giống thí nghiệm Hình 3.1.3a,b Kết kiểm tra có mặt Xa-5 dịng, giống thí nghiệm Hình 3.1.4a,b Kết kiểm tra có mặt Xa-7 dịng, giống thí nghiệm Bảng 3.1.1 Hàm lƣợng độ tinh ADN 10 ngẫu nhiên máy Nanodrop Bảng 3.1.2 Kết phân tích có mặt gen kháng Xa-4 PCR dòng giống lúa thí nghiệm Bảng 3.1.3 Kết phân tích có mặt gen kháng Xa-5 PCR dịng giống lúa thí nghiệm Trang 6 26 28 30, 31 32, 33 27 29 31 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển dịng, giống giai đoạn mạ Đặc điểm nơng học hình thái dịng giống lúa thí nghiệm 34 36 Kết tổng hợp gen kháng bạc dòng, giống lúa thơm nghiên cứu 39 Bảng 3.5 Kết đánh giá khả chống chịu dòng, giống lúa thơm điều kiện nhân tạo 41 54 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung lúa 1.2 Giới thiệu lúa thơm 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái nông học lúa thơm 1.2.3 Các nghiên cứu gen quy định tính trạng mùi thơm lúa 1.3 Bệnh bạc lúa 1.3.1 Bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv Oryzicola) 1.3.2 Vi khuẩn Xanthomonas Oryzae gây bệnh bạc lúa 1.3.3 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 1.3.5 Biện pháp phòng trừ 10 1.4 Những nghiên cứu Xa - gen kháng bệnh bạc lúa 11 1.5 Phƣơng pháp xác định gen kháng bệnh 13 1.6 Ứng dụng CNSHTV chọn tạo giống kháng bệnh bạc 14 Chƣơng 16 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.1.1 Mục tiêu chung 16 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 16 2.4 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm 17 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Phƣơng pháp luận 17 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể 17 2.4.4 Phƣơng pháp thu thập số liệu 23 Chƣơng 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ lúa 25 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 25 55 3.1.2 Kết xác định có mặt Xa-4 dòng, giống lúa thơm 27 3.1.3 Kết xác định có mặt gen kháng Xa-5 dòng, giống lúa 29 3.1.4 Kết xác định có mặt gen kháng Xa-7 dòng, giống lúa 32 3.2 Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển dòng, giống lúa giai đoạn mạ 34 3.3 Động thái tăng trƣởng lúa 36 3.4 Kết phân tích khả mang gen kháng bạc dòng, giống lúa thơm 39 3.5 Đánh giá khả kháng bệnh bạc dòng, giống lúa thơm 40 Chƣơng 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 56 ... gạo thơm chất lƣợng cao giới Dựa sở thực tiễn đó, tiến hành đề tài: ? ?Xác định gen kháng bạc phổ rộng số giống lúa thơm chất lượng cao ” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung lúa. .. Mục tiêu chung Xác định đƣợc có mặt hay khơng gen kháng bạc phổ rộng Xa4, Xa5, Xa7 số dòng, giống lúa thơm chất lƣợng cao nhằm chọn tạo đƣợc giống lúa thơm mang gen kháng bệnh bạc đặc hiệu 2.1.2... số dòng, giống lúa thơm mang gen kháng bạc đặc hiệu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết ADN tổng số từ lúa có hàm lƣợng độ tinh cao - Xác định gen kháng bạc phổ rộng Xa4, Xa5, Xa7 28 dòng, giống