Nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh invitro cây dầu mè jatropha curcas l qua phôi soma từ mảnh lá

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM KHOA LÂM HỌC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO MƠ SẸO VÀ TÁI SINH IN VITRO CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) QUA PHÔI SOMA TỪ MẢNH LÁ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 307 Giáo viên hướng dẫn: ThS Hồ Văn Giảng ThS Nguyễn Thị Thu Hằng Sinh viên thực : Đào Thị Toan Khoá học : 2005 – 2009 Hà Nội - 2009 LỜI CẢM ƠN Nhằm đánh giá chất lượng học tập sinh viên để hồn tất chương trình đào tạo sinh viên trường Đại học Lâm nghiệp, đồng ý Ban Chủ nhiệm Khoa Lâm học, môn Giống Công nghệ sinh học, tiến hành thực hiên đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo mô sẹo tái sinh in vitro Dầu mè (Jatropha curcas L.) qua phôi soma từ mảnh lá”, hướng dẫn ThS Hồ Văn Giảng ThS Nguyễn Thị Thu Hằng – Trung tâm Giống Công nghệ sinh học –Trường Đại học Lâm nghiệp Sau thời gian thực tập với tinh thần làm việc khẩn trương tích cực, đến khố luận hồn thành Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Hồ Văn Giảng ThS Nguyễn Thị Thu Hằng người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình thực khố luận Trong q trình thực tập, tơi giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thầy cô giáo Trung tâm Giống Công nghệ sinh học – Khoa Lâm học, cán viên chức thuộc trung tâm Giống Công nghệ sinh học – Trường Đại học Lâm nghiệp Ngoài ra, từ ngày đầu thực khóa luận tốt nghiệp tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình KS Đỗ Quang Trung - cán Trung tâm, qua đây, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Khóa luận hồn thành khơng thể khơng kể đến giúp đỡ mặt tinh thần người thân bạn bè Những người ln bên tơi, động viên khích lệ, giúp tơi hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Đào Thị Toan MỞ ĐẦU Xã hội ngày phát triển, nhu cầu lượng ngày tăng Trong đó, nguồn tài nguyên, nhiên liệu giới vô tận Theo dự báo nhà khoa học, đến khoảng năm 2050 – 2060, khơng tìm nguồn lượng thay nguồn lượng sử dụng (xăng, dầu mỏ), giới lâm vào khủng hoảng thiếu lượng nghiêm trọng [25] Vì lý đó, nhà khoa học nỗ lực tìm kiếm nhiên liệu thay thế, có nhiên liệu sinh học (biofuel) Nhiên liệu sinh học nguồn lượng chiết suất từ nguyên liệu thực vật như: mía đường, lúa gạo, ngơ, cải dầu, hướng dương, đậu nành, bông, dầu cọ… Gần người ta tách chiết diesel sinh học từ Dầu mè (Thái Xuân Du, 2006) Theo thống kê năm 2006, hàng năm nước ta phải dùng hàng tỷ đô la Mỹ để nhập nhiên liệu có nguồn gốc dầu mỏ phục vụ cho giao thông vận tải nhu cầu khác [25] Do đó, tìm nguồn nhiên liệu thay nước hàng năm tiết kiệm số ngoại tệ lớn Để đạt mục tiêu đó, việc gây trồng lồi cung cấp nhiên liệu sinh học nghiên cứu công nghệ chiết suất, chế biến loại nhiên liệu việc làm có ý nghĩa Trong số lồi cung cấp nhiên liệu sinh học, Dầu mè (Jatropha) lồi đa mục đích: ngồi giá trị cung cấp sản phẩm diesel sinh học Dầu mè dùng làm thuốc chữa trị số bệnh [24] Hạt Dầu mè chứa từ - 40 % dầu nhớt với hàm lượng chất hydrocacbon lỏng cao sử dụng trực tiếp để vận hành động chạy diesel Mặt khác, trộn dầu Dầu mè với nguyên liệu diesel để tạo nhiên liệu diesel sinh học Dầu chiết suất từ Dầu mè nguồn nhiên liệu sạch, giúp giảm thiểu lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính, đặc biệt khơng có lưu huỳnh nên thân thiện với mơi trường, có độ nhớt cao giảm hao mịn động Q trình tinh chế dầu từ Dầu mè thô thành sản phẩm diesel sinh học tạo sản phẩm phụ glycerine - chất cần thiết cho công nghiệp mỹ phẩm, công nghiệp dược phẩm công nghiệp thực phẩm [25] Trong năm gần đây, Dầu mè đối tượng nhiều nước quan tâm, nghiên cứu theo nhiều hướng khác như: nghiên cứu kỹ thuật gây trồng, nhân giống, nghiên cứu phương pháp làm tăng suất chất lượng hạt, nghiên cứu công nghệ chế biến sử dụng sản phẩm… Giống Dầu mè cho suất cao, chất lượng tốt tạo kỹ thuật chuyển gen, chọn dòng tế bào thông qua nuôi cấy in vitro… Một vật liệu cho nghiên cứu mơ sẹo, việc nghiên cứu tạo mơ sẹo tái sinh từ mơ sẹo có ý nghĩa Trên sở thực tiễn đó, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu tạo mô sẹo tái sinh in vitro Dầu mè (Jatropha curcas L.) qua phôi soma từ mảnh lá” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nhân giống nuôi cấy mơ tế bào thực vật, hay cịn gọi vi nhân giống phương pháp sản xuất hàng loạt từ phận (cơ quan, mô, tế bào) cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện vơ trùng tuyệt mơi trường thích hợp kiểm sốt Thuật ngữ “ni cấy mơ tế bào thực vật” hay “nuôi cấy in vitro” khái niệm tất loại quan, mô tế bào nuôi cấy điều kiện vô trùng, bao gồm: nuôi cấy cây, nuôi cấy quan, nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào đơn lẻ, nuôi cấy tế bào trần [1] 1.1.2 Cơ sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào * Tính tồn (totipotence) Năm 1902, lần nhà thực vật học người Đức - Haberlandt đưa quan niệm: “Mỗi tế bào (đã biệt hoá) lấy từ thể thực vật có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh” Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ biệt hố chứa thơng tin di truyền (ADN) cần thiết thể đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào có khả phát triển thành thể hồn chỉnh, tính tồn tế bào thực vật Tính tồn tế bào sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Cho đến nay, người hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [1] * Sự biệt hố phản biệt hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự biệt hoá tế bào chuyển hoá tế bào phơi sinh thành tế bào mơ chun hố đảm nhận chức khác thể Q trình gồm có giai đoạn: - Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên cách đáng kể - Sự dãn tế bào: Tế bào dãn chiều ngang chiều dọc làm tăng kích thước quan nói riêng tồn thể nói chung Sau hai giai đoạn này, tế bào phân hoá thành mơ có chức riêng biệt, đảm nhận vai trò khác thể sống Tuy nhiên, tế bào biệt hoá thành mơ chức chúng khơng hồn tồn khả phân chia Trong điều kiện định tế bào lại trở thành dạng tế bào phôi sinh để tiếp tục trình phân chia cho tế bào Đây q trình phản biệt hố tế bào Q trình biệt hố phản biệt hố tế bào biểu thị sau: Biệt hố tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản biệt hoá tế bào Sơ đồ 1.1: Q trình biệt hố phản biệt hố tế bào Về chất biệt hố phản biệt hố kết q trình điều hồ hoạt hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen bị ức chế hoạt hoá trở lại để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mơ thể, thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tế bào tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi gen hoạt hố, q trình diễn biến theo chương trình định sẵn gen [1, 16, 23] 1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng tới q trình ni cấy in vitro 1.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy cung cấp chất cần thiết cho tăng trưởng phân hố mơ suốt q trình ni cấy in vitro Hầu hết loại môi trường bao gồm nhóm chất sau đây: Các loại muối khoáng, nguồn cácbon, vitamin, chất điều khiển sinh trưởng, nhóm chất bổ sung chất độn [1, 23] * Các ngun tố khống: mơi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào thực vật chia thành nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng nhóm vi lượng - Các nguyên tố khoáng đa lượng: Bao gồm nguyên tố khoáng sử dụng nồng độ lớn 30 ppm, tức 30mg/l Những nguyên tố là: N, S, P, K, Mg Ca Riêng Na Cl sử dụng vài loại môi trường, chưa rõ vai trò chúng + Nitơ (N): Được sử dụng hai dạng NO3- NH4+ riêng rẽ phối hợp với Điều đáng lưu ý dùng ammonium (khơng có nitrat) sinh trưởng tế bào giảm, chí ngừng hồn tồn Vì hầu hết loại môi trường dùng nitrat ammonium dạng phối hợp, tuỳ theo đặc tính hấp thu nitơ lồi mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp [1] + Lưu huỳnh (S): Chủ yếu tốt muối SO4- Các dạng ion khác SO3 SO2 thường tác dụng, chí cịn độc + Photpho (P): Mơ tế bào thực vật ni cấy có nhu cầu photpho cao Photpho thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic Ngoài ra, photpho dạng H2PO4- HPO42- cịn có tác dụng hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH mơi trường q trình ni cấy - Các nguyên tố vi lượng: Là nguyên tố sử dụng nồng độ thấp 30 ppm Đó Fe, B, Mn, Cu, Sn, Ni, Co + Sắt (Fe): Thiếu Fe làm giảm lượng ARN giảm khả sinh tổng hợp protein, làm tăng lượng ADN amino axit tự Kết làm giảm phân bào [1] + Mangan (Mn): Thiếu Mn làm cho hàm lượng amino axit tự ADN tăng lên, lượng ARN sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến phân bào + Bo (B): Thiếu Bo môi trường gây nên biểu thừa auxin thực tế Bo làm cho chất ức chế auxin oxydase tế bào giảm Mơ ni cấy có biểu mơ sẹo hố mạnh, thường loại mô sẹo xốp, mọng nước, tái sinh + Molypden (Mo): Là ion đóng vai trị co-factor hệ thống nitrat reductaza, Mo tác động trực tiếp lên trình trao đổi đạm tế bào thực vật * Nguồn cacbon: Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, nhiều trường hợp chúng sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo lục lạp có khả quang hợp Vì việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cácbon hữu bắt buộc Nguồn cácbon thông dụng kiểm chứng sucrose Nồng độ thích hợp phổ biến 2-3 % (w/v), song phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay đổi, có xuống tới 0,2 % (chọn dòng) tăng lên tới 12% (nhằm gây cảm ứng stress trước) Tiếp đến glucose maltose hay đưa vào môi trường nuôi cấy Các loại đường khác fructose, raffinose, lactose, galactose…cũng thử nghiệm tỏ hiệu dùng trường hợp đặc biệt * Vitamin: Mặc dù tất loại mơ tế bào thực vật có khả tự tổng hợp hầu hết loại vitamin, thường khơng đủ lượng, phải bổ sung thêm từ bên vào, đặc biệt vitamin thuộc nhóm B Vitamin B1 (Thiamin HCl Aneurin), Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin), Vitamin B6 (Pyridoxin, Adernin) Myo inosytol (Bios I) có vai trị sinh tổng hợp thành tế bào Biotin (Bios II) cần thiết cho phân bào số loại mô Pantothetic axit (Bios III, Vit.B5) sử dụng để làm thành phần coenzym A * Các hỗn hợp chất tự nhiên: Ngày người ta sử dụng thêm số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên để làm phong phú thêm môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mỳ, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, hỗn hợp amino axit nhân tạo … [1] * Chất độn (thạch /agar): Là loại polysaccarit thu từ số lồi tảo, có tác dụng làm môi trường rắn lại Ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng 400C trở trạng thái đặc Khả ngậm nước thạch 7-12 g/l nước Do ni cấy mơ người ta thường sử dụng thạch nồng độ 0,7-1,2% (w/v) [1,23] * Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohoocmon chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng phát triển thực vật Chúng đóng vai trị quan trọng trình sinh trưởng phát triển thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… Ngồi cịn ảnh hưởng đến q trình lão hố mơ nhiều q trình khác Các phytohoocmon chia thành nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberellin, Ethylen, Absixic Axit Chúng yếu tố quan trọng môi trường định đến thành công kết ni cấy Ngồi ra, cần phải ý tới độ pH mơi trường ảnh hưởng rõ nét tới khả hồ tan chất khống môi trường, ổn định môi trường, khả hấp thụ chất dinh dưỡng Nếu pH thấp (7,0) gây ức chế sinh trưởng, phát triển nuôi cấy in vitro Nên việc xác định độ pH ban đầu mơi trường cho q trình sinh trưởng phát triển mô nuôi cấy cần thiết Độ pH thường sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 5,8 [1, 23] 1.2.2 Môi trƣờng vật lý Trong nuôi cấy in vitro yếu tố môi trường vật lý quan tâm ánh sáng, nhiệt độ độ ẩm + Ánh sáng: Đây yếu tố cần thiết cho phát triển phát sinh hình thái mơ ni cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thơng qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng ánh sáng + Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới phân chia tế bào q trình sinh hố Tuỳ thuộc vào nguồn gốc mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Thường nhiệt đới đòi hỏi nhiệt độ cao so với ơn đới Nhìn chung nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng tốt nhiều loài 250C (White, 1973) [6] + Độ ẩm: Trong bình ni cấy độ ẩm tương đối thường đạt khoảng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề độ ẩm nuôi cấy [6] 1.2.3 Vật liệu nuôi cấy Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy định đến thành bại trình nhân giống in vitro Về ngun tắc tế bào mơ chun hố có tính tồn năng, nghĩa nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy loại tế bào loại mơ khác có mức độ nuôi cấy thành công khác Một nguyên tắc nuôi cấy mô tế bào tế bào làm vật liệu nuôi cấy non trẻ khả ni cấy thành cơng cao Như vậy, tế bào mô phôi non triển vọng nhất, đến tế bào đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, non, thượng tầng…, sau tế bào sinh dục noãn bào tế bào hạt phấn giai đoạn non [1] Kết thí nghiệm cho thấy chất lượng chồi tạo thành hai công thức thí nghiệm tốt Chồi dài 0,1 – 0,8 cm sau tuần nuôi cấy Chồi màu xanh đậm, dị dạng Kết phân tích phương sai nhân tố ảnh hưởng than hoạt tính cho - Tỷ lệ mẫu tạo phơi: Ftính =17,3 > F0,05 = 7,7 (phụ biểu 5b) - Tỷ lệ mẫu tạo chồi: Ftính = 10,03 > F0,05 = 7,7 (phụ biểu 5b) - Số chồi TB/cụm: Ftính = 125,6 > F0,05 = 7,7 (phụ biểu 5b) Chứng tỏ than hoạt tính ảnh hưởng tới khả phát sinh phôi, tái sinh chồi số chồi TB/cụm Mô sẹo cấy vào môi trường tái sinh có than hoạt tính tăng sinh mạnh (kích thước khối mơ sẹo lớn hơn) đồng thời số lượng phơi tăng lên, tỷ lệ mẫu tạo chồi cao số lượng chồi/cụm nhiều Cụ thể, mơi trường S (khơng có than hoạt tính) cho tỷ lệ mẫu tạo chồi 71,11%, mơi trường ST (có than hoạt tính) tỷ lệ 79,26% Tương tự, môi trường số chồi TB/cụm 6,79 8,42 chồi Vậy mơi trường thích hợp cho phát sinh phơi tái sinh chồi từ mơ sẹo có nguồn gốc từ mảnh Dầu mè là: MS + 1,5 mg/l BAP + 0,05 mg/l IBA + 0,5 mg/l GA3 + g/l than hoạt tính Hình 3.10 Mơ sẹo mơi trường có THT khơng có THT sau tuần ni cấy 45 Hình 3.11 Cụm chồi Dầu mè mơi trường có than hoạt tính sau tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng hóa học đến khả sinh trƣởng chồi BAP chất điều hồ sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế hoá già tế bào Các chất thuộc nhóm có tác dụng lên q trình trao đổi chất, trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein làm tăng cường hoạt tính số enzyme IBA NAA chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, có tác dụng kích thích hình thành mơ sẹo rễ bất định, kích thích pha giãn tế bào Các chồi phát sinh môi trường tái sinh chồi cấy chuuyển sang mơi trường có bổ sung tổ hợp BAP với IBA NAA để kích thích sinh trưởng chồi Kết thí nghiệm quan sát sau tuần ni cấy thể bảng 3.5 mô hình 3.12 Bảng 3.5.Ảnh hưởng tổ hợp BAP với IBA NAA đến khả sinh trưởng chồi Dầu mè sau tuần nuôi cấy ĐC J1 BAP (mg/l) 0,5 NAA (mg/l) 0,1 IBA (mg/l) - Chiều cao TB/ chồi 0,93 1,37 Số TB/chồi 1,07 1,37 Chất lượng chồi X X Mô sẹo gốc * ** J2 J3 J4 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,1 0,5 3,07 2,3 2,5 2,03 1,47 T TB X * ** *** CT 46 47 Ghi chú: *: Mô sẹo gốc nhỏ (0.5 cm) **: Mô sẹo gốc trung bình (0,5-1 cm) ***: Mơ sẹo gốc lớn (1-1,5 cm) 3.5 2.5 1.5 0.5 X: Xấu TB: Trung bình T: Tốt 3.07 2.5 2.3 2.03 0.93 1.07 ĐC 1.47 1.37 1.37 1.03 J1 J2 J3 Chiều cao TB (cm) Số TB (lá) J4 Công thức thí nghiệm Hình 3.12: Ảnh hưởng thành phần mơi trường hóa học đến sinh trưởng chồi Dầu mè Kết phân tích phương sai về: - Chiều cao trung bình chồi cho Ftính = 68,8 > F0,05 = 3,48 (phụ biểu 6b) - Số TB/chồi: Ftính =20,3 > F0,05 = 3,48 (phụ biểu 6b) Chứng tỏ sử dụng chất kích thích sinh trưởng với hàm lượng khác có ảnh hưởng khác đến khả sinh trưởng chồi Kết bảng 3.5 cho thấy việc bổ sung tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng giúp chồi sinh trưởng mạnh nhiều so với đối chứng (khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng) Trong cơng thức thí nghiệm cơng thức J2 (0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA) cho hiệu cao Sau tuần nuôi cấy, chiều cao trung bình chồi đạt 3,07 cm, vượt 2,14 cm so với đối chứng Ngồi cơng thức chồi có chất lượng tốt chồi mảnh, số trung bình 2,5 So sánh J1 J2, J3 J4 cho thấy sử dụng hàm lượng, IBA tỏ hiệu NAA Sử dụng tổ hợp BAP IBA cho chồi sinh trưởng tốt hơn, mô sẹo gốc nhỏ (0,5-1 cm) so với chồi 48 môi trường sử dụng NAA (1–1,5cm) Có thể khơng bị phát sinh thêm mô sẹo gốc nên chồi sinh trưởng tốt Cụ thể, chiều cao trung bình chồi công thức J1, J3, J4 là: 1,37cm, 2,3 cm cm, tương ứng độ vượt so với công thức đối chứng là: 0,44 cm, 1,37 cm 0,07 cm Số trung bình chồi môi trường J2, tương ứng là: 1,37, 2,03 1,47 So sánh hai công thức J2 J3 sử dụng IBA hàm lượng khác cho kết khác nhau: Sử dụng BAP IBA hàm lượng dẫn đến mô sẹo gốc phát triển mạnh (0,5-1cm), gây ảnh hưởng đến khả sinh trưởng mẫu Khi giảm hàm lượng IBA xuống 0,1 mg/l kết thu tốt Chồi Dầu mè môi trường J2 sinh trưởng chiều cao nhanh, mô sẹo gốc nhỏ (khoảng 0,5cm) Vậy thơng qua kết thí nghiệm kết luận cơng thức mơi trường tốt để kích thích sinh trưởng chồi Dầu mè cơng thức J2: MS + 0,5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA Hình 3.13 Chồi Dầu mè mơi trường ĐC chồi môi trường J2 (0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA) sau tuần nuôi cấy 3.6 Ảnh hƣởng thành phần mơi trƣờng hóa học đến khả tạo hồn chỉnh Trong ni cấy in vitro, môi trường chứa đầy đủ loại chất dinh dưỡng cho Tuy nhiên, tuỳ loài mà sử dụng với nồng độ 49 Tham khảo nhiều nghiên cứu chúng tơi nhận thấy lồi khác sử dụng mơi trường ni cấy không giống Thường môi trường hay sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog) Trong trường hợp tạo hồn chỉnh (tạo rễ) người ta sử dụng mơi trường MS mơi trường ½ MS Trong tự nhiên, rễ có tính hướng địa (trừ số loài đặc biệt, VD: Bụt mọc) Than hoạt tính có tác dụng làm thay đổi ánh sáng bên môi trường nuôi cấy, làm cho môi trường thạch tối Do chúng tơi có tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến khả rễ chồi Dầu mè Để kích thích khả rễ chồi in vitro, nhà khoa học thường sử dụng chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin để kích thích rễ Tham khảo số tài liệu thấy sử dụng IBA từ 0,3 mg/l thích hợp cho rễ in vitro Dầu mè [40], nên bổ sung 0,3 mg/l IBA vào tất công thức thí nghiệm Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.7: Bảng 3.6: Ảnh hưởng thành phần mơi trường hóa học đến khả rễ chồi Dầu mè CT Thành phần môi trường Tỷ lệ mẫu rễ (%) R1 1/2 MS+ 0,3 mg/l IBA R2 1/2 MS+0,3 mg/l IBA+1 g/l THT R3 MS+ 0,3 mg/l IBA R4 MS+ 0,3 mg/l IBA+ 1g/l THT 77,78 44,44 0 50 Số rễ TB Chiều dài rễ TB (cm) 4,83 2,85 3,67 2,42 80 77.8 70 60 50 Tỷ lệ rễ (%) 44.4 40 30 20 10 0 R1 R2 R3 R4 Cơng thức thí nghiệm Hình 3.14 Ảnh hưởng thành phần mơi trường hóa học đến khả rễ chồi Dầu mè Kết phân tích phương sai (phụ biểu 07b) cho: - Tỷ lệ mẫu rễ: Ftính = 330,97 > F0,05 = 4,1 - Chiều dài rễ: Ftính = 475,97 > F0,05 = 4,1 Chứng tỏ việc sử dụng môi trường khác việc có sử dụng than hoạt tính hay khơng sử dụng than hoạt tính có ảnh hưởng khác đến khả hình thành rễ chồi Dầu mè Trong cơng thức thí nghiệm ta thấy công thức R1 (1/2 MS + 0,3 mg/l IBA) cho kết tốt nhất, tỷ lệ rễ 77,78%, số lượng rễ trung bình lớn (4,83 rễ/chồi), chiều dài rễ trung bình lớn (3,67 cm), thời gian phát sinh rễ nhanh (2 tuần) Kết quan sát cho thấy chồi có từ đến rễ chính, từ rễ mọc số rễ phụ Ở môi trường R2 xuất rễ thời gian phát sinh lâu (3 tuần), chiều dài trung bình rễ ngắn (2,42 cm) số rễ trung bình (2,85 rễ) Chất lượng rễ chồi môi trường R2 không tốt chất lượng rễ chồi môi trường R1 Rễ hình thành mơi trường R2 ngắn hơn, rễ phụ, giòn hơn, dễ gẫy Như vậy, than 51 hoạt tính tỏ khơng tốt cho việc rễ Dầu mè Có thể than hoạt tính hấp thụ phần chất điều hoà sinh trưởng, nên làm chậm thời gian phát sinh rễ Cịn cơng thức R3 R4, chồi Dầu mè hồn tồn khơng rễ Chứng tỏ mơi trường MS khơng thích hợp cho Dầu mè rễ Vậy môi trường tốt cho việc tạo rễ Dầu mè thí nghiệm mơi trường ½ MS + 0,3 mg/l IBA a b Hình 3.15a Rễ Dầu mè mơi trường R1, R2 sau tuần nuôi cấy 3.15b Chồi Dầu mè môi trường R1sau tuần nuôi cấy 3.7 Một số kết nghiên cứu khác Ngồi thí nghiệm chúng tơi cịn tiến hành số thí nghiệm khác, như: - Nghiên cứu ảnh hưởng số loại axit amin đến khả hình thành mơ sẹo từ mảnh Dầu mè Chúng tiến hành bổ sung thêm số loại axit amin, như: Adenin, L-Prolin, Agronin, Guanin, Putresin vào môi trường tạo mô sẹo có BAP IBA thấy khả cảm ứng mơ sẹo mẫu có tăng lên khơng đáng kể - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả cảm ứng mô sẹo: Chúng thay đổi hàm lượng đường sucrose môi trường nuôi cấy từ 15-30-45 g/l Ở mơi trường có hàm lượng đường thấp (15 g/l) khả cảm ứng mẫu giảm, sử dụng mơi trường có hàm lượng đường cao (45 g/l) 52 cho kết tốt sử dụng 30 g/l khơng đáng kể Do đó, để tiết kiệm chi phí, chúng tơi đề xuất sử dụng hàm lượng đường 30 g/l Tương tự, thí nghiệm tạo cụm chồi từ mơ sẹo, nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường Kết cho thấy sử dụng đường với hàm lượng thấp (15 g/l) cho khối mô sẹo mọng nước khả tái sinh Tăng hàm lượng đường lên, kết tốt khơng có khác biệt rõ ràng Do chúng tơi để xuất sử dụng 30 g/l sucrose cho tất thí nghiệm - Nghiên cứu ảnh hưởng trạng thái môi trường đến khả cảm ứng mô sẹo Chúng tiến hành nuôi cấy mảnh mơi trường rắn (có g/l agar) mơi trường lỏng (khơng bổ sung agar) Các bình thí nghiệm ni lỏng đặt máy lắc với tốc độ 150 vịng/phút Sau thời gian ni cấy mảnh hút nước mạnh trương phồng lên, sau lại bị ủng nước chết mà khơng phát sinh mô sẹo Tương tự, tiến hành nuôi cấy cụm mô sẹo môi trường tạo cụm chồi trạng thái lỏng, sau thời gian khối mô sẹo bị vàng ủng chết Ngun nhân ni cấy môi trường lỏng, hô hấp tế bào dẫn tới tế bào bị chết sau thời gian ni cấy - Đối với thí nghiệm tạo mơ sẹo tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng kích thước mảnh đến khả hình thành mơ sẹo: Cắt mảnh có kích thước khác 5x5 mm 10x10 mm, cấy vào môi trường tạo mơ sẹo thấy mảnh lớn cấy vào mơi trường chúng có kích thước lớn hút nước Tuy nhiên mơ sẹo lại hình thành từ viền (chỗ vết cắt) Do kích thước mảnh lớn số lượng mô sẹo nhiều không đáng kể Mặt khác số mảnh cấy vào mơi trường (do mảnh to nên tốn diện tích hơn) 53 KẾT LUẬN, TỒN TẠI, KIẾN NGHỊ Kết luận Căn vào kết nghiên cứu nhân rút kết luận sau: - Thành phần mơi trường hóa học thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh Dầu mè MS + mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA + mg/l TDZ + 30 g/l sucrose + g/l agar Cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 75 %, đường kính khối mơ sẹo 1,07 cm - Chế độ chiếu sáng thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh Dầu mè ni điều kiện tối hồn tồn (khơng có ánh sáng) - Thành phần mơi trường hóa học thích hợp cho phát sinh phôi tái sinh chồi từ mô sẹo Dầu mè là: MS + 1,5 mg/l BAP + 0,05 mg/l IBA + 0,5 mg/l GA3 + 30 g/l sucrose + g/l agar + g/l than hoạt tính.Số chồi / cụm đạt 8,42 chồi - Thành phần mơi trường hóa học thích hợp cho kích thích sinh trưởng chồi Dầu mè: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + g/l agar.Chiều cao TB đạt 3,07 cm, số TB đạt 2,5 - Thành phần mơi trường hóa học thích hợp để tạo hồn chỉnh ½ MS + 0,3 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + g/l agar, tỷ lệ mẫu rễ đạt 77,78% Tồn Do thời gian thực có hạn (từ ngày 1/12/2008 đến ngày 30/4/2009), nên khoá luận số tồn như: - Chưa nghiên cứu giai đoạn quy trình tái sinh huấn luyện đưa môi trường tự nhiên - Chưa nghiên cứu ảnh hưởng nhiều loại, tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng đến khả kích thích sinh trưởng chồi Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn như: huấn luyện đưa môi trường tự nhiên - Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng khác đến khả sinh trưởng chồi Dầu mè 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Thuỳ Dương (2007), Nghiên cứu nhân giống số dịng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp ni cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, ĐHLN Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà (2008), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ cho chuyển gen”, Tạp chí Công nghệ sinh học, số 2/2008, tr.227-232 Lê Thị Hạnh (2006), Nghiên cứu nhân giống Trầm hương(Aquilara crasna Pierre) phương pháp nuôi cấy in vitro, luận văn tốt nghiệp, ĐHLN Nguyễn Như Hiền (2001), Công nghệ sinh học ứng dụng vào phát triển nông nghiệp nông thôn, NXB Thanh niên, Hà Nội Tạ Minh Hoà, Nguyễn Thị Hiền (2006), “Khả tái sinh chồi in vitro Dó trầm Aquilari crassna Pierre”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 13/2006, tr.62-63 Vũ Thị Huệ (1999), Nhân giống số loài phong lan địa phương pháp nuôi cấy ống nghiệm (in vitro), Luận văn thạc sĩ, ĐHLN Lê Quốc Huy, Ngô Thị Thanh Huệ, Lê Thành Công (2007), “Kết nghiên cứu gây trồng Cọc rào (Jatropha curcas L.) làm nguyên liệu cho sản xuất dầu diesel sinh học Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 2/2007, tr.107-111 Lê Quốc Huy cs (2008), Đánh giá khả phát triển cho sản phẩm hàng hóa bảo vệ mơi trường Ba đậu nam (Jatropha curcas L.) Việt Nam 55 10 Phạm Đức Huy (2006), Nhân giống hai dòng Bạch đàn Uro (Eucalyptus urophylla Bleck) PN46 PN47 phương pháp nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, ĐHLN 11.Đồn Thị Mai, Nguyễn Việt Cường, Ngơ Minh Dun, Nguyễn Thiên Hương (2000), “Kết bước đầu nhân giống bạch đàn lai phương pháp nuôi cấy mô phân sinh”, Tạp chí Lâm nghiệp, số 10/2000, tr.46-47 12.Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội 13 Dương Tấn Nhựt cs (2007), “Sự phát triển phôi tế bào sinh dưỡng thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, số 5(2)/2007, tr 133-149 14.Nguyễn Như Phương (2008), Nghiên cứu nhân giống Dầu mè (Jatropha curcas L.) phương pháp nuôi cấy in vitro, Luận văn tốt nghiệp, ĐHLN 15 Nguyễn Công Tạn (2008), “Triển vọng lộ trình phát triển Cọc rào để sản xuất diesel sinh học Việt Nam”, Báo Nông nghệp Việt Nam 16.Nguyễn Quang Thạch (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 17 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 18 Phan Hữu Tơn (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Cao Thị Huyền Trang cs (2006), “Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hố, phơi vơ tính từ lát cắt bầu nhuỵ vịi nhuỵ giống hoa Lilium oriental sorbone”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 4(1)/2006, tr.39-42 56 20 Dương Thị Thảo Trang, Trương Thi Bích Phương, Huỳnh Văn Kiệt (2006), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Bời lời (Litsea rubecns)”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn, số 15/2006, tr.56-58 21 Phạm Văn Tuấn, Triệu Minh Đức (2008), “Kết nhân giống Cọc rào (Jatropha curcas L.) phương pháp giâm hom”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 9/2008, tr.91-95 22 Lê Võ Định Tường (2006), “Kết bước đầu nghiên cứu nhân giống Dầu mè (Jatropha curcas L.) Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn, số 2/2006, tr.100-102 23 Bùi Văn Vinh, Nguyễn Trọng Lạng (2006), “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp cho tạo chồi rễ Khơi (Ardisia sylvestris)”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 21/2006, tr,88-90 24 Vũ Văn Vụ (2007), Công nghệ sinh học tập 2, NXB Giáo dục 25 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật Tr 625-626 26 Một số trang web có liên quan:  http//www.sinhhocvietnam.com  http//www.giaothongvantai.com.vn  http//www.dof.mard.gov.vn  http//www.kinhtenongthon.com.vn  http//www Agro.gov.vn  http//www.fact-fuels.org.com 57 Tiếng Anh 27 Ajay C Deore T Sudhakar Jonshon (2008), “High – frequency plant regeneration from leaf – disc cultures of Jatropha curcas L.: an important biodiesel plant”, Korean Society for Plant Biotechnology and Springger, Vol.95, No.3, 10 August 2008 28 Arivastava, D.S.(1971), Invitro induction of triploid roots and shoots from mature endosperm of Jatropha panduraefolia Z Pflanzenphysiol, 66: 9396 29 Gopalakrishna Bhatta, K P Dinesh, P.Prashanth and Nir,al U Kulkarni (2007), “A new species of the Indian caecilian genus Gegeneophis Peters (Amphibia: Gymnophiona: Caeciliidae) from the surroundings of Mahadayi Wilflife Sanctuary, Western Ghats”, Current science, vol 93, No 10, 25 november 2007 30 H.P.S Makkar and K Becker (1998), Nutritional studies on rats and fish (Carp Cyprinus Carpio) fed diets containning unheated and heated Jatropha curcas meal of a non–toxic provenance, www Springerlink.com 31 Jori,B.M and Srivastava, P.S.(1973), Morphogenesis in endosperm cultures, Z flanzenphysiol, 70, 285-304 32 M.P.Reddy, J.S Patolia and Arup Ghosh Discipline of Phytosalinity, Central Salt and Marine Chemicals Research Institute, G.B Marg, Bhavnagar – 364 002 Gujarat ( India), “Genetic Improvement of Jatropha curcas adaptability and oil yield”, 33 Meiru Li Hongquing Li Huawu Jiang Xiaoping Pan Guojiang Wu (2007), “Establishment of an Agrobacterium-mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas”, Springger Sience+Business Media 19 november 2007 34 Mukul Manjari Datta, Priyanka Mukherjee, Biswajit Ghosh and Timir 58 Baran Jha (2007), in vitro clonal propagation of biodiesel plant (Jatropha curcas L.).Current science, vol 93, no.10 35 Nanapat Thepsamran, Chockpisit Thepsithar and Arre Thongpukdee, In vitro multiple shoot induction of physic nut (Jatropha curcas L.), Biology 36 Quin,W.Wei-Da, L.,Yi, L., Shu-Lin, P., Ying, X.U., Lin, T and Fang, C (2004), Plant regeneration from epicotyl explants of Jatropha curcas J Plant physiol, Mol, Biology 30, 475-478 37 Rajore, S and Batra, A (2005), Efficient phant regeneration via shoot tip explant in Jatropha curcas, J plant , Biochemical, Biotechnology, 14,73-75 38 Staubmann R, Ncube I, Gubitz GM, Steiner W, Read J.S (1999), Esterase and lipase activity in Jatropha currcas, Biotechnology, 75: 117-126 39 Sujatha M and Dhingra, M (1993), Rapid plant regeneration from various explants of Jatropha integerrima, Plant cell tissue organ culture, 35: 293-296 40 Sujatha, M and Mukta, N (1996), Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas Plant Cell Tissue Organ Cult., 1996, 44, 135–141 41 Sujatha, M., Makkar, H P S and Becker, K.(2006), Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non-toxic Jatropha curcas L Plant Growth Reg., 47, 83–90 42 Swarup R (2004) Biotechnologyical interventions to improve Jatropha seeds and oil quality, SAARC Oils & Fast Today, August, pp 39 – 41 43 Timir baran Jha Priyanka Mukheijee Mukul Manjari Datta (2007), “Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn, an important biofuel plant”, Korean Society for plant Biotechnology and Springer, Publish online: 26 July 2007 59 ... đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo mô sẹo tái sinh in vitro Dầu mè (Jatropha curcas L. ) qua phôi soma từ mảnh l? ?” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế... nghiệp ? ?Nghiên cứu tạo mô sẹo tái sinh in vitro Dầu mè (Jatropha curcas L. ) qua phôi soma từ mảnh l? ?”, hướng dẫn ThS Hồ Văn Giảng ThS Nguyễn Thị Thu Hằng – Trung tâm Giống Công nghệ sinh học... sinh phôi tái sinh chồi từ mô sẹo tạo từ mảnh Dầu mè Chúng sử dụng môi trường phát sinh phôi tái sinh chồi tốt thí nghiệm mơi trường S5: MS + 1,5 mg /l BAP + 0,05 mg /l IBA + 0,5 mg /l GA3 cho nghiên