Nghiên cứu các phương pháp đông lạnh phôi bò

LỜI CẢM ƠN N ị ệ ậ H L N ệ ệ ộ L ệ T T ệ ỉ ậ H N H ì q ì ễ T ịT L N ự ậ Hằ –Bộ ệ ẫ ú đỡ ậ T ỏ ò T ịT ù ế độ đề ệ để ể ê ế ể ị–P ò ậ -V ệ C ă N ĩ G í ệ ự ậ ệ ễ ế ệ ú đỡ ệ ề độ ề ậ ú đỡ ệ ự ể N để ề ị è độ Mộ ỹ ự ậ đì Q ữ đ ợ N đế T ê ý ậ ũ ậ ă ú đỡ ú đỡ đề ệ ự ữ ự H ộ ể ậ ậ ợ ệ để ú đỡ q ý 14 ă Sinh viên N T ịT 2010 D N S ệ B 11 T ị trí B 12 C q B 21 M đ B 22 M đ B Kế q đ B Kế q đ B 33 B đ B 34 X đị M C ẢN Nộ đ ể ể ò ộ đ ể ợ ợ ệ ợ đ ợ đ đ – đ đ B Kế q đ đ đ - ợ B Tì B 37 ể 24 đ đế phôi nang nuôi in vitro B 38 S ệ q in vitro đ ă ú N S ệ Nộ Hì 11 C Hì 21 Phơi dâu Hì 22 Phơi nang Hì 23 S đ Hì 24 S đ M C C C IỂU đ ộ í ự độ Hì 25 S đ Hì 31 P Hì 32 P Hì 33 T Hì 34 ể q ì đ ằ CL – 2000 đ đ đ ệ đ – đ đ Hình 3.5 P Hì 36 P Hì 37 K Hì 38 P Hì 39 C Hì 10 P đ đ – đ – 24 ợ đ in vitro in vitro 3 đ đ ă 24 – nuôi in vitro in vitro N Ký ệ M C C C TỪ VIẾT TẮT Tên BSA Bovine Serum Albumin CS Calf Serum D_ PBS Dulbecco Phosphate Buffered Saline DMSO Dimethyl Sulfoxide EG Ethylene Glycol FM Feezing Medium HTB H ế IVC In Vitro Culture PBS Phosphat Bufferd Saline PEG Polyvinil Ethylene Glycol PVC Polyvinyl clorua mPBS Modified Phosphate Buffered Saline ê ĐẶT VẤN ĐỀ C ệ CNSH CNSH đ ợ ộ ĩ ú CNSH đ ể đ ợ C ề ệ đ ề q đ ợ đ ế ĩ ự ề ê đ ợ ể ệ C ề ệ ặ ă ẹ ế độ ú ữ ế ể ì ă độ đự ệ ụ ẫ ĩ ợ ích cho ộ (CTP) đ ì ể khác ý đặ N ê ệ ệ ề ự ă Hệ ộ đ ề ệ ự ề ế ệ ă đ ợ ộ đ ằ Ngày ự ữ ằ ữ ỹ ự , gú độ ể ê ậ q độ ý đ ể ò ý ễ ệ ụ ậ đ ú ề độ ể độ ậ ậ ị ể khai thác phơi quanh ă ậ Mặ đ ệ q q ự ỹ ữ ữ ậ ề ú ĩ q ợ ệ đề N ợ ê B -1960C) CNSH ỏ ề Sự đ ế ậ đ ệ CTP nói ề đ ợ í đề ù ệ ự ậ ệ ệ ú ậ đề đ ệ đ ế ỞVệ N ệ ế đ đ ê ứ ệđ ềđ ế ò ộ ế đ ò ê ề ứ N ữ ă đ ê ế P ữ ệ q nâ ế Kế p áp đô đ lạ p bị” ằ đ ì ề đ ú ứ để ệ ữ đ p ươ ê ự đ ế ệ đề : “N ă ậ Chƣơng TỔN QU N VẤN ĐỀ N IÊN CỨU 1.1 T ng qu n ph i 1.1.1 Ph i S ụ ợ đ ế P đ th ì í ị ẹ ộ ế bào thành 2, 4, 8, 16 ị ể 100-200µm, ứ ì ì q ù 1.1.2 Qu tr nh ph t triển ợ ì ê [3] ph i đ ợ ợ ì đ q ú ữ ã ế đ ê ĩ í ế đ ã đ ế ể ê q ẫ ữ ứ ê ề ự ể gia đ ể ì ì đ ú ế q q trình ì tồn q ữ ì đ ế í ă đ ứ - 11 ụ ê ộ đ ữ ỡ ê íq T ị 32 màu ề í ế ỏđ ứ ậ [3] ê ù ể N ữ ì ê ã ỏ ẽ ì ứ đ C ẽ ì đ ự đị ậ đề ể D ê ữ ộ ì ì ụ đ ợ đ Mộ đặ đ ể ể ộ k N í ế đế P ế đ ợ ì T M 5-6 Tế ê t ể ậ ế đ ợ q í B ể X ế ê đẩ đĩ ê ộ ậ ế ề M q ể K ộ ự , ì ế T ê , sau hì ệ [3] Dự đặ đ ể ê ứ7 ể ì ặ để ú 1.1.3 C để í đị ợ đ ị ê an tồn cho phơi phƣơng ph p đ nh gi , phân loại ph i ể đ ợ ế q ệ ụ ò q ù ậ đ ự đ ẻ ê ộ ễ ế ê q ẩ ì  Cơ sở để đ nh gi , phân loại ph i ểđ ă , để : hình , mứ độ ê trung, phân tán ă ứđ ệ đ ế ụ đ ữ ụ : ữ í é ã ự ụ phát tr ể ặ độ ậ : ợ ự ợ - Tứ +) P đặ ôi T , ữ ộ ế m ỏ ứ k - Tứ ứ : õ é ú ế ự ế đ ợ é ệ ứ đ : ợ : ữ ậ ế ể +) P ợ : ữ ợ ế ì ể í ù ợ ì ổ đặ * Hình thái chung phơi: ể Phơi bị ì ứ7 100-200µm Phơi có ì ; ì q ù ẹ C ì ể ế đế ế ê đ í hình trịn, ộ ế * Mức độ phân chia tế bào: C đ ò : ụ ứ ứ ụ ế độ 2-16 ế bào, phơi dâu, phơi nang, phơi nang màng Hình 1.1 C ụ gi i đoạn ph t triển ph i ảng 1: Thời gi n, vị trí gi i đoạn ph t triển ph i thể gi sú Ngà đ ng ph i ph i gi ng Vị tr G ph i đ ể ngà ẫ 0-5 ứ – – 16 ế 5-6 S 6-7 S P 7-8 S P 8-9 S 9-10 S P 10-11 S Phôi Phôi dâu ặ Phôi nang * Màu sắc tế bào: M ê q ợ đế ứ độ ế ể đặ q ũ không sáng ề Có ụ ỗ q ụ đ để ộ đ ợ đ đề đ ợ ã đ ựđ ữ ì đ ự -H ự đ ê đ tr n gi i đoạn ph t triển đ ợ đ ế ê ì í ịđ ợ dâu (morula): ặ đ ợ ợ P  Phơi Tuy nhiên có ể  Đ nh gi , phân loại ph i ứ đị [1]: - Mộ ổ Că ế để áp ứ6-7 ẽ ộ ể [1]: 16 - 32 ế ữ ị 24 đ ợ ộ ể ệ ặ ph i dâu sau 24 nu i in vitro P S ể P ế 24 dâu nuôi n % n % Mộ 15 11 73,33 26,67 B 20 15 75 25 25 19 76 24 T hóa T đ in vitro 36 ảng 3.6: T nh trạng ph t triển P ế Kế q ị ệ ế ì nh 3.7 37 đ – đ ê 36đ ợ đ n ng s ng ph i âu s u 24 nu i ấ in vitro 43 Q :S 3.6 đ ể đ ệ 76% đ dâu nuôi in – 24 đ cao đ ộ đ 73 33% đ 75%) Nhƣ v ệ ế ụ ể đ ệ đ ể ộ T ệ ê đ 24 Kế q in vitro 70% đ dâu ú – đ ể ề ệ (1997) [13 ằ T 72 7% dâu đ H ụ ộ ự 1997 [8 DPBS để đ ộ ệ đ đ - 5M E G ệ ệ – dâu thoát màng 69,2% N – ể đ 74 74% nh ảnh ph i âu s u nu i ấ in vitro 44 ự ệ ự 2000 [21 đ ự (2007) [6] đ dâu ộ G ụ ệ ộ P ò dâu thoát màng 62,4% L z ịT đề đ ễ nh Ph i âu s u 24 nu i in vitro 45 định n ng s ng 3.3.2 ể ú đị phôi nang s u nu i in vitro ă ế hành nuôi in vitro phôi nang ảng 3.7: Ảnh hƣởng C g pháp n Mộ Ba – đ phƣơng ph p đ ng lạnh đến n ng s ng P đ nang ph i n ng nu i in vitro ợ L L B L in vitro C L D n % n % n % n % 19 42,11 26,32 15,79 15,79 21 11 52,38 14,28 19,05 14,28 25 13 52 20 16 12 T tinh hóa K ă in vitro đ ợ đ ể 38 nh 3.9 Chất lƣợng phôi nang s u nu i ấ in vitro 46 ị Q 38 ộ :C đ – B, D T ê đ C + 16% = 88%; ò đ – C ế ặ +) P đ ể đ ợ ế ệ 15 79% = 84,21%; cịn đ - ệ phơi 52,38% + 14,28% + 19,05% = 85 72% ò ệ 14 28% in vitro ê 80% T ệ 26 32% đ ệ 15 79% ệ 52% + 20% – đ ế ệ ể 12% đ 42 11% ế ứ ế ộ đ ợ ị đ ế hóa, ể đề B : đ ị ể ệ phôi nang +) P T D; đ ợ B C phôi – ợ đ đ ợ dâu ị ặ ứ độ +) P đ đ đ ể in vitro nh 3.1 Ph i n ng s u nu i in vitro đ Nhìn chung phơi nang N ă cao ế đề ệ phơi dâu ế đ ị ệ 47 ể ẹ ậ ò ậ cao đ ộ đ c T l ph i âu ph i n ng s ng theo v thời gi n t đ phƣơng ph p h lạnh qu ết định n n ảnh hƣởng đến n ng s ng đ ph i, ất nƣ C ự ì ểđ ứ độ đ đ đ ậ q :T (0,30C / ú) ì ậ ểđ q ì ế ặ đ ì ì đ ế ứ độ ì ểđ ã ế ế đ :C đ độ đ ê ũ ậ ếđ ợ ê í ụ ị ế đổ đ ộ đ q độ ẽ ị đ ậ độ ă ệ ũ ậ ụ ệđ q ì ú ì ế độ ể :Ở Ethylene glycol, đ ự ì ê H ẽ ộ độ đ ể +) ụ đ ê đ đ ì ũ ê ữ ậ +) độ ph i s u đ ng lạnh – nh u đ c ậ tế hất ảo v lạnh t ng phƣơng ph p ảnh hƣởng đến n ng s ng giải đ ng h nh u ê q ậ ê ì E đ ậ Cị độ 4-5 ụ ễ đ đ 48 đ ộ ễ độ ol đ ợ ế Vì đ đ ẽ ì độ ă ệ ê ệ ú E ễ ì ế độ S u hi đ ng lạnh – giải đ ng ph i t i đ nh gi hi u theo phƣơng ph p húng t ng phƣơng ph p đ ng lạnh thể hi n ảng ảng : So s nh hi u t ng phƣơng ph p đ ng lạnh T P ệ T P đ – L đ (%) L L B (%) C (%) S ệ in vitro (%) vitro (%) 77,27 50 38,24 14,71 73,33 84,21 82 43,9 39,02 17,07 75 85,72 83,33 52 38 10 76 88 ú ậ B T T in (%) Mộ ệ đ đ ò ằ : T l ph i s ng s u đ ng lạnh – giải đ ng, t l ph i s ng s u đ nuôi in vitro: ộ đ Về t thời gi n: ằ ộ Vì q đ ì ậ đ ũ Về t inh tế: ậ ễ đ ế đ ê +) Nhƣng ỏ ò đ q ề đ ị đ ộ đị ễ ì ề đ th o t ự đ CL- 2000) th nghi ệ : ụ 49 đ í ỹ ậ T đ đ ễ Vì ậ q ự ê ự í ự ệ g ề ệ đ ê ú ệ đ ệ đ ì đ T ệ ữ ệ ị ữ đ ị đ ì nên ệ theo tơi đ ì ộ – ũ đ ê ự ù ộ đ 50 ằ đề ệ ù ợ Chƣơng ẾT LUẬN – T N T I – IẾN N Ị ết lu n 4.1 T ổ 203 154/203 đ ê T ú ẩ để 96 ( ò q 58 ệ đ ợ ằ đ đ – đ :P đ đ đ ộ ệ 82% , 77 27 ợ B: P T đ ệ 24 ộ ệ 75% 73 33% đ đ đ ê ự ệ 84 21% ệ đ ự ò g ệ ì ự ệ đ ữ đ ộ 85 72% ữ đ đ in vitro: P 88% – đ in vitro: P đ đ ộ 82,92%) 76% T đ đ 90%), (85,29% ế B) 83 33% T đ ự ệ đ – ì ể ệ đ 4.2 T n P ú đ ề ệ đ ợ ự ê kế q ữ ế đổ đ ú 51 độ ế ì í đ đ 4.3 Kiến nghị C ề ứ ệ ụ ă ê ũ N đ ê ề ì ậ ậ ứ ế ỹ Vậ đ ò ê ế ề ú ậ đ đ ợ ế ứ ế ứ ị: để đ ê đ ịđ ợ ế để ụ ê ứ đ ệ C ệ ò ề – đ ệ đ – ệ 52 ò ằ đ - đ đ ò ậ để õ TÀI LIỆU T Tài li u th N K G N Lê T ị T ú ễ T 1997 D C ỗK ệ T ê ề L C ị NXB Nơng ệ -H Nộ H K NXB K G ỹ H T ẢO hảo tiếng vi t H K M P 2003 C ệ ề ú ậ H Nội K G Lê S L ặ C Vă Hị “Đơng lạnh phơi bò”, T K C N T ị Yế ễ Vă Lý N ễ T ị Tă L 2004 ă S N ễ Vă í X ỹ ậ 6.2004 H K G Lý Kế q L C ề K N đ ễ T ịT B Vệ ă 12/2003 Bù X N ă ể N ê 1996 C ò ữ Vệ N ă đế ễ T ịT N ệ ,C ă ì ệ ộ ệ đ q ề K N 2000 H Nộ ễ Vă Lý L C ễ Khánh Vân (2007) “Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phơi bị phương pháp tạo thủy tinh hóa”, T 7– ă íK ệC ă – 2007 Tài li u tiếng nƣ Trowson A O; at all (1980) Frozen storage and transfer of bovine embryo, J Amin Science 47 (3), 677 – 681 E ” T K 1976 “E 20 53 R 1982 “L Chupin D and Pr ” In: Tranplation embryonaire Ed pour Produire des embryos chef les P I T ‟ q I‟ I‟ j TIEB- UNCWIA, pp75-85 10 Whitingham D.G Leibo S.P and Mazur P (1972) Survival of mouse embryo frozen to-196oC and-269oC, Science 178-411 11 Lindner, G.M and Wright, R.W (1983) Bovine embryo morphology and evaluation Theriogenology 20: 407-416 12 B HJ Fì F q ” JW H 2000 “ plied animal INC 2000 13 Park, H.D., Yoon, Kim, E.J, Lee, H.T Chung, K.S and Kato, S (1997) Effect of glycerol on invitro development of embryo produced invitro from bovine folliculer oocytes, Proceedings third Asian Symposium on Animal Biotechnology (suol, Korea) 374-379 H 14 Lehn-J T 1978 “L ” T : 313-322 15 Miyamoto H, Ishibashi T, 1978 “P z lycerones ” J and fertility 54: 427 – 432 16 Hasler, J.F; Hurtgen, P.J; Jin, Z.O and Stocckes, J E (1997) Survival of IVF-derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol, Theriogennology 48: 563-579 17 Wright J.M Aderson G.B Cupps P.T; Drost M and bradford G.E (1981) In vitroculture of embbryo from adult and prepuberal ewes.J, Anim, Science, 42, pp 912-917 18 Renard J.P; Menez O Y saumande J and HeymanY (1980) “ ” I :C G 54 19 R J P Oz z P H Y 1982 “C ” T 15: 311- 320 20 Spicer L.J and Echterm Kamp S.E; (1986) Ovarian Follicular function, J Amin Science; 62, 343-352 V D 21 Lazar L,J S 2000 “T z vitrification of in vitro ” T ennology 54: 571 – 578 22 Sang Ruzi, Li Janguo, Wang Fengming, Zhao Yingjie, Liu Sujuan 1996 “S ” z S mal biotechnology, November 11 23 Kennedy M.E; Odde K G; 1983 „S z embryo tranfer reicevepients receive demi embryos with Syncromate B or E ” Theriogennology 26: 221-228 24 Sanderson N., Le Ngoc Chi Minh (1997) “T mual ” New Zealand 25 Saitoh, N (1994) A Vitrication method Developed at the NLBC, Theriogenology, 41: 1053-1060 26 L S P; 1982 “ - Step method for direct nonsurgical ” Theriogenology 21 767 (Abstr) tranfer of frozen- 27 Thatcher W.W, Dros M 1983 “N ‟ ” S 55 1993: 33: 27 – 49 G M CL C ẶT VẤN Ề C 1: T NG QU N VẤN Ề NGHI N C U 1 Tổ q ề ò 111 P ò 112 Q ì ể 113 C ò đ Tổ q ề 121 q ĩ 122 K ằ ệ q đ q 124 C ệ 125 C đ 126 C ằ đ q ì ế Tì ê 1.3.1 T ê ế ứ đ q đế ì ệ phôi 12 đ 127 C ệm ề đ 123 C ì ế ề đ q q ằ 13 ì đ 16 đ 18 18 1.3.2 T V ệ N C ò 20 2: MỤC TI U – NỘI DUNG – PH ƠNG PHÁP 21 Mụ ê 2 Nộ 23 ợ 231 Vậ Vậ ê ứ 21 ê ứ 21 ậ ệ ợ ệ ê ê ê ứ 21 ứ 21 ứ 22 ệ ế 2322 M ị ê ụ 22 22 24 T đị đ ể 25 P ê 251 ợ ê ứ 24 ứ 25 đ 56 25 ự 2.5.1.1 ê đ 2512 ể 26 ợ 252 – 2521 đ 26 ò 27 27 đ 2.5.2.2 Các p 253 X đị ệ 31 đ đ – đ đ ì 32 26 X ý ệ 32 C 3: KẾT QU VÀ TH O LUẬN 33 31 đ 311 ò 312 ị Kế q ê ì 321 X đị ệ đ 34 – đ đ 37 đ – đ đ đị 33 đ 322 33 X ể ợ ệ đ 33 ă – đ 37 đ – 39 đ ằ in vitro 42 331 X đị ă 332 X đị ă C Kế 42 T 4.3 K ế 24 in vitro 42 in vitro 46 4: KẾT LUẬN – T N T I – KIẾN NGHỊ 51 ậ 51 51 ị 52 TÀI LIỆU TH M KH O 53 57 ... đƣợ đ ng lạnh theo phƣơng ph p P G đ S ể Mộ B T C ợ ợ L (n) L B n % n % Phôi dâu 21 14 66,67 33,33 Phôi nang 23 13 56,52 10 43,48 Tổ 44 27 61,36 17 38,64 Phôi dâu 24 16 66,67 33,33 Phôi nang... sau đ ng lạnh – giải đ ng theo phƣơng ph p đ ng lạnh G P Tổ đ ế S đ thối hóa n n % n % Phôi dâu 21 23,81 16 76,19 Phôi nang 23 21,74 18 78,26 44 10 22,73 34 77,27 ể Mộ S Tổ 37 đ B T hóa T Phôi dâu... Tổ 50 30 60 20 40 Phôi dâu 29 20 68,97 31,03 Phôi nang 31 19 61,29 12 38,71 60 39 65 21 35 Tổ Nhƣ v : - Phƣơng ph p đ ng lạnh +) T ệ T ệ / t ƣ : đ đ Bđ / - Phƣơng ph p đ ng lạnh +) T ê T ệ đ