NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.) Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Học viên: Nguyễn Thị Hiên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.) Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Học viên: Nguyễn Thị Hiên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.) Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN Chuyên ngành: Thực vật Mã số: 42 01 11 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: PGS.TS Phan Kế Long Hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Thanh Hƣơng Hà Nội 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết luận văn trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố công trình Tất nguồn thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc liệt kê tài liệu tham khảo Nếu có sai sót tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./ Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Thị Hiên LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học Công nghệ, thầy cô giáo Khoa Sinh thái Tài nguyên sinh vật giảng dạy giúp đỡ suốt q trình học tập, nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy hƣớng dẫn số PGS.TS Phan Kế Long – ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, cô giáo hƣớng dẫn số – TS Nguyễn Thị Thanh Hƣơng dành nhiều thời gian, cơng sức, tâm huyết lịng nhiệt tình hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Quỹ học bổng Nagao Việt Nam, Nhiệm vụ Điều tra mã số UQĐTCB.01/18-19 Đề tài TN 17-/C04, thuộc Chƣơng trình Tây Nguyên 2016-2020 hỗ trợ kinh phí giúp tơi hồn thiện đề tài khoa học Tơi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu trƣờng THPT Ngô Sĩ Liên – thành phố Bắc Giang, tỉnh Bắc Giang, thầy giáo tổ mơn Hóa – Sinh tồn thể thầy giáo cơng tác trƣờng tạo điều kiện hết mức thời gian nhƣ cơng việc trƣờng giúp tơi thồn thành q trình học tập nghiên cứu Cuối tơi xin trân trọng cảm ơn gia đình, bạn bè điểm tựa vững vật chất, tinh thần, cổ vũ động viên suốt trình học tập nghiên cứu Một lần tơi xin chân thành cám ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Thị Hiên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CR : Cực kì nguy cấp DNA : Deoxyribonucleic acid EW : Tuyệt chủng tự nhiên ITS : Internal transcribed spacer IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources matK : Maturase K ML : Maximum Likelihood MP : Maximum Parsimony NCBI : National Center for Biotechnology Information NJ : Neighbor – Joining PCR : Polymerase Chain Reaction RAMS : Random amplified microsatellite RAPD : Randomly Amplified Polymosphic DNA rbcL : Ribulose bisphosphate carboxylase large chain RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SCN : Sau công nguyên SSR : Simple Sequence Repeats TCN : Trƣớc công nguyên UPGMA : Unweighted pair group method with arithmetic mean DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi nhân vùng ITS-rDNA kỹ thuật PCR với cặp mồi theo Phan Kế Long cs (2014) 16 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.3 Danh sách trình tự sử dụng nghiên cứu thu thập Genbank 23 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái Tam thất hoang (P stipuleanatus) Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus) (Nguyễn Tập, 2007) 38 Bảng 3.2 Thành phần nucleotide (%) mẫu nghiên cứu 46 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền (%) mẫu nghiên cứu (bên trên) số lƣợng nucleotide sai khác (bên dƣới) mẫu nghiên cứu 50 DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH VẼ Hình 2.1 Sơ đồ bƣớc thí nghiệm 17 Hình 2.2 Máy đo NanoDrop one 19 Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR 20 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng QIAquick 21 Hình 3.1 Panax notoginseng - Tam thất (lá mẫu TH1) 26 Hình 3.2 Panax notoginseng - Tam thất (củ mẫu TH1) 27 Hình 3.3 Mẫu Panax thu khu vực Phu Xai Lai Leng 29 Hình 3.4 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB1: chét nguyên) 31 Hình 3.5 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB2: chét xẻ thùy sâu) 31 Hình 3.6 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB3: chét xẻ thùy sâu) 32 Hình 3.7 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB4: chét xẻ thùy nông) 33 Hình 3.8 Panax stipuleanatus -Tam thất hoang (mẫu ML1) 34 Hình 3.9 Panax stipuleanatus-Tam thất hoang (mẫu củ ML1) 35 Hình 3.10 Mẫu (K.M.Feng 13694) isotype (P stipuleanatus) lƣu trữ phòng tiêu Viện Thực vật Bắc Kinh (PE0025805) 36 Hình 3.11 So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA mẫu Panax TB1TB4 ML1 với trình tự vùng gen lồi P stipuleanatus 37 Hình 3.12 Lá lồi Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu ML2) 40 Hình 3.13 Củ lồi Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu củ ML2) 41 Hình 3.14 So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA mẫu ML2 với lồi nhóm: P zingiberensis P Wangianus 43 Hình 3.15 Sắc ký đồ trình tự vùng gen ITS-rDNA mẫu Panax TB1 46 Hình 3.16 Trình tự vùng gen ITS-rDNA mẫu nghiên cứu 49 Hình 3.17 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu với loài/thứ chi Panax L sở phân tích trình tự vùng gen ITSrDNA theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML) Mơ hình tối ƣu GTR+G+I Eleutherococcus senticosus lồi ngồi nhóm Giá trị gốc giá trị bootstrap >50% 51 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI SÂM PANAX L 1.2 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L TRÊN THẾ GIỚI 1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L Ở VIỆT NAM CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 14 2.1.3 Các hóa chất dùng nghiên cứu 14 2.1.4 Thi t ị dụng cụ nghiên cứu 15 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 17 2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu 17 2.2.3 Phương pháp định loại hình thái 18 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 18 2.2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 18 2.2.4.2 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 19 2.2.4.3 Tinh sản phẩm PCR 21 2.2.4.4 Phƣơng pháp phân tích số liệu 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1.1 Đặc điểm nhận bi t chi Panax 25 3.1.2 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H Chow - Tam thất 25 3.1.3 Panax stipuleanatus Tsai et Feng- Tam thất hoang 28 3.1.4 Panax zingiberensis C.Y Wu & K.M Feng-Tam thất gừng 39 3.1.5 Đặc điểm hình thái chung chi Panax vùng Tây Nghệ An 43 3.1.6 Mối quan hệ họ hàng mẫu nghiên cứu 45 3.2 THẢO LUẬN 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 56 L Reeve & Co., London, Vol I, pp 931-947 15 Clarke C B., 1879, The Flora of British India, London, vol pp.808 16 Seemann, 1868, Journal of Botany, vol 6, pp.54 17 Harms H, 1897, Zur Kenntnis der Gattungen Aralia und Panax, Botanische Jahrbucher fur Systematik Pflarzengeschichte, 23, pp.1–23 18 Britton, N L and A Brown, 1913, An illustrated flora of the northern United States, Canada and the British pos-sessions, New York: Charles Scribner’s Sons, vol2, 2nd ed 19 Hoo, G., 1961, The Systematics, relationship and distribu-tion of the Araliaceae of China Bulletin of Amoi Uni-versity (NaturalSciences), 8(1), pp 1–11 20 Hara H., 1970, On the Asiatic species of genus Panax, J Jap Bot., 45, pp 197-222 21 Wen J., Zimmer E A., 1996, Phylogeny and Biogeography of Panax (Araliaceae): Inference from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA, Mol Phylogen., 6, pp 166-167 22 Florence c., Lee, 1992, FacTsabout Ginseng, the elixir of life, Hollym, pp.44-46 23 Grushvitzky, I V., Tikhomirov, V N., Aksenov, E S & Shibakina, G V, 1969, Succulent fruit with carpophore inspecies of the genus Stilbocarpa Decne et Planch (Araliaceae), Bull Moscow Soc Natur., Biol, 74, pp 64–76 24 Due N M., Nham N T et al.,1993, Saponin from Vieetnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, collected in central Vietnam, I, Chemical phrm Bull., 42, pp 2010-2014 25 Due N M., Kasai R et al., 1994, Saponin from Vieetnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv, collected in central Vietnam, II, Chemical pharm Bull., 42, pp 115-122 57 26 Due N M., Kasai R et al.,1997, Saponin composition of Vietnamese Ginseng and its significance from phamacognostical points of view, Proceeding of the First Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Pharmacy in Harmony, Bangkok, Thailan, pp 273-283 27 Viguier R., 1908-1923, Flore Générale De L’Indo-Chine, Part 2(5), pp 1162-1163 28 Phạm Hoàng Hộ, 1970, Cây cỏ Miền nam Việt Nam, Nxb Bộ Văn hóa giáo dục niên trung tâm học liệu, 1, tr.989 29 Võ Văn Chi, & cs, 1973, Cây cỏ thƣờng thấy Việt Nam, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, 3, tr 109 30 Phạm Hoàng Hộ, 1993, Cây cỏ Miền Nam Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội, 2(2), tr 640-641 31 Grushvitzky, I.V., Skvortsova, N.T., Ha Thi Dung & Arnautov, N.N., 1996, Fam Araliaceae Juss - Ngu gia bi Vascular plants Synopsis of Flora, 2, pp.16-42 32 Trần Đình Lý & cs, 1993, 1900 lồi có ích Việt Nam, Nxb Thế giới, tr 32-33 33 Đỗ Tất Lợi, 1995, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, tr 376-379, 1004-1007 34 Võ Văn Chi 1997, Từ điển thuốc Việt nam, Nxb Y học, Hà Nội, tr 19-21, 64 35 Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 1013-1026 36 Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội, 2, tr 515-516 37 Lê Trọng Cúc & cs, 2003, Danh lục loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr.640 38 Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ, 2007, Sách đỏ Việt Nam, Phần II thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, 58 Hà Nội, tr 85-89 39 Phan Ke Long, Le Thanh Son, Phan Ke Loc, Vu Dinh Duy & Pham Van The, 2013, Lai chau ginseng Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S Q Cai I Morphology, Ecology, Distribution and Conservation Status In Proc 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-Active Compounds, tr 65-73 40 Phan Ke Long, Tran Thi Viet Thanh, Nguyen Thien Tao, Phan Ke Loc, Nguyen Tu Lenh, Nguyen Tien Lam, Dang Xuan Minh, 2014, Morphological and moleculer characteristics of Panax sp (Araliaceae) from Phu Xai Lai Leng Mountain, Nghe An province, Vietnam, Journal of Biology, 36(4), tr 494-499 41 Trần Ngọc Lân & cs, 2016, Kết nghiên cứu loài Sâm Phuxailaileng vùng núi cao tỉnh Nghệ An, tạp chí Khoa Học Công Nghệ Nghệ An, số 12/2016 Tr7-11 42 Nong Van Duy, Le Ngoc Trieu, Nguyen Duy Chinh, Van Tien Tran (2016) A new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular envidence Phytotaxa 277 (1), pp 47-58 43 Thompson, J.D., Higgins, D.G and Gibson, T.J CLUSTAL W, 1994, improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throught sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrice choice, Nucleic Acids Research, 22, pp 4673-4680 44 Nicholas K.B., Nicholas H.B.J., 1997, GeneDoc Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW, pp 4-14 45 Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S., 2007, MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) sofware version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 10.1093/molbev/msm092 46 http://en.wikipedia.org/wiki/Maximum_parsimony_(phylogenetics) 47 Komatsu K., Tohda C & Zhu S., 2005, Ginseng drugs – Molecular and Chemical characteristics and possibility as antidementia drugs, Current 59 Topics Nutraceutical Res, 3, tr 47-64 48 Zhou M., Gong X & Pan Y., 2018, Panax species identification with the assitance of DNA data, Genetic Resources and Crop Evolution, 65, pp 1839-1856 49 Trần Công Luận, Lƣu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập, 2009, Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus Seem.)và Tam thất hoang(P stipuleanatus Tsai et Feng), Tạp chí Dƣợc liệu, 14(1), tr 17-23 50 Nguyễn Tập, 2007, Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam, IUCN, tr.161-170 51 Konoshima T., Takasaki M., Ichiishi E., Murakami T., Tokuda H., Nishino H., Duc N.M., Kasai R., Yamasaki K., 1999, Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis, Cancer Letters, 147(2), pp.11-16 PHỤ LỤC Phụ lục 1: So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA mẫu nghiên cứu với loài chi Panax.L (bảng) Phụ lục 2: Thực nghiệm phịng thí nghiệm Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Xác nhận cán ộ hƣớng dẫn Phan K Long Nguyễn Thị Thanh Hƣơng Học viên cao học Nguyễn Thị Hiên BẢNG TRA CỨU TÊN TIẾNG VIỆT Tên Việt Nam Trang xuất Sâm vũ diệp 3, 13, 16, 17, 18, 45, 58, 60 Tam thất hoang 3, 14, 16, 17, 28, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 45, 58, 60 Sâm ngọc linh 3, 18, 58, 59 Tam thất 3, 16, 25, 31, 32, 33, 58 Tam thất gừng 39 Sâm nhật 13, 15, 28 Sâm lai châu 18 Sâm langbian 18 Sâm việt nam 15, 17, 18 Sâm puxailaileng 17 BẢNG TRA CỨU TÊN KHOA HỌC Tên latinh Trang xuất Aralia bipinnatifida 15 Aralia quinquefolia var notoginseng 31 Aralia 11 Araliaceae 1, 7, 8, 9, 10, 11, 13 Eleutherococcus senticosus 28, 57 Eleutherococcus senticosus 30 P bipinnatifidum 15 P japonica 7, 13, 15 P trifolius 7, 9, 29 Panax 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 28, 34, 35, 43, 44, 46, 49, 50, 52, 56, 57, 58, 59, 60 Panax ginseng 3, 1, 7, 16, 28, 57, 59 Panax vietnamensis 8, 13, 14, 15, 16, 17 Panax japonicus var major 28 Panax notoginseng 3, 7, 16, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 50, 52, 56, 57, 58 Panax pseudoginseng 15 var bipinnatifidus Panax stipuleanatus 3, 6, 9, 15, 16, 17, 29, 30, 25, 34, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 50, 52, 56, 57, 58, 60 Panax vietnamensis var fuscidiscus 16, 18, 29, 57 Panax vietnamensis var langbianensis 17, 18, 29, 57 Panax vietnamensis var vietnamensis 29, 57,59 Panax zingiberensis 29, 39, 47, 48, 49, 50, 52, 56, 57, 58, 60 Panax.assamicus 29, 57 Panax.bipinnatifidus 3, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 45, 46, 57 Panax.japonicus 28, 57 Panax.japonicus var.angustifolius 28, 57 Panax.japonicus var.bipinnatifidus 28, 29, 57 Panax.major 57 Panax.omeiensis 29, 57 Panax.pseudoginseng 8, 10, 13, 14, 15, 29, 57, Panax.pseudoginseng var.elegantior 57 Panax.quinquefolius 7, 9, 10, 28, 57 Panax.shangianus 29, 57 Panax.sinensis 29, 57 Panax.wangianus 29, 49, 57