Khảo sát sự nảy mầm in vitro của hạt cây sưa dalbergia tonkinensis prain

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH Mai Thị Thu Trang KHẢO SÁT SỰ NẢY MẦM IN VITRO CỦA HẠT CÂY SƢA ( Dalbergia tonkinensis Prain ) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH Mai Thị Thu Trang KHẢO SÁT SỰ NẢY MẦM IN VITRO CỦA HẠT CÂY SƢA (Dalbergia tonkinensis Prain) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành biết ơn đến: Thầy PGS.TS Bùi Trang Việt tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến q báo ln tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận văn Cô TS Lê Thị Trung giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm ln động viên giúp đỡ em trình học tập, làm luận văn Cô TS Dƣơng Thị Bạch Tuyết, cô TS Nguyễn Thị Mong, cô TS Trần Thanh Hƣơng, Thầy PGS.TS Bùi Văn Lệ, Thầy TS Đỗ Minh Sĩ, cô TS Trần lê Bảo Hà, Thầy PGS.TS Nguyễn Minh Công giảng dạy cho em kiến thức bổ ích Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, Khoa sinh học môn Sinh lý Thực vật tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập làm luận văn trường Các Thầy, Cô hội đồng dành thời gian đọc đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn em Cô ThS Nguyễn Ngọc Phƣơng, cô ThS Trần Thị Minh Định em Hồ Thị Mỹ Linh nhiệt tình hướng dẫn cho em mượn dụng cụ; hoá chất để thực thí nghiệm Các anh chị chuyên ngành sinh học thực nghiệm khóa 20, bạn khóa 21 em học viên phịng mơn Sinh lý Thực vật BGH trƣờng THPT Lƣơng Thế Vinh giúp đỡ tơi có thời gian hồn thành chương trình học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ba mẹ yêu thương, tạo điều kiện cho học tập Em cảm ơn anh bên cạnh động viên, chia sẻ vui buồn sống Mai Thị Thu Trang MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục ảnh Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ Sưa 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.2 Sự nảy mầm hạt 1.2.1 Nguồn gốc trái hạt 1.2.2 Sự phát triển phôi 1.2.3 Sự nảy mầm hạt 1.2.3.1 Sinh lý nảy mầm 1.2.3.2 Biến đổi hoá sinh 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nảy mầm hạt 1.3.1 Các yếu tố bên ảnh hưởng đến nảy mầm hạt 1.3.2 Các yếu tố bên ảnh hưởng đến nảy mầm hạt 1.4 Vai trò chất điều hồ tăng truởng thực vật q trình nảy mầm phát sinh hình thái thực vật 10 1.4.1 Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật trình nảy mầm 10 1.4.1.1 Auxin 10 1.4.1.2 Gibberellin 10 1.4.1.3 Cytokinin 11 1.4.1.4 Acid abscisic 11 1.4.1.5 Etylen 12 1.4.2 Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh hình thái thực vật 12 1.4.2.1 Auxin 12 1.4.2.2 Gibberellin 13 1.4.2.3 Cytokinin 13 1.4.2.4 Acid abscisic 15 Chƣơng 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Quan sát hình thái khảo sát trọng lượng hạt Sưa 18 2.1.1 Quan sát hình thái hạt 18 2.1.2 Khử Trùng Hạt 18 2.1.3 Khảo sát trọng lượng hạt 18 2.2 Khảo sát thời gian bão hòa nước hạt 18 2.3 Khảo sát tỷ lệ % sống hạt 18 2.4 Khảo sát nảy hạt mầm tự nhiên 19 2.5 Khảo sát ảnh hưởng vỏ lên nảy mầm in vitro hạt tăng trưởng mầm 20 2.6 Đo cường độ hô hấp hạt 20 2.7 Sinh trắc nghiệm hoạt tính auxin, cytokinin, gibberelin, ABA có hạt 20 2.8 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên nảy in vitro hạt Sưa 23 2.9 Định lượng protein theo thời gian nảy mầm hạt Sưa có vỏ hạt bóc vỏ 23 2.10 Ứng dụng cứu phôi tạo sẹo 25 2.11 Khảo sát tỷ lệ % sống in vitro đưa vườn ươm 25 2.11.1 Khảo sát giai đoạn thích hợp để đưa vườn ươm 25 2.11.2 Khảo sát mơi trường đất thích hợp để đưa vườn ươm 25 Chƣơng KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27 3.1 Hình thái trọng lượng hạt Sưa 27 3.1.1 Hình thái hạt 27 3.1.2 Khử trùng hạt 28 3.1.3 Trọng lượng hạt 28 3.2 Khảo sát thời gian bão nước hạt 30 3.3 Tỷ lệ % sống hạt 31 3.4 Sự nảy mầm hạt vườn ươm 32 3.5 Ảnh hưởng vỏ lên nảy mầm in vitro hạt 35 3.5.1 Ảnh hưởng vỏ hạt lên nảy mầm 35 3.5.2 Ảnh hưởng vỏ hạt lên tăng trưởng mầm 36 3.5.3 Hình thái giải phẫu 37 3.6 Cường độ hô hấp hạt 39 3.7 Hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật có giai đoạn hạt nảy mầm 40 3.8 Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên nảy in vitro hạt Sưa 42 3.9 Tỷ lệ % hàm lượng protein theo thời gian nảy mầm hạt Sưa có vỏ hạt bóc vỏ 47 3.10 Ứng dụng cứu phôi tạo sẹo 50 2.11 Tỷ lệ % sống đưa vườn ươm 51 THẢO LUẬN 54 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CĐHTTTV : Chất điều hòa tăng trưởng thực vật BA : – benzyl adenine GA3 : Gibberellic acid IAA : Indol acetic acid ABA : Acid abscisic MS : Môi trường Murashige Skoog ( 1962) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 : Ảnh hưởng NaOCl 15% lên hạt Sưa theo thời gian khử trùng 28 Bảng 3.2 : Sự thay đổi trọng lượng tươi trọng lượng khơ hạt có vỏ hạt bóc vỏ theo giai đoạn ni cấy in vitro 29 Bảng 3.3 : Trọng lượng trung bình hạt theo thời gian hấp thu nước 30 Bảng 3.4 : Tỷ lệ % sống hạt điều kiện bảo quản 31 Bảng 3.5 : Tỷ lệ % nảy mầm hạt Sưa tự nhiên với tác nhân kích thích khác 33 Bảng 3.6 : Ảnh hưởng vỏ hạt lên nảy mầm in vitro 35 Bảng 3.7 : Ảnh hưởng vỏ hạt lên tăng trưởng mầm sau 1; tuần nuôi cấy 36 Bảng 3.8 : Cường độ hô hấp hạt theo giai đoạn 39 Bảng 3.9 : Hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật có giai đoạn hạt nảy mầm 41 Bảng 3.10 : Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên nảy mầm hạt Sưa 43 Bảng 3.11 : Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên tăng trưởng mầm 44 Bảng 3.12 : Tỷ lệ % hàm lượng protein có hạt có vỏ hạt bóc vỏ theo thời gian hạt nảy mầm 47 Bảng 3.13 : Vai trị chất ĐHTTTV lên phơi hạt bị hư 50 Bảng 3.14 : Tỷ lệ % sống Sưa in vitro 1, tuần đưa vườn ươm 52 Bảng 3.15 : Tỷ lệ % sống Sưa in vitro tuần đưa vườn ươm môi trường đất khác 52 DANH MỤC CÁC ẢNH Ảnh 1.1 : Lá, gỗ, hoa, trái hạt Sưa Dalbergia tonkinensis Prain Ảnh 2.1 : Hạt Sưa 17 Ảnh 2.2 : Hạt Sưa cắt theo chiều dọc 19 Ảnh 3.1 : Hình thái hạt Sưa 27 Ảnh 3.2 : Ảnh hưởng NaOCl 15% lên hạt Sưa 28 Ảnh 3.3 : Hạt Sưa trước sau bão hòa nước 31 Ảnh 3.4 : Hạt bảo quản 10 ± 20C ngâm TZ 24 32 Ảnh 3.5 : Hạt bảo quản 32 ± 20C ngâm TZ 24 32 Ảnh 3.6 : Hạt không xử lý, gieo ẩm ngày 34 Ảnh 3.7 : Hạt cắt 1/3 vị trí khơng chứa phơi, gieo bơng ẩm ngày 34 Ảnh 3.8 : Hạt ngâm nước ấm 450C gieo ẩm ngày 34 Ảnh 3.9 : Hạt ngâm H2SO4 gieo ẩm ngày 34 Ảnh 3.10 : Hạt nảy mầm sau ngày nuôi cấy in vitro 35 Ảnh 3.11 : Hạt nuôi cấy in vitro tuần 37 Ảnh 3.12 : Hạt nuôi cấy in vitro tuần 37 Ảnh 3.13 : Giải phẫu chồi theo thời gian 38 Ảnh 3.14 : Giải phẫu rễ theo giai đoạn 39 Ảnh 3.15 : Hạt nảy mầm in vitro ngày 41 Ảnh 3.16 : Hạt nảy mầm in vitro ngày 41 Ảnh 3.17 : Hạt nảy mầm in vitro ngày 41 Ảnh 3.18 : Ảnh hưởng chất ĐHTTTV lên tăng trưởng hạt 46 Ảnh 3.19 : Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày 48 Ảnh 3.20 : Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày 48 Ảnh 3.21 : Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày 49 Ảnh 3.22 : Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày 49 Ảnh 3.23 : Phôi chết 50 Ảnh 3.24 : Phôi sống 51 Ảnh 3.25 : Sự tạo mô sẹo 51 Ảnh 3.26 : Cây Sưa in vitro tuần đưa vườn ươm 14 ngày 53 Ảnh 3.27 : Cây Sưa in vitro tuần đưa vườn ươm 14 ngày 53 Ảnh 3.28 : Cây Sưa đưa vườn ươm ngày môi trường đất khác 53 Ảnh 3.29 : Cây Sưa đưa vườn ươm tuần môi trường đất khác 53 Ảnh 3.30 : Cây Sưa vườn ươm tháng 53 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 : Sơ đồ ly trích lập chất điều hịa tăng trưởng thực vật 21 Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn trọng lượng tươi hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro theo giai đoạn 29 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn trọng lượng khơ hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro theo giai đoạn 30 Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn hấp thu nước hạt 31 Hình 3.4 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tác nhân kích thích lên nảy mầm hạt tự nhiên 33 Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng vỏ lên nảy mầm in vitro hạt 36 Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn cường độ hơ hấp hạt có vỏ hạt bóc vỏ theo giai đoạn 40 Hình 3.7 : Đồ thị biễu diễn hoạt tính ĐHTTTV có giai đoạn hạt nảy mầm 42 Hình 3.8 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng chất ĐHTTTV lên nảy mầm 43 Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % hàm lượng protein hạt có vỏ hạt bóc vỏ 47 49 Ảnh 3.21: Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày Ảnh 3.22: Hạt có vỏ hạt bóc vỏ ni cấy in vitro ngày 50 3.10 Ứng dụng cứu phôi tạo sẹo Phôi bị hư phần rễ mầm (vàng nâu) nuôi cấy in vitro môi trường MS bị chết (Bảng 3.13, Ảnh 3.23).Khi cắt bỏ hết phần rễ mầm bị hư, nuôi cấy môi trường MS hay môi trường MS kết hợp với BA IAA nồng độ khác nhau, sau tuần, phôi sống tăng trưởng với tỷ lệ cao (Bảng 3.13, Ảnh 3.24) Xử lý BA IAA nồng độ khác cịn có khả tạo sẹo (Bảng 3.13, Ảnh 3.25) Bảng 3.13: Vai trò chất ĐHTTTV lên phôi hạt bị hƣ Môi trƣờng Phôi sống Tạo sẹo/phôi sống MS không cắt phôi 00,00 ± 0,00a 00,00 ± 0,00a MS cắt phôi 86,67 ± 9,09b 00,00 ± 0,00a MS+BA (1mg/l)+IAA (0,1mg/l) 80,00 ± 10,69b 75,00 ± 13,06c MS+BA (0,1mg/l)+IAA (1mg/l) 80,00 ± 10,69b 41,67 ± 14,97b MS+BA (0,1mg/l)+IAA (0,1mg/l) 86,67 ± 9,09b 30,77 ± 13,32b Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Ảnh 3.23: Phơi chết 51 Tăng trưởng chồi Hình thành rễ Ảnh 3.24: Phôi sống Ảnh 3.25: Sự tạo mô sẹo 3.11 Tỷ lệ % sống đƣa vƣờn ƣơm Sau 14 ngày đem vườn ươm, Sưa in vitro tuần tuổi có tỷ lệ sống cao hình thành thêm so với giai đoạn tuần tuổi Cây tuần tuổi khơng sống đưa ngồi tự nhiên (Bảng 3.14, Ảnh 3.26 3.27) 52 Bảng 3.14: Tỷ lệ % sống Sƣa in vitro 1, tuần đƣa vƣờn ƣơm Tỷ lệ % sống hình Giai đoạn in vitro Tỷ lệ % sống tuần 13,33 ± 9,09a 0a tuần 73,33 ± 11,82b 18,18 ± 12,20b tuần 93,33 ± 6,67b 92,86 ± 7,14c thành Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Cây Sưa nuôi cấy in vitro giai đoạn tuần tuổi đưa vườn ươm sống môi trường đất khác Ở môi trường đất mùn cưa đất có trộn sơ dừa Sưa có tỷ lệ sống cao sinh trưởng tốt (Bảng 3.15, Ảnh 3.28 3.29) Bảng 3.15: Tỷ lệ % sống Sƣa in vitro tuần đƣa vƣờn ƣơm môi trƣờng đất khác Môi trƣờng đất Tỷ lệ % sống Đất mùn cưa 100,00 ± 00,00b Đất cát pha 66,67 ± 12,60a Đất trộn sơ dừa 90,91 ± 9,09ab Các số trung bình hàng với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 53 Ảnh 3.26: Cây Sƣa in vitro tuần đƣa vƣờn ƣơm đƣợc 14 ngày Ảnh 3.27: Cây Sƣa in vitro tuần đƣa vƣờn ƣơm đƣợc 14 ngày Ảnh 3.28: Cây Sƣa đƣa vƣờn ƣơm ngày môi trƣờng đất khác Ảnh 3.29: Cây Sƣa đƣa vƣờn ƣơm 14 ngày môi trƣờng đất khác Ảnh 3.30: Cây Sƣa vƣờn ƣơm tháng 54 THẢO LUẬN Hạt Sưa có vỏ dày, trơn khó thấm nước, hấp thu nước (thể qua trọng lượng tươi) hạt có vỏ diễn chậm trình tái lập biến dưỡng diễn chậm Sau q trình hấp thu nước, cường độ hơ hấp tăng lên, phản ứng biến dưỡng bắt đầu, chất dự trữ bị phân giải phôi đồng hóa Thực vậy, hạt có vỏ, trọng lượng khô tăng sau ngày nuôi cấy, hạt bóc vỏ, trọng lượng khơ bắt đầu tăng sau ngày ni cấy Q trình để nước vào hạt chịu ảnh hưởng lớn tính thấm nước vỏ hạt: thấm, thấm mạnh không thấm nước Nhiều loại hạt cịn có mơ đặc biệt ngăn cản nước vào, gây ngủ cho hạt (Vũ Văn Liết Nguyễn Văn Hoan, 2007) Trong trình nảy mầm hạt, cần có lượng nước đủ để hạt sẵn sàng khởi động chương trình nảy mầm, hấp thu nước trước hết nhờ nước hạt thấp, sau nhờ lực thẩm thấu khơng bào phát triển khiến hạt hấp thu nước mạnh phồng lên (Bùi Trang Việt, 2000) Hạt Sưa hạt ưa ẩm Khi độ ẩm hạt giảm nảy mầm hạt giảm theo thời gian nảy mầm hạt kéo dài (Fernando cs, 2005) Ở hạt đậu tương, tỷ lệ nảy mầm 89% sau thu hái khả nảy mầm trì 70% đến 16 tuần sau thu hái bảo quản Hạt bảo quản 15 ± 20C biểu tỷ lệ nảy mầm trì khả nảy mầm cao hạt bảo quản nhiệt độ 30 ± 20C (Sharma cs, 2007) Tỷ lệ nảy mầm hạt Trắc (Dalbergia conchinchinensis), tuần sau thu hái bảo quản, cao nhiệt độ 25 ± 20C Sau tuần bảo quản, khả nảy mầm tỷ lệ nảy mầm hạt giảm (Lê Quang Hưng, 2003) Đều khảo sát tính sống hạt Sưa tetrazolium chloride: hạt sau thu hoạch cuối tháng 10/2011 bảo quản tháng nhiệt độ 10 ± 20C cho tỷ lệ sống 76,67%, giữ hạt nhiệt độ 32 ± 20C làm hạt khả sống hoàn toàn (Bảng 3.4 Ảnh 3.4, Ảnh 3.5) Hạt Sưa tự nhiên khó nảy mầm điều kiện cịn ngun trái Trái chín không tự khai, không chứa chất dự trữ, vỏ trái bao quanh hạt khó bị phân hủy thời gian ngắn Ngồi ra, nảy mầm q trình gồm nhiều yếu tố tác 55 động, kích thích trình biến dưỡng ức chế nhân tố kiềm hãm hạt Các yếu tố ngoại sinh như: nước, nhiệt độ, ánh sáng chất hóa học có tác dụng kích thích hạt nảy mầm Các yếu tố nội sinh có tác dụng bảo vệ vượt trội qua điều kiện không thuận lợi đồng thời rào cản hạt nảy mầm như: lớp vỏ trái, vỏ hạt khó thấm nước oxygen (Bùi Trang Việt, 2000) Kết nghiên cứu Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Du Sanh (2008) hạt Dây tây cho thấy hạt sau xử lý: cắt vỏ, ngâm cồn, H2SO4 đậm đặc (98%) 10 phút cho tỷ lệ nảy mầm cao đối chứng Do đó, hạt Sưa xử lý với nước ấm 450C ± 20C ngâm H2SO4 0,1% 10 phút hạt cắt 1/3 vị trí không chứa phôi nảy mầm nhanh hạt không qua xử lý (hạt đối chứng) (Bảng 3.5, Hình 3.4 Ảnh 3.6, Ảnh 3.7) Lớp vỏ hạt Sưa tiết chất dịch màu nâu có tác dụng làm chết rễ mầm, rễ mầm kéo dài tiếp xúc với dịch tiết Do khử trùng KMnO4 1% xử lý hạt với H2SO4 0,1% vỏ nhiều dịch tiết, phải rửa nước cất, trình hạt nảy mầm, cần thay giá thể thấy dịch tiết ngày nhiều Nhiệt độ 450C ± 20C có tác dụng kích thích enzyme hoạt động trở lại sau thời gian bị ức chế yếu tố hạt Các q trình biến dưỡng xảy mạnh kích thích hạt nảy mầm nhanh Hạt sau trưởng thành bảo vệ nhiều lớp vỏ khác tránh tác động yếu tố bất lợi môi trường Khi lớp vỏ trái bị phân hủy yếu tố sinh học, vật lý hóa học làm cho lớp vỏ trái trở nên thấm nước hạt bắt đầu hấp thu nước Trong điều kiện thuận lợi nhiệt độ ánh sáng, hạt bắt đầu nảy mầm sau có tái hấp thu nước (Bùi Trang Việt, 2000) Tốc độ hấp thu nước hạt nhanh tỷ lệ nảy mầm nhanh (Alvardo cs, 2002) Kết tương tự hấp thu nước hạt loài Acacia thuộc họ đậu (Fabaceae) (Guillermo Paula, 2006) Hạt Sưa bóc vỏ nảy mầm nhanh: tỷ lệ nảy mầm 53,33% sau 24 giờ, 66,67% sau 48 (Bảng 3.6, Ảnh 3.10 Hình 3.5) Vì vậy, lớp vỏ ngun nhân cản trở ức chế nảy mầm hạt Sưa điều kiện thuận lợi cho nảy mầm 56 Sau trình nảy mầm hạt giai đoạn tăng trưởng mầm Trong giai đoạn này, hạt hấp thu thêm nước tăng cường độ hô hấp (Bảng 3.8 hình 3.6) Hơ hấp mạnh cung cấp nhiều lượng cho tế bào hoạt động, tương ứng với tăng đáng kể rễ mầm thân mầm Sau tuần nuôi cấy, tăng trưởng mầm thể qua kéo dài rễ trụ hạ diệp (Bảng 3.7 Ảnh 3.11) Sau tuần nuôi cấy, mầm tiếp tục tăng trưởng, rễ kéo dài xuất rễ bên, thân cao có phân hóa trụ hạ diệp trụ thượng diệp, thật xuất (Bảng 3.7 Ảnh3.12) Khảo sát ảnh hưởng vỏ lên nảy mầm hạt điều kiện tự nhiên in vitro cho thấy vỏ hạt cản trở hạt nảy mầm Vì vậy, khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên nảy mầm hạt tăng trưởng mầm điều kiện in vitro tiến hành với hạt bóc vỏ Qua giai đoạn nảy mầm hạt (0, 3, ngày), hoạt tính auxin, gibberellin zeatin tăng dần, acid abscisic giảm dần (Bảng 3.9 Ảnh 3.15-3.17) Trong q trình phát triển hạt, hoạt tính acid abscisic tăng mạnh chín trái mức độ cao hạt vào giai đoạn trưởng thành Ở hạt ngô, nồng độ giberellin cao giai đoạn phát triển sớm phôi ngày 15 sau thụ phấn giảm rõ rệt phôi trưởng thành ngày thứ 27 Hoạt tính acid abscisic cao 21 ngày sau thụ phấn (White cs, 2000) Ở hạt Sưa, hoạt tính auxin cytokinin mức độ thấp hạt trưởng thành tăng mạnh hạt bắt đầu hấp thu nước đến hạt nảy mầm, điều cố thêm rằng, hoạt tính IAA (auxin) dạng tự giảm mạnh suốt trình kiềm hãm nảy mầm hạt IAA tổng hợp gia tăng suốt q trình nảy mầm hạt Cytokinin đóng vai trị chủ đạo việc phân chia tế bào kéo dài rễ mầm (Dewar cs, 1998) Từ đo hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật, nảy mầm hạt Sưa khảo sát với môi trường MS có bổ sung chất điều hịa tăng trưởng thực vật (auxin, gibberellin, zeatin) Kết cho thấy, tỷ lệ nảy mầm số mơi trường có chất điều hòa tăng trưởng thực vật cao môi trường MS (đối 57 chứng) như: MS kết hợp với GA3 5-10mg/l; MS kết hợp với BA 0,5-1mg/l; MS kết hợp với BA 0,5mg/l, IAA 0,1 mg/l; MS kết hợp với BA 1mg/l, IAA 0,1mg/l (Bảng 3.10 Hình 3.8) Kết nảy phù hợp với ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên nảy mầm Gibberellin kích thích tăng trưởng chồi gỡ ngủ chồi (Bùi Trang Việt, 2000) Trong hạt nảy mầm, acid abscisic đóng vai trị ngăn cản, cytokinin có tác dụng loại bỏ tác động ức chế acid abscisic gibberellin kích thích hạt nảy mầm (Nguyễn Như Khanh, 2007) Điều giống với kết nghiên cứu hạt cà chua xử lý gibberellin có tỷ lệ nảy mầm cao, thời gian nảy mầm giảm mầm tăng trưởng mạnh (Balaguara cs, 2000) Gibberellin cần thiết cho nảy mầm hạt Arabidopsis rau nhiếp (Pritchart cs, 2002) Gibberellin giúp hạt thoát khỏi trạng thái ngủ thúc đẩy nảy mầm hạt giống ngủ (Koorneef, 2002; Leubner- Metzger, 2003) Auxin cần thiết cho phân chia tăng trưởng tế bào, kích thích mạnh kéo dài trụ mầm (Collett, 2000; Taiz Zeiger, 2002) Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật áp dụng giúp tăng trưởng mầm in vitro Tuy nhiên, môi trường MS có bổ sung GA3 1520mg/l; BA mg/l BA kết hợp với IAA giúp tăng chiều cao mầm, cản phát triển rễ, làm tăng sinh khối gây phù to (Ảnh 3.18) Tác dụng gibberellin kích thích phân chia tế bào nồng độ cao (Bùi Trang Việt, 2000), đồng thời cản trở rễ (Werner, 2001) Cytokinin có vai trị thúc đẩy tăng trưởng mơ phân sinh chồi, ngăn chặn phân chia tế bào rễ Nồng độ cytokinin cao cản tăng trưởng rễ cản hiệu kích thích tạo rễ auxin Trong ni cấy mơ, cytokinin coi chất ức chế hình thành rễ (Werner, 2001) Auxin cần thiết cho phân chia tăng trưởng tế bào, có vai trị quan trọng phát sinh hình thái thực vật Auxin kích thích tạo rễ (Võ Thị Bạch Mai, 2004; Taiz Zeiger, 2002) Auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ (phát thể non rễ), ngăn cản tăng trưởng sơ khởi (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001) Auxin nồng độ thấp kích thích phát triển rễ, có tác 58 dụng ức chế phát triển rễ nồng độ cao (Rahman, 2001) Trong trình khảo sát nảy mầm in vitro hạt Sưa nhận thấy hạt bảo quản thời gian dài, chất dự trữ hạt (ở tử diệp phôi ) bị oxy hóa Do enzyme lipase giải phóng triglyceride suốt thời gian bảo quản làm gia tăng acid béo tự do, sterol, phospholipid Các phân tử nàu sau giải phóng làm thay đổi tính tồn vẹn màng tế bào, dẫn đế tế bào bị chết làm hạt khả nảy mầm (Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Du Sanh, 2008) Sự phá hủy màng tế bào thể rõ hàm lượng đường giảm suốt thời gian bảo quản (Sharma cs, 2007) Khi hạt bị hư, chất dự trữ tử diệp không cung cấp dinh dưỡng cho phơi q trình nảy mầm mà cịn ngăn cản phôi trực tiếp hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường, tương tự phần rễ mầm phôi bị hư cung ảnh hưởng đến phần khác phôi Trong điều kiện tự nhiên hạt khả nảy mầm hoàn toàn Tuy nhiên, với điều kiện ni cấy in vitro phần khắc phục cách bóc vỏ hạt, tách bỏ phần tử diệp, cắt bỏ phần rễ mầm bị hư, phôi sống tăng trưởng với tỷ lệ cao (bảng 3.13, ảnh 3.25) Xử lý BA IAA với nồng độ khác cịn có khả tạo sẹo (Bảng 3.13, Ảnh 3.25) Cây mầm in vitro sau phát triển hình thành đầy đủ rễ thân đưa vườn ươm Cây hoàn chỉnh bám vào đất, hút nước, tạo hầu hết dinh dưỡng trở nên sống tự lập, thích nghi với mơi trường (Vũ Văn Liết Nguyễn Văn Hoan (2007) Khi đưa in vitro vườn ươm, tuần tuổi, rễ chưa hình thành hồn chỉnh (chưa có rễ bên), khả hấp thu nước dinh dưỡng không đủ để trì sống, chết 100% Các tuần có nhiều rễ bên hình thành hai thật, nên thích nghi sống đưa vườn ươm (Ảnh 3.26, 3.27, 3.30) Đất trộn sơ dừa đất mùn cưa thích hợp cho ươm Sưa (Ảnh 3.28 3.29) Hai loại đất có đặc tính là: nhẹ, tơi xốp có khả hút nước cao nên rễ Sưa bị tổn thương đưa ngồi vườn ươm, đồng thời thích hợp với ưa ẩm Sưa 59 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ Kết luận  Hạt Sưa bảo quản nhiệt độ 100C ± 20C có khả sống cao hạt bảo quản 320C ± 20C  Hạt Sưa nảy mầm nhanh xử lý với tác nhân kích thích: Nhiệt độ 450C ± 20C giờ, cắt bỏ phần hạt vị trí khơng chứa phơi, ngâm hạt H2SO4 0,1% 10 phút  Hạt Sưa nảy mầm tăng trưởng mầm điều kiện in vitro tốt hạt bóc vỏ ni cấy mơi trường MS kết hợp với GA3 5mg/l BA 0,5 mg/l  Trong q trình tăng trưởng mầm, mơi trường MS bổ sung GA3 1520mg/l; BA mg/l BA kết hợp với IAA cản trở hình thành rễ  Trong trình nảy mầm hạt Sưa, cường độ hô hấp tăng; hàm lượng protein tăng; trọng lượng tươi, trọng lượng khơ tăng; hoạt tính auxin, gibberellin, zeatin tăng; hoạt tính acid abscisic giảm  Cây mầm đưa vườn ươm sau tuần ni cấy in vitro đạt tỷ lệ sống cao sau tuần ni cấy in vitro Loại đất thích hợp để ươm đất mùn cưa đất trộn sơ dừa Kiến nghị Trong thời gian tới, có điều kiện sẽ:  Cải tiến môi trường để hạt nảy mầm tăng trưởng mầm có hiệu  Nhân giống in vitro từ mầm in vitro 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ khoa học công nghệ Việt Nam (1996), Sách đỏ Việt Nam, Phần II, NXB Khoa học tự nhiện Công nghệ, Hà Nội Đỗ Văn Bản, Nguyễn Văn Hưng, Nguyễn Hào Hiệp (2009), “Cấu tạo gỗ Sưa Dalbergia tonkinensis Prain” , Khoa học lâm nghiệp, (số4), 1130 -1131 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Lê Quang Hưng (2003), “ Miên trạng hột trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) với độ chín thời gian tồn trữ”, Seed Technology, (25), 124-127 Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB giáo dục Nguyễn Như Khanh (2007), Sinh học phát triển thực vật, NXB giáo dục Nguyễn Như Khanh, Nguyễn văn Đính (2001), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, NXB giáo dục Vũ Văn Liết, Nguyễn Văn Hoan (2007), Giáo trình sản xuất giống công nghệ hạt giống, NXB Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM 10 Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi rễ, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 11 Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cấp cao, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 12 Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Du Sanh (2008), “ Tìm hiểu nảy mầm hạt Dâu Tây (Fragaria vesca L)”, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ ĐHQGTP.HCM, 11 (07), 20-24 13 Bùi Trang Việt (2000), Sinh lí thực vật đại cương, Phần II – Phát triển NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 14 Vũ Văn Vụ (chủ biên), Vũ Thành Tâm Hồng Minh Tấn (2008), Sinh lí học thực vật, NXB giáo dục 61 Tài liệu tiếng Anh 15 Alvardo V and Bradford K J (2002), “ A hydrothermal time model explains the cardinal temperature for seed germination”, Plant, Cell and Enviroment, (25), 1061-1069 16 Balaguera H.E., Cardenas J.F., and Herrera J.G (2000), “Effect of gibberellic acid (GA3) on seed germination and growth of Tomato (Solanum lycopersicum L.)”, ISHS Acta Horticulturae 821 17 Collett C.E., Harberd N.P., and Leyser O (2000), “Hormonal interactions in the control of Arabidopsis hypocotyl elongation”, Plant Physiology 124, 553– 561 18 Dewar J., Taylor J R N., and Berjak P (1998), “Changes in selected plant growth regulator during germination in sorghum”, Seed Science Research (8): 360-368 19 Edwin F.G (1996), “Plant propagation by tissue culture”, Part 2: In practice Exegetics Limited, 613 – 936 20 Fernando A O E S., Felipe F., and Gerraldo W F (2005), “ Light and temperature influence on seed germination of Calliandra fasciculate Benth (Leguminosae)”, Lundiana, 6(2), 95-97 21 Finch- Savage W.E and Leubner- Metzger G (2006), “ Seed dormancy and the control of germination”, New phytologist, (71), 501- 523 22 Graham I.A (2008), “Seed Storage Oil Mobilization”, Annual Review of Plant Biology 59, 115-142 23 Gazzarrini S., and McCourt P (2003), Cross-talk in plant hormone signalling: what Arabidopsis mutants are telling us Annals of Botany 91, 605–612 24 Gorecki R J., Ashino H, Satoh S and Esahi Y (1991), “Seed dormancy and the control of germanition” New phytologist, 171: 501-523 25 Guillermo F and Paula V (2006), “ Dormancy and germination in three Acacia (Fabaceae) species from central Argentina”, Seed Science Reseach, (16), 77-82 62 26 Joel F., Enrique J., and Juan F J B (2008), “Breaking seed dormancy in pseudopectinatus (Cataceae)”, Plant Species Biology, (23), 43-46 27 Katagiri T., Ishiyama K., Kato T., Liu X M and Lin C T (2007), “light regulation of gibberellins metabolism in seedling development”, Journal of Integrative Plant Biology, 49 (1), 21-27 28 Koornneef M., Bentsink L., Hilhorst H (2002), “Seed dormancy and germination”, Current Opinion in Plant Biology 5, 33-36 29 Michael J H, Léonie B and Wim J J S, (2008), “Molecular networks regulating Arabidopsis seed maturation, after- ripening, dormancy and germination”, New Phytologist, (7), 1-21 30 Leubner-Metzger G (2003), “Functions and regulation of ß-1,3-glucanase during seed germination, dormancy release and after-ripening”, Seed Science Research 13, 17-34 31 Pritchard S.L., Charlton W.L., Baker A., and Graham I.A (2002), “Germination and storage reserve mobilization are regulated independently in Arabidopsis”, Plant J 31, 639-647 32 Rahman A., Amakawa T., Goto N., and Tsurumi S (2001), “Auxin is a positive regulator for ethylene-mediated response in the growth of Arabidopsis roots”, Plant and Cell Physiology 42, 301–307 33 Sankhla D., Davis T.D., and Sankhla N (1993), “Effect of gibberellins biosynthesis inhibitors on shoot regeneration from hypocotyl explants of Albizzia julibrissin”, Plant Cell Reports 13(2) 34 Sharma S., Gambhir S and Munshi S K (2007), “Changes in lipid and carbohydrate composition of germinating soybean seed under different storage conditions”, Asian Journal of Plant Science, 6(3), 502-507 35 Steber C.M., and McCourt P (2001), “A role for brassinosteroids in germination in Arabidopsis”, Plant Physiology 125, 763-769 36 Taiz L and Zeiger E (2002), Plant Physiology, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc 63 37 Takeshi K., Kanako I., Tomohiko K., Satoshi T., Masatomo K and Kazuo S (2005), “An important role of phoshatidic acid in ABA signaling during germination in Arabidopsis thaliana”, The Plant Juornal, (43), 107-117 38 Toyomasu T., Kawaide H., Mitsuhashi W., Inoue Y., and Kamiya Y (1998), “Phytochrome regulates gibberellin biosynthesis during germination of photoblastic lettuce seeds”, Plant Physiology 118, 1517-1523 39 Werner T., Motyka V., Strnad M., and Schmulling T (2001), “Regulation of plant growth by cytokinin”, Proc Natl Acad Sci USA 98, 10487–10492 40 White C N, Proebstin W.M, Hedden P and Rivin C.J (2000), “Gibberellins and seed development in maize I evidence that gibberellins/Abscisic acid balance governs germination versus maturation pathways”, Plant Physiology, (122), 1081- 1088 41 Yamaguchi S., Kamiya Y., and Sun T P (2001), “Distinct cell-specific expression patterns of early and late gibberellin biosynthetic genes during Arabidopsis seed germination”, The Plant Journal 28, 443-453 ... in vitro bảo vệ Sưa, chọn đề tài ? ?Khảo sát nảy mầm in vitro hạt Sưa? ?? Mục tiêu Nghiên cứu nảy mầm in vitro hạt Sưa thu nhận từ nảy mầm Giới hạn – phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu khả nảy mầm in vitro. .. lên nảy mầm in vitro hạt 3.5.1 Ảnh hƣởng vỏ hạt lên nảy mầm Hạt có rễ mầm dài 1-2 mm xem hạt nảy mầm Hạt bóc vỏ nảy mầm nhanh, sau ngày thấy rễ mầm dài ra, với tỷ lệ nảy mầm 53,33% Sau ngày, hạt. .. TP.HỒ CHÍ MINH Mai Thị Thu Trang KHẢO SÁT SỰ NẢY MẦM IN VITRO CỦA HẠT CÂY SƢA (Dalbergia tonkinensis Prain) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI