Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy in vitro cây trinh nữ hoàng cung crium latifolium l

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN K H O A K H O A H Ọ C T ự N H I Ê N VÀ XÃ H Ộ I NGUYỄN THỊ THANH M A I N G H I Ê N CỨU M Ộ T s ố IN VITRO ĐIỂU K I Ệ N NUÔI C Â Y T R I N H N Ữ H O A N G (CRIUM LATIFOLIUM L.) L U Ậ N VĂN T Ố T N G H I Ệ P Đ Ạ I H Ọ C NGÀNH SINH H Ọ C C h u y ê n n g n h : Sinh lý thực v ậ t G i o viên hướng d ẫ n : ThS V ũ T h ị L a n T I - V I OẠI HỌC THÁI NGUYỀN KHOA KHOA HỌC Tự NHIÊN VÀ XÃ HỘI THƯ VIÊN T H Á I NGUYÊN - 2007 CÂY CUNG Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn L Ờ I C Ả M ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Th.s Vũ Thị Lan, người trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Hải Yến, thầy cô Bộ môn Sinh học - Khoa khoa học tự nhiên xã hội- Đại học Thái Nguyên cán kĩ thuật viên phịng thí nghiệm hướng dẫn bảo nhiệt tình cho em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên làm thực nghiệm Phịng thí nghiệm sinh học, tập thể lớp Sinh học KI giúp đỡ, bảo góp ý nhiều để em hồn thành khóa luận Cuối em xin nói lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người ln bên cạnh động viên khuyến khích em suốt q trình học tập Thái nguyên, tháng năm 2007 Sinh viên: Nguyễn Thị Thanh Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỰC TÓM TẮT K ẾT QUẢ LUẬN VĂN Ì M Ở ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Đại cương Trinh nữ hồng cung Ì Ì Thành phần hóa học Trinh nữ hoàng cung 1.1.3 Tác dụng dược lý Trinh nữ hồng cung 1.2 Ni cấy mô tế bào thực vật li 1.2.1 Lịch sử ni cấy mơ tế bào thực vật li Ì 2.2 Các kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.2.3 Úng dụng kĩ thuật nhân giống in vitro 14 Ì 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến ni cấy 15 1.2.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 15 1.2.4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 18 Ì 2.5 Ý nghĩa ứng dụng thành tựu nuôi cấy mô tế bào 19 1.2.5.1 Úng dụng 19 1.2.5.2 Thành tựu 20 1.2.5.3 Ý nghĩa 22 Chương Đ ố i TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 23 2.2 Ì Phương pháp khử trùng mẫu 23 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 2.2.3 Các tiêu theo dõi 26 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 Chương K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1 Nghiên hiệu chế độ khử trùng 28 3.3 Ảnh hưởng Auxin đến khả tạo mô sẹo từ củ 34 3.4 Ảnh hưởng tổ hợp NAA với BAP Kinetin đến khả tạo mô sẹo phân hóa mơ sẹo 37 3.4 Ì Ảnh hưởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả tạo mô sẹo 37 3.4.2 Ảnh hưởng tổ hợp NAA, BAP, kinetin đến khả phân hóa mô sẹo 40 3.5 Ảnh hưởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả tái sinh trực tiếp từ lõi củ Trinh nữ hoàng cung 43 KẾT LUẬN VÀ K I Ế N NGHỊ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC KÍ H I Ệ U V I Ế T TẮT TNHC Trinh nữ hoàng cung MPLC Sắc kí lỏng trung áp FC Sắc kí cột ngang Cs Cộng Ét OH Etanol KTST Kích thích sinh trưởng BAP Benzl amino purine IBA Indol butiric acid GA Gibberellin IAA Indol acetic acid NAA a - Napthylacetic acid 2,4 D 2,4 Dichlo phenoxy axetic acid Kinetin fulfuryl amino purine MS Murashige Skoog ĐHNN1 Đại Học Nông Nghiệp DTNN Di Truyền Nông Nghiệp KHKTNNVN Khoa Học Kĩ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam CNSH Công nghệ sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nehiêp Kết bảng 3.5 hình 3.5 ta thấy mơi trường TS1 có bổ sung NAA Ì mg/1 kết hợp với BAP 0,5 mgA TS3 bổ sung NAA lmg/1 kết hợp vói kinetin 0,5 mg/I cho tỉ lệ tái sinh chồi thấp, đạt 66,6% sau 20 ngày nuôi cấy Ở môi trường TS2 tỉ lệ tái sinh sau 10 ngày sau 20 ngày đạt 83,3% Môi trường TS (có bổ sung lmg/1 N A A lmg/1 kinetin) tỉ lệ tái sinh đạt cao sau l o ngày 83,3% sau 20 ngày 100% mẫu cấy tái sinh Như kết luận TS4 mơi trường thích hợp để tái sinh Hình : Tái sinh chồi trực tiếp từ lõi củ Trinh nữ hoàng cung Nguyễn Thi Thanh Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN Láp cử nhân sinh học KI http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiêp Khoa khoa học tự nhiên & xã hội K Ế T LUẬN VÀ K I Ế N NGHỊ KẾT LUẬN Ì Hiệu khử trùng phù hợp mẫu củ TNHC chế độ Ì (cồn 70% 30 giây, javen phút) cho tỷ lệ sống lên đến 82,1% Đối với TNHC chế độ khử trùng (cồn 70% 60 giây, HgCl 0,1% 15 phút) cho tỷ lệ sống 73,0% Nguyên liệu củ TNHC thích hợp với việc ni cấy tạo mơ sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo củ sau tuần lên đến 90%, tỷ lệ chết 0% Mơi trường MN3 ( có bổ sung 2mg/l NAA) mơi trường MD2 ( có bổ sung l,5mg/l 2.4D) thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ củ Sự kết hợp NAA BAP, kinetin theo tỷ lệ en ( 2mg/l NAA+ 0,5mg/l BAP) e n ( 2mg/l NAA+ 1.5mg/l kinetin) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao lên đến 85,7% Môi trường CT Ì CT6 (2mg/l NAA lmg/1 kinetin) cho tỷ lệ phân hóa mơ sẹo cao, đạt tỷ lệ 90% Môi trường tái sinh trực tiếp từ lõi củ tốt môi trường TS4 (lmg/1 NAA + lmg/1 kinetin) cho tỷ lệ tái sinh sau 20 ngày 100% KIẾN NGHỊ Do điều kiện thời gian hạn hẹp nên xin ngừng đề tài nghiên cứu Trinh nữ hoàng cung dược liệu quý cần quan tâm tìm hiểu dược tính loại thuốc nhiều để tách chiết hợp chất có tác dụng chống ung thư Ngồi cần nghiên cứu để tìm điều kiện ni cấy thích hợp nhằm nhân nhanh giống Nguyễn Thị Thanh Mai 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN L('rp nhân sinh học Kỉ http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI L I Ệ U T H A M K H Ả O Phần tiêng việt Lê Thị Vân Anh, Nghiên cứu số điểu kiện tạo mơ chồi Trinh nữ hồng cung (Crium latiỷolium L), Khóa luận tốt nghiệp hệ quy ĐHQG HN, 2002 Nguyễn Văn Bằng, Nguyễn Hoàng, V ũ Đoan Trang, Nguyễn Thị Thu Hằng, Một thuốc có khả chữa số bệnh ung thư, Tạp chí Dược học số 3, 1997 Nguyễn Bình, Giới thiệu thuốc Trinh nữ hoàng cung {Crium ỉatiỷolium L), Tạp chí Dược liệu T3 số Ì, 1998 Võ Văn Chi, Từ điển thuốc Việt nam, NXB Y học 1997 Nguyễn Ngọc Dung, Nhân giống vô tính Trinh nữ hồng cung {Crium latiỷolium L.) phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học(1993-1998), Viện Sinh học Nhiệt đới, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 1998 Nguyễn Ngọc Dung, Khảo sát sinh trưởng Trinh nữ hoàng cung (Crium lát ifoi lum L.) chế phẩm nó, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học( 1993-1998), Viện Sinh học Nhiệt đới, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 1998 Nguyễn Cơng Hào, Nguyễn cửu Thị Hương Giang, Nguyễn cửu Khoa, Nghiên cứu thành phần hóa học Trinh nữ hồng cung {Crium latiỷolium L.), Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học( 1993-1998) Viện Sinh học Nhiệt đới, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 1998 Cẩm Hương " Một trăm loài hoa chữa bệnh" NXB Lao Động Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn - Trần Thị Thu Huyền "Nghiên cứu ảnh hưởng số thành phần môi trường đến trình vi nhân giống hoa cẩm chướng (Dianthus caryophylỉus L.), khóa luận tốt nghiệp đại học, hệ quy - ĐHQGHN, 2002 10 Nguyễn Như Khanh, Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo Dục, 2006 l i Võ Khối Bảo Thiên, Người khám phá bí mật Trinh nữ hoàng cung {Chum latifolium L.), Thanh niên online, 2005 12 V ũ Thị Lan, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận sinh khối định tính số chất có hoạt chất sinh học từ Trinh nữ hoàng cung (Crium latiỷolium L.), Luận văn thạc sĩ khoa học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2005 13 Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, K ết bước đầu tái sinh Trinh nữ hồng cung (Crium latiỷolium L.) từ mơ sẹo, Tạp chí sinh học số 2(25), 2002, tr 29-34 14 Quách Thị Liên, V ũ Thị Lan, Lê Thị Vân Anh, Nguyễn Đức Thành, Ni cấy mơ sẹo Trinh Nữ Hồng Cung (Crium latofolìum L.), Tạp chí cơng nghệ sinh học 3(3), 2005, tr 53-62 15 Nguyễn Thị Minh, Trần Bạch Dương, Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn, Đóng góp vào việc nghiên cứu alcaloid tỏi lơi rộng (Crium latiỷolium L.) Việt Nam, Tạp chí HH CNHC SỐ3, 1997, tr 13-16 16 Nguyễn Huy Phương, Nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan thạch hộc, khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy - ĐHQG HN, 2002 17 Phan Tống Sơn, Trần Bạch Dương, Phan Minh Giang, Nguyễn Thị Minh, Walter c Taylor, Nghiên cứu alcaloid từ nàng rộng (Chum latiỷolium L.) Việt Nam, Tạp chí hóa học T 39 số 4, 2001, tr 90-94 18 Phan Tống Sơn, Trần Bạch Dương, Phan Minh Giang, Nguyễn thị Minh Hoàng Thanh Hương, Lê Mai Hương, Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn gây độc tế bào alcaloid từ số loài Crium Việt Nam, Tạp chí Dược học số 4, 2003, tr 18-21 19 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E Zvetkova, E Nikolova, E Katzarova, G Kostov, Một số yếu tố hoạt hóa tế bào lympho T in vitro in vivo chiết xuất nước nóng từ Trinh nữ hồng cung (Crium latifolium L.), Tạp chí Dược học số 8, 2000, tr 8-10 20 Mai Đình Trị, Nguyễn Cơng Hào.Phenylpropanoit ílavonol glycosides lập từ tươi Trinh nữ hồng cung (Crium latiỷolium L.), Tạp chí hóa học T 43 (2), 2005, tr 162-164 21 Nguyên Đức Thành, Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, 2000 22 Nguyễn Văn Uyển tác giả, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông Nghiệp, 1993 23 V ũ Văn Vụ, Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội 1999 24 http:// sinhhocvietnam.com Phần tiếng anh 25 Ghosal s., Sain K s, Razdan s., Crium alcaloids: their chemistry and biology, Phytochemystry 24(10), 1985, pp.2141-2156 26 Ghosal s., Singh s K , Chemical constituends of Amaryllidaceae, part 24 Crinaỷoline and crinaỷolium ĩ., Chem Reseach /s/, 1986, pp 312- 313 27 Ghosal s, Unnikikman, Singh s K., Phytochemistry, voi 9, 1989, pp 2535-2537 28 Nguyên Cong Hao, Le Tiên Dung, Ngun Ngoe Sng, 6- Hydroxy crinamidene trịm the bulds of Crium latiỷolium L, Journal o i Chemistry, voi 40, No 4, 2002 pp 1-2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn 29 Tràm N.T.N., Zvetkove E., Nikolova E., Katzarova E., Kostov G., et ai, Exp Pathol Parasitol, No 3, 1999, pp 21 -26 30 Zetkova E., Wirleitner B., Tràm NTN., Schennach H., Funchs D., Aqueous extrcts of Crium latiỷolium L and Camella sinensis show immunoomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells, Int Immunopharmacol 1(12), 2001, pp 2143 - 2150 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn ... số điều kiện nuôi cấy in vitro Trinh nữ hoàng cung (Crium latiỷolium L. ) K ết nghiên cứu luận văn : 2.1 Hiệu khử trùng Đối với mẫu củ Trinh nữ hoàng cung khử trùng chế độ Ì (cồn 70% 30s javel... alcaloid Trinh nữ hoàng cung chứa l? ?ợng đáng kể axit amin Các axit amin xác định Trinh nữ hoàng cung l? ?: arginine, serin, glycine, histidine, tyrosine, valine, methionine Các axit amin có hàm l? ?ợng cao... sắc kí l? ??p mỏng điều chế kết tinh phân đoạn K ết phân l? ??p 12 alcaloid crinin, ambellin, povvellin, 6a- hydroxy-buphanidrin, criamidin, 6a -hydroxy crinamidin, 6a-hydroxy undulatin, lycorin, l- O