Bài viết tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng điều trị Parkinson của resveratrol, ruồi thí nghiệm được nuôi trên môi trường thường, bổ sung resveratrol (Sigma Aldrich, mã số R5010) để đạt các nồng độ 0,064 mg/g, 0,32 mg/g, 0,64 mg/g (khối lượng resveratrol/ khối lượng môi trường).
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(3):1295-1302 Bài nghiên cứu Open Access Full Text Article Đánh giá khả điều trị bệnh Parkinson resveratrol mơ hình ruồi giấm Drosophila melanogaster Đặng Thị Phương Thảo1,2,* , Linh Mỹ Đào1,2 , Tươi Văn Phan1,2 , Anh Mẫn Huỳnh1,2 TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Liên hệ Đặng Thị Phương Thảo, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Email: thaodp@hcmus.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 15-3-2021 • Ngày chấp nhận: 11-5-2021 • Ngày đăng: 18-5-2021 DOI : 10.32508/stdjns.v5i3.1039 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Parkinson bệnh thối hóa thần kinh phổ biến thứ hai giới (sau Alzheimer), đặc trưng thoái tế bào thần kinh sản sinh dopamine suy giảm khả vận động, từ làm suy giảm nghiêm trọng chất lượng sống bệnh nhân Hiện nay, bệnh chưa có liệu pháp điều trị đặc hiệu Dựa sở mối liên quan stress oxi hố chế hình thành, tiến triển bệnh, hợp chất kháng oxi hóa trở thành đối tượng tiềm hỗ trợ điều trị làm chậm tiến trình bệnh Resveratrol chất kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng apoptosis mạnh, tồn nhiều loại trái cây, đặc biệt nho, dâu…, có hoạt tính phụ thuộc vào nồng độ sử dụng Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá hiệu điều trị resevatrol với bệnh Parkinson nồng độ 0,064mg/g, 0,32mg/g, 0,64mg/g mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster knockdown dUCH (Drosophila ubiquitin carboxyl terminal hydrolase) Đây mơ hình mơ triệu chứng điển hình bệnh Parkinson, đồng thời chứng minh hiệu sàng lọc thuốc điều trị bệnh Kết thu nhận cho thấy, sử dụng resveratrol nồng độ 0,32mg/g có hiệu việc ngăn ngừa suy thoái tế bào thần kinh sinh dopamine cải thiện khả vận động ruồi knockdown dUCH Kết đóng góp chứng khoa học tiềm việc sử dụng resveratrol cho việc phát triển sản phẩm chức thuốc hỗ trợ điều trị bệnh Từ khoá: Parkinson, hệ thống Ubiquitin proteasome, resveratrol, UCH-L1, tế bào thần kinh sinh dopamine GIỚI THIỆU Parkinson bệnh thối hóa thần kinh mạn tính phổ biến thứ hai giới, sau Alzheimer, ảnh hưởng tới khoảng 1-3% dân số sau độ tuổi 60 Năm 2019, ước tính giới có khoảng 10 triệu người chung sống với bệnh Parkinson đặc trưng suy giảm khả vận động run, di chuyển linh hoạt, cứng cơ, khó khăn việc giữ cân bằng… từ làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất lượng sống người bệnh Các hệ gây thiếu hụt hợp chất dẫn truyền thần kinh dopamine, mà nguyên nhân sâu xa bắt nguồn từ việc chết tế bào thần kinh sinh dopamine thuộc vùng chất đen não Các chế dẫn tới tượng chết nhóm tế bào bao gồm: stress oxi hóa tế bào, suy giảm hoạt động hệ thống Ubiquitin proteasome, sai hỏng hoạt động ty thể Ba chế có mối liên hệ tác động qua lại lẫn 2,3 Tới nay, bệnh Parkinson chưa có liệu pháp điều trị đặc hiệu, phương pháp chủ yếu tập trung vào việc sử dụng thuốc nhằm tăng cường hiệu tổng hợp dopamine tế bào Tuy nhiên thuốc có tác dụng thời gian ngắn thường kèm nhiều tác dụng phụ Ở giai đoạn nặng, người bệnh điều trị phương pháp phẫu thuật đặt vi điện cực, biện pháp cần chi phí lớn tiềm ẩn nguy khác 4,5 Thực tế đặt yêu cầu việc phát triển thực phẩm chức thuốc nhằm hỗ trợ giảm tác dụng phụ thuốc gây ra, làm chậm tiến trình bệnh điều trị bệnh Trong đó, dựa việc chế bệnh có liên quan đến tượng stress oxi hóa, nhiều nhóm nghiên cứu giới tiến hành sàng lọc thuốc, hợp chất kháng oxi hóa rau sam, lạc tiên, ban âu, vitamin C, curcumin….nhằm ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh 5,6 Resveratrol (3,5,4′ - trihydroxy -trans - stilbene, C14 H12 O3 ) hợp chất polyphenolic tự nhiên không chứa flavonoid tồn 70 loài thực vật khác nhau, nhiều nho, dâu tằm, đậu phộng, việt quất Resveratrol có tiềm lớn ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh Parkinson Nhiều nghiên cứu mơ hình chuột tiếp xúc với chất độc thần kinh 6-OHDA, MPTP, cho thấy resveratrol có khả ngăn chặn triệu chứng bệnh Parkinson, bao gồm vận động nhận thức 8–10 Hiện tượng giải thích thơng qua khả kháng stress oxi hóa, kháng viêm, ức chế trình Trích dẫn báo này: Thảo D T P, Đào L M, Phan T V, Huỳnh A M Đánh giá khả điều trị bệnh Parkinson resveratrol mơ hình ruồi giấm Drosophila melanogaster Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 5(3):1295-1302 1295 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(3):1295-1302 apoptosis tăng cường hoạt động autophagy resveratrol Tuy nhiên, resveratrol có tính sinh khả dụng thấp, tan nước, có tác dụng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng 11 Các nghiên cứu mơ hình tế bào biểu mơ ung thư đại tràng sử dụng với liều lượng thấp, resveratrol đóng vai trị chất kháng apoptosis, nhiên sử dụng với liều lượng cao, resveratrol lại hoạt hóa q trình 12 Một nghiên cứu lâm sàng cho thấy người mắc bệnh gan nhiễm mỡ (không rượu), sử dụng resveratrol với lượng 2,5g/ngày có biểu số tác dụng phụ buồn nôn, nôn, tiêu chảy rối loạn chức gan 13 Ngoài ra, sử dụng với nồng độ cao, resveratrol đóng vai trị tiền chất gây stress oxi hóa Các đặc điểm đặt yêu cầu việc đánh giá hàm lượng resveratrol phù hợp cho điều trị Parkinson Đối với bệnh Parkinson, mơ hình động vật thể vài kiểu hình bệnh mà khơng bao quát toàn đặc điểm lâm sàng bệnh lý bệnh Vì vậy, việc thử nghiệm hoạt tính đối tượng tiềm cần xem xét thực nhiều mơ hình khác Trong nghiên cứu này, mơ hình ruồi knockdown dUCH (gene tương đồng với gene uch-l1 người, với mức độ tương đồng trình tự acid amine khoảng 46%) chuyên biệt tế bào thần kinh sinh dopamine sử dụng để đánh giá hoạt tính resveratrol Mơ hình biểu triệu chứng điển hình bệnh Parkinson suy thoái tế bào thần kinh sinh dopamine, suy giảm khả vận động giai đoạn ấu trùng ruồi trưởng thành 14,15 Kết hợp với ưu điểm khác mơ hình như: chi phí thấp, vòng đời ngắn, tốc độ nhân dòng nhanh giúp thu ngắn thời gian cho phép nghiên cứu cỡ mẫu lớn, mơ hình ruồi giấm knockdown dUCH phù hợp để sử dụng mơ hình in vivo sơ cấp sàng lọc thuốc điều trị bệnh Parkinson Tới thời điểm tại, mơ hình sử dụng để đánh giá khả điều trị Parkinson curcumin, vitamin C, cao chiết rau sam 16–18 Từ sở trên, tiến hành đánh giá hiệu điều trị theo nồng độ resveratrol bệnh Parkinson mơ hình ruồi giấm knockdown gene dUCH chuyên biệt tế bào thần kinh sinh dopamine Kết cho thấy, sử dụng resveratrol nồng độ 0,32mg/g có khả ngăn cản suy thối tế bào thần kinh sinh dopamine suy giảm vận động ấu trùng ruồi trưởng thành VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các dòng ruồi sử dụng mơi trường ni Các dịng ruồi bố mẹ ni giữ môi trường chứa 0,8% agar, 5% sucrose, 5% nấm men, 3% sữa bột 1296 25o C Dòng ruồi RNAi mang trình tự UAS-dUCH.IR nhiễm sắc thể số (mã v26468, Vienna Drosophila Resource Center-VDRC) sử dụng để knockdown dUCH theo chế RNA can thiệp (RNA interference) Hiệu giảm biểu gene dUCH dòng ruồi v26468 chứng minh nghiên cứu trước đó, với hiệu knockdown đĩa tiền phân sinh mắt mức mRNA 30%, mức protein mơ não 60% 15 Dịng ruồi hoang dại Canton S (Bloomington Drosophila stock center, BDSC) sử dụng lai tạo dòng đối chứng Các dòng ruồi định hướng biểu chuyện biệt tế bào thần kinh sinh dopamine trình tự TH-GAL4 nhiễm sắc thể số (8848, BDSC) Dòng ruồi knockdown dUCH chuyên biệt tế bào thần kinh sinh dopamine F1 phép lai 8848 v26468, mang kiểu gene +; +; TH-GAL4/UAS-dUCHIR (viết tắt TH>dUCH-IR) Dòng ruồi đối chứng F1 phép lai Canton S 8848, có kiểu gene +; +; TH-GAL4/+ (viết tắt TH>+) Nhằm đánh giá khả điều trị Parkinson resveratrol, ruồi thí nghiệm ni mơi trường thường, bổ sung resveratrol (Sigma Aldrich, mã số R5010) để đạt nồng độ 0,064 mg/g, 0,32 mg/g, 0,64 mg/g (khối lượng resveratrol/ khối lượng mơi trường) Ngồi ra, để đảm bảo hoạt động hệ thống GAL4-UAS, ruồi F1 nuôi 28o C 19 Chỉ ruồi đực F1 từ 6-8 ngày tuổi sử dụng thí nghiệm để giảm thiểu tác động trình sinh sản Đánh giá khả vận động ấu trùng bậc ba Khả vận động ấu trùng bậc ba đánh giá thơng qua tốc độ bị trườn ấu trùng theo phương pháp công bố trước 15 Ấu trùng bậc ba thu nhận ngẫu nhiên quần thể rửa qua với PBS nhằm loại bỏ thức ăn, tạp chất bám dính thể Ấu trùng sau thấm khăn giấy chuyển lên đĩa agar 2% (mật độ 3-4 con/đĩa) 60s Q trình bị ấu trùng đĩa ghi nhận thông qua camera Olympus E-M10 Video vận động chuyển từ MP4 sang định dạng MOV phần mềm AVI converter (Pazera Jacenk, Hà Lan) phân tích vận tốc bị trườn phần mềm ImageJ (NIH, Mỹ) với tùy chọn wrMTrck (phát triển Jesper Sondergaard Pedersen) Số liệu ghi nhận xử lý thống kê thông qua phần mềm GraphPad Prism Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(3):1295-1302 Đánh giá khả vận động ruồi trưởng thành Khả vận động ruồi trưởng thành đánh giá thông qua khả bị ngược chiều trọng lực tương tự cơng bố trước 17 Hai mươi ruồi đực trưởng thành thu nhận chuyển vào ống hình trụ có chiều cao 15 cm đường kính cm Các ống đập theo chiều trọng lực để chuyển tồn ruồi phía đáy ống Ruồi chuyển động ngược lên theo tập tính bị ngược chiều trọng lực Quá trình vận động ghi lại 30 giây ghi nhận điểm sau giây đầu sau đập Trong tất thí nghiệm leo trèo, điểm mà ruồi leo lên tính sau: (dưới cm), (từ đến cm), (từ đến cm), (từ đến cm), (từ đến 10 cm) (hơn 10 cm) Thử nghiệm leo trèo thực ruồi 1, 5, 10 ngày tuổi Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Tế bào thần sinh dopamine nhuộm với kháng thể kháng tyrosine hydroxylase (Cell Signaling, code #2792S) với tỷ lệ 1:250 Tyrosine hydroxylase enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp dopamine chun biệt cho nhóm tế bào Quy trình nhuộm thực công bố trước Hiệp cộng 15 Hình ảnh chụp thơng qua kính hiển vi huỳnh quang ECLIPSE NI-U Xử lý liệu Số liệu thu nhận xử lý phần mềm GraphPad Prism Các kết khác xử lý oneway ANOVA, so sánh cặp Sidak post hoc test Số liệu trình bày với giá trị trung bình độ lệch chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tác động resveratrol lên khả vận động ấu trùng ruồi giấm knockdown dUCH tế bào thần kinh sinh dopamine Trong nghiên cứu bệnh Parkinson, khả vận động tiêu chí quan trọng xác định tình trạng bệnh 20 Ở giai đoạn ấu trùng bậc ba ruồi giấm, khả vận động đánh giá thơng qua thử nghiệm bị trườn (crawling assay) 21 Nhằm thử nghiệm tác động chất kháng oxi hóa resveratrol lên kiểu hình bệnh Parkinson ruồi giấm knockdown dUCH, chúng tơi tiến hành thử nghiệm bị trườn với ấu trùng bậc nuôi môi trường khơng có resveratrol mơi trường có bổ sung resveratrol nồng độ 0,064 mg/g, 0,32 mg/g, 0,64 mg/g Kết cho thấy: Trên mơi trường bản, ấu trùng dịng knockdown (TH>dUCH-IR) có vận tốc bò trườn thấp so với dòng đối chứng (TH>+) (∆v= 0,32 mm/s, One-way ANOVA, p< 0,0001) (Hình 1) Điều này, cho thấy knockdown dUCH chuyên biệt tế bào thần kinh sinh dopamine làm giảm khả vận động ấu trùng, đồng thời phù hợp với triệu chứng mơ hình ghi nhận trước 15 Đối với dịng đối chứng, sử dụng môi trường chứa resveratrol nồng độ 0,064 mg/g 0,32 mg/g không làm thay đổi khả vận động ấu trùng Tuy nhiên nồng độ 0,64mg/g, resveratrol làm giảm khả di chuyển ấu trùng (∆v= 0,18 mm/s, One-way ANOVA, p0,05) Tuy nhiên, nồng độ 0,32mg/g, resveratrol làm tăng đáng kể khả vận động (Hình 1) (∆v= 0,23 mm/s, One-way ANOVA, p