Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2018, 16(7): 652-661 www.vnua.edu.vn Vietnam J Agri Sci 2018, Vol 16, No 7: 652-661 PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI KHUẨN SỐNG TRONG CANH TRÙNG NUÔI TẢO Chlorella KHÔNG THUẦN KHIẾT Vũ Thị Hồn Khoa Mơi trường, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tác giả liên hệ: hoanvt@vnua.edu.vn Ngày gửi bài: 06.02.2018 Ngày chấp nhận: 06.09.2018 TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm tìm đa dạng loài vi khuẩn sống với tảo Chlorella Chúng sử dụng môi trường bán rắn Nutrient Broth với nồng độ pha loãng 10 100 lần để phân lập vi khuẩn từ hai canh trùng (môi trường) nuôi tảo Chlorella sp chủng C2 C6, có nguồn gốc từ đất Để định danh vi khuẩn phân lập đến tên giống, chúng tơi tiến hành giải trình tự, so sánh giống trình tự hầu hết chiều dài gen 16S rRNA chúng với loài gần genbank/ncbi xây dựng phả hệ cho giống (genus) Mười sáu chủng vi khuẩn phân lập định danh thuộc giống sau: Caulobacter, Shinella, Aminobacter, Variovorax, Polaromonas, Brevundimonas, Emticicia Nghiên cứu cho thấy phong phú, đa dạng loài vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo không khiết Từ khóa: Chlorella, định danh vi khuẩn, phân lập vi khuẩn; vi khuẩn sống chung với tảo Isolation and Identification of Bacteria Co-Cultivated with Non-Axenic Cultures of Chlorella ABSTRACT This study was investigated to find out the diversity of bacteria co-cultivated with microalgae Chlorella Bacteria were isolated from two non-axenic algal cultures of Chlorella sp strains C2 and C6 originated from soil using agar plates of 10- and 10 -fold diluted nutrient broth Based on the similarity of the almost full length 16S rRNA gene sequences, the type strains of species phylogenetically closely related to the isolated strains and neighbor-joining tree, the strains were identified at the genus level Sixteen bacterial strains were isolated and identified as species of seven genera as follows: Caulobacter, Shinella, Aminobacter, Variovorax, Polaromonas, Brevundimonas, Emticicia The study showed the diversity and abundance of bacteria co-cultivated with non-axenic cultures of algae Keywords: Bacteria co-cultivated with algae; Chlorella, bacterial isolation, identification ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vêt giĂ vai trị vơ quan trọng cỏc vũng tuổn hon vờt chỗt trờn trỏi ỗt, c bit l quỏ trỡnh trao i nởng lỵng cỹng nhỵ tn hồn sinh hóa ngun tố cûa hệ sinh thỏi Trong t nhiờn, vi sinh vờt ỵc bit n vi rỗt nhiu dọng chung sng, th hin qua cỏc mi quan h t cọnh tranh, tỵng h cho n cng sinh (Cole, 1982) Trong h sinh thỏi ỗt, mi quan quan hệ giĂa vi 652 khuèn thăc vêt ó cũ rỗt nhiu nhng nghiờn cu, c bit l vi khuốn vựng r (rhizosphere), vựng ỗt ni m vi khuốn sinh trỵng v phỏt trin da vo hoọt ng cỷa r cõy Khỏi nim phycosphere tỵng ng vi vựng rễ, vùng xung quanh tế bào tâo, nĄi chĀa cỏc sõn phốm trao i chỗt, chỷ yu l cỏc hp chỗt hu c, tr thnh ngun dinh dỵng cung cỗp cho cỏc vi sinh vờt khỏc sinh sng Mt lỵng khụng nhú cỏc loọi tõo sinh sng ỗt v vựng phycosphere, l ni sinh sng rỗt tt cho Vũ Thị Hồn lội vi khn (Bell & Mitchell, 1972) Nghiên cĀu mối quan hệ giĂa vi khuèn tâo lýc (ngành tâo lýc - Chlorophyta) cò ċ nghùa rỗt ln bi vỡ nú khụng chợ th hin mối quan hệ sinh sống giĂa vi sinh vêt vĆi vi sinh vêt mà tiền đề cûa mối quan hệ giĂa thăc vêt vĆi vi sinh vêt Tuy nhiờn, cho n chỳng ta cú rỗt ớt nhĂng nghiên cĀu nhĂng mối quan hệ này, đặc biệt kiến thĀc nhĂng loài vi khuèn sống xung quanh/trờn t bo tõo cỹng nhỵ nghùa cỷa să tồn täi Thăc tế có số loi tõo phõn lờp rỗt khú cú th lm säch vi khuèn (làm thuæn khiết) nhà nghiên cu thỵng nuụi trỡ tõo chung vi vi khuốn (Watanabe et al., 2005) Trong nghiên cĀu s dýng hai canh trựng (mụi trỵng) nuụi tõo l Chlorella sp chûng C2 chûng C6, nhĂng loài tõo ỵc phõn lờp t ỗt nhỵng khụng ỵc lm thn khiết, vĆi mýc đích giĂ läi nhĂng lồi vi khuèn sống vĆi chúng để nghiên cĀu mối quan hệ giĂa tâo lýc vi khuèn Chlorella sp C2 C6 hai lồi tâo lýc, có hình cổu, khụng cũ tiờn mao, kớch thỵc dao ng t 5-8 μm, sinh bào tā Việc phân lêp vi khuèn t hai canh trựng nuụi tõo trờn ỵc tin hnh læn đæu tiên täi nghiên cĀu Thành phæn loi vi khuốn phõn lờp ỵc s ỵc nh danh tỡm ỵc s a dọng sinh hc mối quan hệ giĂa tâo vi khuèn, làm tiền đề cho nhĂng nghiên cĀu vai trò cûa cỏ th cỹng nhỵ chỡa khúa m s hiu biết mối quan hệ nói riêng, mối quan hệ giĂa vi sinh vêt thăc vêt nói chung VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Canh trùng nuôi tâo Vi tâo lýc Chlorella sp C2 Chlorella sp C6 ỵc phõn lờp t ỗt tọi khu thớ nghim cỷa Trỵng ọi hc Tokyo (Otsuka et al., 2008) Chỳng ỵc nuụi trọng thỏi khụng thuổn khit (lộn tọp vi khuèn) thąi gian dài phýc vý mýc đích nghiên cĀu khác Chúng tơi sā dýng mơi trỵng dinh dỵng C dọng lúng (Ichimura, 1971) nuụi cỗy hai chỷng tõo Chlorella ny Tõo ỵc nuụi điều kiện sáng/tối luân phiên vĆi 16 h sáng/8 h ti; cỵng chiu sỏng 10-20 àmol photons/m/s v 25°C điều kiện sáng, 20°C điều kiện tối Cỏc chỷng tõo ny ỵc cỗy chuyn trỡ tuổn lổn Ton b thớ nghim ỵc tin hnh điều kiện vơ trùng täi phịng thí nghiệm khoa hc ỗt, Trỵng ọi hc Tokyo, Nhờt Bõn 2.2 Phõn lp vi khun Dch nuụi cỗy sau tuổn cỷa tõo Chlorella sp chỷng C2 v C6 ỵc pha loóng n nng 10-4 v 10-5 bỡng nỵc vụ trựng v dựng nũ phõn lờp vi khuốn nhỵ sau: cỗy 100 l canh dch hai nng pha lỗng 10-4 10-5 đïa thäch có chĀa mơi trỵng Nutrient Broth (NB) (Difco, Detroit, MI, US) ó pha lỗng 10 100 lỉn (1/10 1/100 NB) vĆi lỉn lặp läi, sau đị đem ni ć 26°C tháng Trong q trình ni, să hình thành khuốn lọc cỷa vi khuốn ỵc kim tra v m tuæn, sau đến tháng tiến hành phân lờp tỗt cõ cỏc loọi vi khuốn cú trờn tng đïa thäch dăa să khác hình thái, kớch thỵc, mổu sớc, cỷa khuốn lọc vi t đến khuèn läc cho loäi Vi khuèn sau ũ ỵc lm thuổn bỡng cỏch cỗy truyn nhiu lổn trờn mụi trỵng 1/10 NB v 1/100 NB Nhng chỷng vi khuốn thuổn khit thu ỵc tip týc ỵc nuụi v gi ging bỡng cỏch cỗy chuyn tuổn lổn trờn mụi trỵng 1/10 NB (da trờn kt quõ thớ nghim cho thỗy tỗt cõ cỏc loi vi khuốn phõn lờp ỵc mụi trỵng 1/100 NB u sinh trỵng phỏt trin tt nuụi mụi trỵng 1/10 NB) Vi khuốn ỵc nuụi 26C tuổn v gi 4C tuổn Tỗt cõ cỏc thớ nghim ỵc tin hnh iu kin vụ trựng 2.3 Định danh vi khuẩn 2.3.1 Tách chiết DNA vi khun S dýng que cỗy vụ trựng lỗy t đến khuèn läc cûa loäi vi khuèn sau tuổn nuụi cỗy (s lỵng khuốn lọc phý thuc vo kớch thỵc cỷa nú) hũa vo 100 l dung dðch 0,05 M, NaOH cho vào máy ổn nhiệt làm nóng ć 95°C 15 phút, sau đị ly tâm vĆi tốc độ 15.000 vịng/phút không 5-15 phút ć 4°C Thu phæn 653 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết (DNA) pha lỗng 10 lỉn, sā dýng mỏy quang ph UV o nng cỹng nhỵ kim tra s tinh sọch cỷa DNA tỏch chit ỵc Nhng DNA ọt tiờu chuốn ỵc s dýng lm khuụn méu cho phân Āng khuếch đäi gen 2.3.2 Phản ứng khuếch đại (PCRPolymerase chain reaction) gen 16S ribosomal RNA Hỉu hết chiều dài độn gen 16S ribosomal RNA (rRNA) (xỗp xợ 1500 bp) cỷa nhng loi vi khuốn trờn ỵc khuch ọi bi phõn ng PCR vi vic s dýng cp mi xuụi 27F v ngỵc 1492R tỵng Āng vĆi vð trí 8-27 1492-1513 ć gen 16S rRNA cûa vi khuèn Escherichia coli 16S rRNA (trình tă gen cỷa mi ỵc trỡnh by tọi bõng 2) Phõn ng PCR ỵc thc hin iu kin nhỵ sau: Sā dýng ống PCR vô trùng 0,2 ml chĀa 25 µl hỗn hĉp phân Āng bao gồm: μl DNA mộu ỵc chit xuỗt t mi chỷng vi khuốn phõn lờp ỵc; 0,5 àl cho lổn lỵt mi 27 F 1492R vĆi nồng độ 10 pM; 2,5 µl 50 mM MgCl2; 17,4 l nỵc MilliQ; 0,1 l enzyme AmpliTaq DNA (Applied Biosystems); 0,5 μl dNTP (2,5 mM cho loäi NTP); 2,5 μl BSA (nồng độ mg/ml) Quy trình chäy PCR bao gồm: chu kĊ nhiệt 94°C 10 phút nhìm làm biến tính độn DNA, sau ũ l 27 chu k nhit vi bỵc: (1) biến tính - tách sĉi DNA ć 94°C 30 giây, (2) gín mồi ć 55°C 30 giây, (3) tổng hĉp - kéo dài ć 72°C phút Q trình chäy phân Āng PCR hồn thành ć điều kiện 72°C phút, sân phèm cuối cûa phõn ng ỵc gi 4C Quy trỡnh PCR ỵc thăc máy chu kĊ nhiệt GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, US), kớch thỵc (chiu di) độn gen sân phèm cûa q trình khuếch đäi gen bỡng phỵng phỏp PCR ỵc kim tra bỡng chọy điện di gel 1,5% agarose nhuộm bìng ethidium bromide 2.3.3 Giải trình tự gen 16S rRNA định danh vi khuẩn Sân phèm PCR sau tinh säch bìng ct MicroSpin S-400 HR (GE Healthcare Biosciences, Oslo, Norway) ỵc sā dýng trăc tiếp làm khuôn méu cho việc giâi trình tă gen vĆi việc dùng cặp mồi xi (F) v ngỵc (R) theo th t bao gm: 27F, 533F, 926F, 520R, 951R, 1492R (Bâng 1) chäy máy CEQ 8000 (Beckman Coulter) Kết quâ giâi trình t gen ỵc phõn tớch v hiu chợnh bỡng phổn mềm Finch TV 1.4 (Geospiza, Seattle, WA, USA; http://www.geospiza.com/finchtv/) Sau lội bó trình tă độn mồi, tiến hành hiệu chỵnh trình tă hai chiều cûa gen bìng phỉn mềm Clustal W 2.0 (Larkin et al., 2007) để thu ỵc chớnh xỏc trỡnh t gen 16S rRNA cỷa tng chỷng vi khuốn phõn lờp ỵc Chỳng tụi ó s dýng chỵng trỡnh SeqMatch program (Cole et al., 2007) so sỏnh s tỵng ng v trỡnh t hổu ht chiều dài gen16S rRNA cûa nhĂng chûng loài vi khuèn cú quan h gổn gỹi nhỗt vi nhng chỷng vi khuốn phõn lờp ỵc S dýng phổn mm Clustal W 2.0 (Larkin et al., 2007) để phân tích să phát Bâng Trình tự đoạn mồi sử dụng khuếch đại giâi trình tự gen 16S rRNA Primer Gen mục tiêu/(vị trí)1 Trình tự (5’-3’) 27F 16S rDNA (8-27) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 533F 16S rDNA (515-533) GTGCCAGCAGCCGCGGTAA 926F 16S rDNA (907-926) AAACTCAAATGAATTGACGG 520R 16S rDNA (538-520) GTATTACCGCGGCTGCTGG 951R 16S rDNA (969-951) TTGCATCGAATTAAACCAC 1492R 16S rDNA (1510-1492) GGTTACCTTGTTACGACTT Ghi chú: 1Vị trí tương ứng với gen 16S rRNA vi khuẩn Escherichia coli 654 Vũ Thị Hoàn sinh chûng loài cûa chỷng phõn lờp ỵc v nhng chỷng tỵng ng đðnh danh vi khn ć mĀc phân lội đến giống/lồi KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN 3.1 Mật độ vi khun Kt quõ Bõng cho thỗy s lỵng khuốn lọc m ỵc mụi trỵng 1/10 NB v canh trùng ni tâo Chlorella sp lồi C2 nhiều hĄn mụi trỵng 1/100 NB v canh trựng nuụi tõo Chlorella sp loài C6, nhiên să khác biệt khơng nhiều Dăa vào să khác hình thái, mỉu síc, thąi gian mọc„ cûa khn läc, chỳng tụi ó phồn lờp ỵc chỷng vi khuốn tÿ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chûng C2, vĆi ký hiệu C2a1, C2a2, c2a3, C2b, C2b1, C2d, C2e C2f chûng tÿ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chỷng C6 vi cỏc ký hiu tỵng ng: C6a, C6a1, C6b, C6b1, C6d, C6d1, C6b2 C6g (tổng cng 16 chỷng) Tỗt cõ cỏc chỷng vi khuốn phõn lờp ỵc t mụi trỵng 1/100 NB u sinh trỵng v phỏt trin tt ỵc nuụi cỗy trờn mụi trỵng 1/10 NB, nhiu chỷng thờm cũn mc nhanh hn Vỡ vờy, chỳng tụi chợ s dýng nhỗt mụi trỵng 1/10 NB gi ging vi khuốn phõn lờp ỵc cỹng nhỵ dựng cỏc nghiờn cu tip theo Kt quõ trờn cho thỗy s phong phỳ, a däng loài vi khuèn sống canh trùng nuôi tâo să tồn täi nhĂng mối quan hệ nhỗt nh gia cỏc loi vi sinh vờt vi Kết quâ mć nhĂng nghiên cĀu nhỵ vic xỏc nh vai trũ cỷa tng nhõn t s kt hp ny; chỗt dinh dỵng gỡ tõo cung cỗp cho vi khuốn v ngỵc lọi vi khuốn tọo chỗt gỡ nuụi tõo? Trong mụi trỵng nuụi tõo khụng cú cỏc hp chỗt carbon, vờy rỗt cú th tõo ó tng hp v cung cỗp cho vi khn Ngồi ra, cỉn tìm thêm nhĂng chìa khịa khác để mć rộng hiểu biết mối quan hệ nhĂng mối quan hệ khác nĂa 3.2 Định danh vi khuẩn Các chûng C2a1, C2a2, C2a3, C6a1 v C6a2 ỵc phõn lờp t canh trựng nuụi tâo Chlorella sp C2 C6, vĆi đặc điểm khuèn lọc cú mổu vng nhọt, hỡnh trủn, kớch thỵc nhú, bề mặt trĄn, nhày, lồi, thuộc kiểu khuèn läc däng S Kt quõ phõn tớch trỡnh t gen cho thỗy chûng vi khn C2a1, C2a2, C2a3 có trình tă gen 16S rRNA ging vi loi gổn nhỗt Caulobacter fusiformis ATCC 15257T tÿ 99,7% đến 99,8% Dăa vào kết quâ xây dăng phát sinh chûng lồi (Hình 1) să giống trình tă gen16S rRNA, chûng C2a1, C2a2, v C2a3 ỵc nh danh l C fusiformis Loi gổn nhỗt vi chỷng C6a1 v C6a2 cỹng l C fusiformis ATCC 15257T nhỵng s ging v trỡnh t gen 16S rRNA thỗp hn, chợ l 97,5% Bõng Kết quâ phân lập vi khuẩn từ hai canh trùng nuôi tâo Chlorella sp C2 C6 Ký hiệu Nguồn gốc phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Loài vi khuẩn gần Tỷ lệ giống trình tự gen 16SrRNA (%) Vàng nhạt, tròn, nhỏ, trơn, nhầy, lồi Caulobacter fusiformis 99,7-99,8 Chlorella sp C6 Trắng, trịn, có viền sáng huỳnh quang, không ướt, phẳng đến lồi, bề mặt trơn Shinella zoogloeoides 98,5 C6b, C6g Chlorella sp C6 Trắng đến vàng, trịn, lồi, viền khơ Aminobacter aminovorans 99,9 C6d, C6d1, C6b2 Chlorella sp C6 Trắng đục, tròn, ướt, lồi Variovorax limosa 97,2-97,7 C2d, C2f Chlorella sp C2 Trắng đục, tròn, lồi Polaromonas jejuensis 97,6-97,9 C2e1 Chlorella sp C2 Trắng trong, tròn, trơn láng, lồi Brevundimonas kwangchunensis C2b, C2b1 Chlorella sp C2 Hồng nhạt, tròn, trơn, lồi Emticicia ginsengisoli C2a1 C2a2, c2a3 Chlorella sp C2 C6a, C6a1 Chlorella sp C6 C6b1 97,5-97,6 98,5 99,0-99,4 655 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết C2a3 0.02 919 1000 C2a2 C2a1 Caulobacter fusiformis ATCC 15257T [AJ227759] 798 C6a1 1000 C6a Caulobacter segnis NBRC 15250T [AB023427] 1000 Caulobacter crescentus ATCC 15252T [AF125194] Caulobacter vibrioides DSM 9893T [AJ009957] 1000 Caulobacter henricii ATCC 15253T [AJ227758] Caulobacter mirabilis LMG 24261T [AJ227774] Caulobacter bacteroides ATCC 15254T [AJ227782] 749 Caulobacter variabilis ATCC 15255T [AJ227783] 92.9 Caulobacter subvibrioides NBRC 16000T [AJ227784] Brevundimonas intermedia ATCC 15262T [AJ227786] 979 1000 Brevundimonas vesicularis NBRC 12165T [AJ007801] Brevundimonas diminuta JCM 2788T [AB021415] Phenylobacterium falsum LMG 22693T [AJ717391] 879 Phenylobacterium immobile ATCC 35973T [Y18216] Ensifer adhaerens NBRC 100388T [AM181733] Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn, C2a1, C2a2, C2a3, C6a C6a1 phân lập từ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chủng C2 C6 97,6%, vĆi kết quâ thể ć phâ hệ (Hình 1) chỳng ỵc nh danh thuc ging Caulobacter, nhỵng chỵa xỏc nh tờn loi Rỗt cú th hai chỷng ny l loi mi tỡm ỵc tọi nghiờn cu ny, vỡ vờy cỉn có nhĂng nghiên cĀu để chĀng minh cho nhên đðnh này, täm đðnh danh cho chúng Caulobacter sp C6a1 C6a2 Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn C6b1 phân lập từ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chủng C6 656 Vũ Thị Hoàn Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn C6b C6g phân lập từ canh trùng nuôi tõo Chlorella sp chng C6 Chỷng C6b1 ỵc phõn lờp tÿ canh trùng ni tâo Chorella sp chûng C6, có khn läc trịn mỉu tríng có viền sáng huĊnh quang, khụng ỵt, phợng n li, b mt trn Loi gổn nhỗt l Shinella zoogloeoides ATCC 19623T (= NBRC 102405T = JCM 20728T) vĆi 98,5% giống trình tă gen 16S rRNA Cùng vĆi kết quâ thể ć phỏt sinh chỷng loi (Hỡnh 2), chỷng ny ỵc nh danh n tờn ging l Shinella, chỵa nh danh n loi, rỗt cú th ồy l loi vi khuốn mi, täm đặt tên Shinella sp C6b1 Chûng vi khuèn vi ký hiu C6b v C6g ỵc phõn lờp t canh trùng nuôi tâo Chlorella sp C6, khuèn läc màu tÿ tríng đến vàng nhät, hình trịn, viền khơ, däng dt n li Loi gổn nhỗt ỵc xỏc nh l Aminobacter aminovorans ATCC 23314T (= JCM 7852T) vĆi 99,9% trình tă gen 16S rRNA giống (Hình 3) Cùng vĆi kết quâ thể phát sinh chûng loài thỡ hai chỷng phõn lờp ỵc cú tờn A aminovorans Các chûng vi khuèn C6d, C6d1 C6b2 phân lêp ỵc t canh trựng nuụi tõo Chlorella sp C6, cú khuốn lọc mổu trớng ýc, hỡnh trũn, ỵt, li, khuốn läc däng S Chúng giống vĆi loài vi khuèn Variovorax boronicumulans NBRC 103145T 96,9%; 97,5%; 96,9%; giống vĆi Variovorax soli 96,7%, 97,3%, 97,1% giống vĆi Variovorax paradoxus 96,6%, 97%, 96,9%, trình tă gen 16S rRNA Kết quâ phâ hệ (Hình 4) giâi trỡnh t gen cho thỗy chỷng C6d, C6d1 v C6b2 ỵc nh tờn n cỗp phõn loọi ging l Variovorax, m chỵa th phõn loọi n loi, chỳng ỵc nghi ngą loài mĆi täm đặt tên VariovoraxI sp C6d; C6d1 C6b2 Chúng thăc nhĂng nghiên cĀu để chĀng minh chúng loài mĆi 657 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết 0.01 Acidovorax delafieldii ATCC 17505T [AF078764] Curvibacter delicatus ATCC 14667T [AF078756] 928 Curvibacter gracilis IAM 15033T [AB109889] Curvibacter lanceolatus IAM 14947T [AB021390] 1000 885 999 Variovorax boronicumulans KCTC 22010T [AB300597] Variovorax paradoxus ATCC 17713T [AJ420329] 963 Variovorax dokdonensis CIP 108838T [DQ178978] 859 Variovorax soli DSM 18216T [DQ432053] C6d1 C6b2 1000 857 1000 C6d Hydrogenophaga defluvii CIP 108119T [AJ585993] Hydrogenophaga atypica CIP 108118T [AJ585992] 1000 Hydrogenophaga palleronii CIP 103304T [AF078769] Hydrogenophaga taeniospiralis CIP 106727 T [AF078768] Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn C6d, C6d1 C6b2 phân lập từ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chủng C6 Hai chûng C2d v C2f phõn lờp ỵc t canh trựng tõo Chlorella sp C2 có khn läc mỉu tríng đýc, hình trịn, có viền, khn läc khơng nhày cüng khơng khơ Trình tă gen 16S rRNA cûa chúng giống vĆi loài Polaromonas aquatica lổn lỵt l 97,8%; 97,9%, v loi Polaromonas vacuolata 97,8%; 97,9% loài Polaromonas jejuensis 97,6%; 97,7%, v dỵi 97% so vi cỏc loi khỏc cỷa ging vi khuèn Cùng vĆi kết quâ phân tích phâ hệ (Hình 5), hai chûng vi khuèn C2d C2f phõn lờp ỵc 658 thuc v ging vi khuốn Polaromonas, täm đặt tên Polaromonas sp C2d C2f Chỷng vi khuốn C2e1 ỵc phõn lờp t canh trựng ni tâo Chlorella sp C2 cị đặc điểm khn läc mỉu tríng trong, hình trịn, trĄn, láng, bịng, däng S VĆi 98,5% trình tă gen 16S rRNA giống vĆi vi khuốn Brevundimonas aveniformis DSM 17033T (loi gổn nhỗt vi chỷng phõn lờp ỵc) cỹng nhỵ kt quõ th hin trờn cõy phõ h thỡ chỷng C2e1 phõn lờp ỵc cú tên Brevundimonas aveniformis (Hình 6) Vũ Thị Hồn 0.01 Acidovorax valerianellae CFBP 4730T [AJ431731] 1000 Acidovorax defluvii DSM 12644T [Y18616] 970 Acidovorax delafieldii Acidovorax facilis ATCC 17505T [AF07876４] DSM 649T [AF078765] Rhodoferax ferrireducens [AF435948] Rhodoferax fermentans JCM 7819T [D16211] 1000 792 Rhodoferax antarcticus ATCC 700587T [AF084947] 1000 Polaromonas jejuensis DSM 19351T [EU030285] 771 Polaromonas aquatica CIP 108776T [AM039830] Polaromonas naphthalenivoransDSM15660T [AY166684] 1000 Polaromonas hydrogenivorans DSM 17735T [DQ094183] Polaromonas vacuolata ATCC 51984T [U14585] C2f 962 1000 C2d Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen 16S rRNA chủng vi khuẩn C2d C2f phân lập từ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chủng C2 Hai chỷng C2b v C2b1 ỵc phõn lờp t canh trùng ni tâo Chlorella sp C2 cị đặc điểm khn läc mỉu hồng nhät, hình trđn, trĄn láng däng S Loi gổn nhỗt ỵc xỏc nh l Emticicia ginsengisoli LMG 23396T vĆi kết quâ giống trình tă gen 16S rRNA lổn lỵt l 99,4% v 99,5% Cựng vĆi kết q phân tích phâ hệ (Hình 7), hai loi vi khuốn phõn lờp ỵc cú tờn Emticicia ginsengisoli 3.3 Thâo luận Tÿ hai canh trùng nuôi tâo Chlorella sp khơng thn khiết, 16 lồi vi khn ỵc phõn lờp v xỏc nh tờn thuc v ging vi khuốn khỏc Trong ũ ging Caulobacter ỵc phân lêp ć câ hai canh trùng tâo Chlorella sp chỷng C2 v C6, nhỵng chỳng lọi nỡm trờn hai nhánh khác phâ hệ, điều đò cho thỗy chỳng khụng cựng mt loi cho dự ban ổu chỳng hỡnh thnh trờn cựng mt mụi trỵng nuụi cỗy vĆi nhĂng đặc điểm khuèn läc giống Các chûng vi khuốn cũn lọi chợ ỵc phõn lờp t mt canh trùng nuôi tâo Chlorella sp C2 C6 Điều ũ cho thỗy mụi trỵng ny khụng chợ cú tâo lăa chọn loài vi khuèn chung sống mà rỗt cú th chớnh vi khuốn cỹng chn loi tõo mà chúng muốn “hĉp tác” So sánh vĆi thành phæn loài vi khuèn ć canh trùng tâo Chlorella sp C6 ó ỵc phõn tớch bỡng phỵng phỏp khụng phồn lêp (denaturing gradient gel electrophoresis-DGGE) cûa Otsuka et al (2008), kết quâ phân lêp vi khuèn tÿ canh trùng nuôi tâo chûng C6 ć nghiên cĀu chỵ chiếm phỉn nhó Điều đị cị thể có nhiều lồi vi khuốn khụng th sinh trỵng phỏt trin iu kin nuụi cỗy 659 Phõn lp, nh danh vi khun sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn C2e1 phân lập từ canh trùng nuôi tâo Chlorella sp chủng C2 C2b C2b1 Ghi chú: Những số giao điểm thể tần số xuất nhóm Hình Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự hầu hết chiều dài gen16S rRNA chủng vi khuẩn C2b C2b1 phân lập từ canh trùng ni tâo Chlorella sp chủng C2 660 Vũ Thị Hồn mà nghiên cĀu sā dýng Trong nghiên cĀu cûa Otsuka et al (2008) có hai lồi vi khn Caulobacter Brevundimonas trùng vĆi nghiên cĀu Một số loi vi khuốn Caulobacter cho thỗy cú khõ nởng phồn giâi tế bào tâo Chlorella (Kawano et al., 1997) Nghiên cu cỷa Park et al (2008) cũn cho thỗy mt số chûng vi khn Brevundimonas sp có khâ nëng kích thích să sinh ć cûa tâo Chlorella ellipsoidea Do đị, cỉn có nhĂng nghiên cĀu xem hai loi vi khuốn Caulobacter v Brevundimonas phõn lờp ỵc nghiờn cu ny cú õnh hỵng nhỵ th no đến loài tâo lýc, đặc biệt Chlorella VĆi vic phõn lờp ỵc cỏc chỷng vi khuốn thuổn khit nhỵ trờn ó m thờm nhng hỵng nghiờn cu thỳ v tip theo nhỵ nghiờn cu chng minh loi vi khuốn mi, nghiờn cu v s õnh hỵng hay tỏc ng cỷa tng loi vi khuốn n sinh trỵng v phỏt trin cỷa tõo, t ũ tỡm ỵc chìa khóa mć să hiểu biết mối quan hệ giĂa loài vi sinh vêt vĆi KT LUN Mỵi sỏu chỷng vi khuốn ó ỵc phõn lêp tÿ hai canh trùng nuôi tâo lýc Chlorella sp C2 v C6 , ó ỵc xỏc nh ỵc n tên giống Chúng thuộc giống là: Caulobacter, Shinella, Aminobacter, Variovorax, Polaromonas, Brevundimonas, Emticicia Một số chûng vi khuèn nhỵ C6a1, C6a2; C6b1; C6d, C6d1, C6b2 cú th l lồi mĆi, vêy cỉn có nhĂng nghiên cĀu sau nghiên cĀu LỜI CÁM ƠN Chúng xin chồn thnh cỏm n giỏo sỵ Keishi Senoo, phũ giỏo sỵ Shigeto Otsuka, Trỵng ọi hc Tokyo ó cung cỗp canh trựng tõo lýc Chlorella sp C2 v C6 cỹng nhỵ cỏc phỵng tin v h tr ti cho nghiên cĀu TÀI LIỆU THAM KHÂO Bell, W.H and Mitchell, R (1972) Chemotactic and growth responses of marine bacteria to algal extracellular products Biol Bull., 143: 265-277 Cole, J.J (1982) Interactions between bacteria and algae in aquatic ecosystems Ann Rev Ecol Syst., 13: 291-314 Cole, J.R., Chai, B., Farris, R.J., Wang, Q., KulamSyed-Mohideen, A.S., McGarrell, D.M., Bandela, A.M., Cardenas, E., Garrity, G.M and Tiedje, J.M (2007) The ribosomal database project (RDP-II): introducing myRDP space and quality controlled public data Nucleic Acids Res., 35: 169-172 Croft, M.T., A.D Lawrence, E Raux-Deery, M.J Warren, and A.G Smith (2005) Algae acquire vitamin B12 through a symbiotic relationship with bacteria Nature, 483: 90-93 Ichimura, T (1971) Sexual cell division and conjugation-papilla formation in sexual reproduction of Closterium strigosum In Proceedings of the 7th International Seaweed Symposium, ed by Nishizawa, K., University of Tokyo Press, Tokyo, pp 208-214 Kawano, Y., Y., Nagawa., H, Nakanishi., H, Nakajima., M, Matsuo., and T, Higashihara (1997) Production of thiotropocin by a marine bacterium, Caulobacter sp and its antimicroalgal activities J Mar Biotechnol., 5: 225-229 Kim, B.Y., Weon, H.Y., Yoo, S.-H., Lee, S.Y., Kwon, S.W., Go, S.J and Stackebrandt, E (2006) Variovorax soli sp nov., isolated from greenhouse soil Int J Syst Evol Microbiol., 56: 2899-2901 Kumar, S., Tamura, K and Nei, M (2004) MEGA3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment Brief Bioinform., 5: 150-163 Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., Mcgettigan, P.A., Mcwilliam, H., Valentin, F., Wallace, I.M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J.D., Gibson, T.J and Higgins, D.G (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0 Bioinformatics, 23: 2947-2948 Otsuka, S., Y Abe, R Fukui, M Nishiyama, and K Senoo (2008a) Presence of previously undescribed bacterial taxa in non-axenic Chlorella cultures J Gen Appl Microbiol., 54: 187-193 Park, Y., K.W Je, K Lee, S.E Jung, and T.J Choi (2008) Growth promotion of Chlorella ellipsoidea by co-inoculation with Brevundimonas sp isolated from the microalga Hydrobiologia, 598: 219-228 Ueda, H., S Otsuka, and K Senoo (2009) Community composition of bacteria co-cultivated with microalgae in non-axenic algal cultures Microbiol Cult Coll., 25: 21-25 Ueda, H., S Otsuka, and K Senoo (2010) Bacterial communities constructed in artificial consortia of bacterial and Chlorella vulgaris Mircobes and Invironments, 25: 36-40 Watanabe, K., N Takihana, H Aoyagi, S Hanada, Y Watanabe, N Ohmura, H Saiki, and H Tanaka (2005) Symbiotic association in Chlorella culture FEMS Microbiol Ecol., 51: 187-196 661 ... ginsengisoli C2a1 C2a2, c2a3 Chlorella sp C2 C6a, C6a1 Chlorella sp C6 C6b1 97,5-97,6 98,5 99,0-99,4 655 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết C2a3 0.02 919 1000... mĆi 657 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết 0.01 Acidovorax delafieldii ATCC 17505T [AF078764] Curvibacter delicatus ATCC 14667T [AF078756] 928 Curvibacter... phút, sau đị ly tâm vĆi tốc độ 15.000 vịng/phút không 5-15 phút ć 4°C Thu phæn 653 Phân lập, định danh vi khuẩn sống canh trùng nuôi tảo Chlorella không khiết (DNA) pha lỗng 10 lỉn, sā dýng máy quang