Chiết xuất và làm giàu capsaicin từ ớt

18/08/2015 Họ và tên: Nguyễn Hồ Diệu Linh MSSV: 61101840 Lớp: HC11TP Đề tài: Chiết xuất và làm giàu Capsaicin từ ớt CÁC THÍ NGHIỆM – CÔNG VIỆC DỰ KIẾN LÀM - Xác định kích thước hạt: rây – kích thước hạt < 0,85 mm Đo ẩm của nguyên liệu Thiết bị: máy đo độ ẩm Nguyên liệu: ớt bợt Trích ly dầu ớt, sử dụng phương pháp sau: 3.1 Siêu âm Thiết bị: bể siêu âm Dụng cụ: erlen Nguyên liệu: ớt bột Dung môi: ethanol Ớt bột Phương pháp thực hiện: Cân VEtOH = 100ml Siêu âm m ớt = 5g time = 30 phút Thu dịch trích Cô quay Cân khối lượng dầu 18/08/2015 - 3.2 Vi sóng Thiết bị: lò vi sóng, bơm tuần hoàn Dụng cụ: bình cầu cổ nhám, ống sinh hàn Nguyên liệu: ớt bột Dung môi: ethanol Phương pháp thực hiện: Ớt bột Cân VEtOH = 100ml m ớt = 5g Vi sóng time = phút công suất: chưa biết Thu dịch trích Cô quay - 3.3 Soxhlet Dụng cụ: hệ thống sohxlet, giá đỡ, bếp điện Nguyên liệu: ớt bột Dung môi: ethanol Phương pháp thực hiện: Cân khối lượng dầu Ớt bột Cân VEtOH = 100ml m ớt = 5g Sohxlet Thu dịch trích Cô quay Cân khối lượng dầu 18/08/2015 3.4 CO2 cao áp (chưa nắm rõ phương pháp thực hiện và đợ khả thi của phương pháp) Phân tích thành phần dầu ớt trích được từ phương pháp siêu âm và vi sóng: đo GC Phân tích tính chất sinh học của dầu ớt 5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa: đo DPPH - Thiết bị: bể siêu âm, máy đo UV – Vis - Dụng cụ: • Becher 50ml • Bình định mức: 100ml, 25ml, 10ml • Micropipette, đầu tuýp • Curvet nhựa - Nguyên liệu: dầu ớt trích được từ soxhlet, vi sóng và siêu âm (đo lần lượt từng - phương pháp) Hóa chất: DPPH, methanol Phương pháp thực hiện: • Chuẩn bị dung dịch DPPH mẹ DPPH Cân mDPPH = 0,01g V = 25ml VMetOH Định mức Siêu âm time = phút Dd DPPH• 400mg/L 18/08/2015 Lấy 1ml từ dung dịch DPPH• mẹ, định mức lên 10ml bằng dung môi MetOH thành dung dịch DPPH• 40mg/L, cho dung dịch vào cuvet, quét bước sóng DPPH• • Chuẩn bị dung dịch mẫu (dầu ớt) có nồng độ 200 mg/L: Dầu ớt Cân VMetOH mmẫu= 0,005g V = 25 ml Định mức Nồng đợ mẫu 100 mg/L Qt bước sóng • Chọn bước sóng đo: Chờng phở UV-VIS DPPH• và mẫu lên nhau, chọn bước sóng DPPH mà đó khơng có sự hiện diện mẫu • Lập phương trình đường chuẩn DPPH Từ dung dịch DPPH có nồng độ 400 mg/L pha thành dãy dung dịch DPPH có nồng độ sau: Thể tích dung dịch mẹ (ml) Định mức (ml) Nồng độ DPPH (mg/L) 0.125 10 0.25 10 10 0.375 10 15 0.5 10 20 0.625 10 25 0.75 10 30 0.875 10 35 10 40 1.5 10 60 18/08/2015 Đo độ hấp thu từng dung dịch DPPH có nồng độ trên, lập đường chuẩn (có dạng y = ax + b), kiểm tra R2 • Pha dung dịch mẫu cần đo: (sample) Nồng độ mẫu nên nằm giới hạn tuyến tính đường chuẩn DPPH vừa lập Lựa chọn nồng độ dung dịch mẫu lần lượt là: Nồng độ mẫu (mg/L) Thể tích mẫu (ml) Thể tích DPPH sử dụng (ml) Định mức (ml) Nồng độ DPPH sử dụng 20 0.25 10 40 0.25 10 60 0.25 10 400 mg/L 80 0.25 10 100 0.25 10 • Pha mẫu trắng (blank): mẫu trắng thực hiện tương tự mẫu sample, khơng thêm DPPH • Pha mẫu control (1 mẫu cho tất các lần đo): • Tính toán giá trị IC50 Với các mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, ta vẽ được một đường thẳng y = ax + b qua tất các điểm (trong đó y là % ức chế và x là nồng độ) Với mẫu không biến thiên tuyến tính rõ theo nồng độ, một cách gần đúng, ta chọn nồng độ có % ức chế và dưới 50%, tương tự lập phương trình đường thẳng Thay giá trị I% = 50 vào phương trình thu được, ta thu được giá trị x, đó chính là giá trị IC50 cần xác định Trong đó % ức chế hay % kháng oxy hóa mẫu có thể xác định theo công thức: I% = 5.2 Acontrol − Asample Acontrol ×100% Tính kháng khuẩn 18/08/2015 Trong phần này có thí nghiệm: thử độ nhạy vi khuẩn và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nếu mục đích là xác định xem dầu ớt có tính kháng khuẩn không, theo em làm thí nghiệm thử độ nhạy là đủ - 5.2.1 Thử độ nhạy của vi khuẩn phương pháp khuếch tán thạch Dụng cụ: đĩa petri, giấy làm đĩa kháng sinh, que cấy, đèn cồn Nguyên liệu: dầu ớt trích được từ soxhlet, vi sóng và siêu âm (mỗi nguyên liệu - trích được từ từng phương pháp đo riêng) Môi trường nuôi vi khuẩn: môi trường thạch dinh dưỡng (M122) Chủng vi khuẩn: E.coli, Bacillus Phương pháp thực hiện Chuẩn bị môi trường E.coli/ Bacillus M122 Cấy vi khuẩn Đặt khoanh giấy kháng sinh Sinh trưởng Time = 24h Đọc kết • Ch̉n bị mơi trường Cân chính xác lượng thạch cần sử dụng vì môi trường nghèo dinh dưỡng tạo vòng ức chế lớn và ngược lại Hòa tan lượng thạch vào nước cất trung tính, kiểm tra pH trước hấp diệt khuẩn Sau đó để nguội môi trường về 50 – 600C (pH khoảng 7,2 – 7,4) 18/08/2015 Lắc đều và đổ vào đĩa petri vô khuẩn với độ dày từ 3,5 – 4,5 mm (có nghĩa là 25 ml thạch cho một đĩa petri đường kính 90 mm 40ml thạch cho đĩa có đường kính là 110mm) Để đĩa môi trường nguội nhiệt độ phòng rồi bảo quản tủ lạnh – 80C Các đĩa thạch này dùng vòng ngày kể từ ngày chuẩn bị • Cấy vi khuẩn Ria cấy vi khuẩn: Sau vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5-10 khuẩn lạc, nghiền một ống nước muối sinh lý vô trùng lắc đều bằng máy votex, so sánh với ống đọ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá cho thêm nước muối sinh lý, ngược lại không đủ độ đục cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn dịch vi khuẩn tương đương 108 CFU/ml Dùng que tăm vô trùng nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn ép vào thành ống cho bớt nước, rồi ria đều khắp mặt thạch thành đường bắt chéo nhau, mặt thạch được để tủ ấm cho khô (nhưng không được quá 30 phút) *Độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 Độ đục này pha chế cách lấy 0,5 ml 0,048 M BaCl2 (1,175 % BaCl2.2H2O v/v) cộng với 99,5 ml 0,9 M H2SO4 (1% v/v) • Chuẩn bị khoanh giấy kháng sinh Khoanh giấy kháng sinh có đường kính khoảng mm Mỗi khoanh giấy thấm lượng nhất định kháng sinh (dầu + dung môi) Lưu ý làm khoanh giấy đối chứng thấm dung môi Đặt các khoanh giấy chọn lựa với từng vi khuẩn cho mặt khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài khoanh giấy cách thành đĩa khoảng 15mm và khoanh nọ cách khoanh 20mm Để đĩa thạch nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, rồi để môi trường tủ ấm 350C môi trường bên ngoài (gói kỹ, không để bị tạp nhiễm) 18/08/2015 • Đọc kết Dùng thước chia mm đo đường kính vùng ức chế, dựa vào tiêu chuẩn từng hãng sản xuất khoanh giấy kháng sinh, so sánh đường kính vòng ức chế đo được với giới hạn đường kính vòng ức chế cho từng loại kháng sinh, ta có mức độ nhạy cảm, trung gian và đề kháng từng loại vi khuẩn 5.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 5.3 Giá trị độ cay và cách tính giá trị của độ cay: đo bằng thí nghiệm cảm quan Làm giàu hàm lượng capsaicin ... của phương pháp) Phân tích thành phần dầu ớt trích được từ phương pháp siêu âm và vi sóng: đo GC Phân tích tính chất sinh học của dầu ớt 5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa: đo DPPH -... khuẩn và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nếu mục đích là xác định xem dầu ớt có tính kháng khuẩn không, theo em làm thí nghiệm thử độ nhạy là đủ - 5.2.1 Thử độ... cay và cách tính giá trị của độ cay: đo bằng thí nghiệm cảm quan Làm giàu hàm lượng capsaicin