PCR basic

Polymerase Chain Reaction Các vấn đề PCR gì? PCR thử nghiệm nhân đoạn DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Thử nghiệm thực ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi PCR mix) tích vào khoảng từ 10ml đến 50ml với thành phần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thường gọi Taq polymerase, có hoạt tính tối đa 72oC bền với nhiệt độ; (2) loại desoxyribonucleotide (dNTP) Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); (3) DNA chứa đoạn DNA đích nhân ống phản ứng; (4) đoạn mồi (primer) xuôi ngược đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 – 30 nucleotide có trình tự bổ sung cách đặc hiệu với trình tự đầu đoạn DNA nhân bản; (5) ion Mg++ muối MgCl2 nồng độ thích hợp, (6) dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng Khi ống nghiệm phản ứng cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt máy luân nhiệt (thermal cycler), mà thường gọi máy PCR, chương trình nhiệt độ máy làm cho nhiệt độ buồng ủ nhiệt máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ mà phản ứng nhân DNA xảy Nguyên tắc PCR Về mặt nguyên tắc, chu kỳ nhiệt độ Chu kỳ Chu kỳ o 94 C Biến tính bao gồm giai đoạn Chu kỳ nhiệt độ (hình 1): (1) o Đầu tiên nhiệt độ o 55 C-65 C Bắt cặp Chu kỳ đưa lên 94oC, nhiệt độ liên kết hydro mạch đôi DNA bị o 72 C Kéo dài đi, nhờ DNA đích bị biến tính thành mạch đơn; giai đoạn Hình 1: Nguyên tắc PCR nhân DNA đích qua chu kỳ nhiệt nhiệt độ gọi giai đoạn biến tính (2) Kế nhiệt độ hạ đến 55oC65oC nhiệt độ thích hợp để đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ gọi giai đoạn bắt cặp (3) Cuối cùng, nhiệt độ đưa lên 72oC nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme Taq polymerase để kéo dNTP lại đầu 3’ đoạn mồi bắt cặp đầu 5’ sợi DNA đích để bắt nguồn cho tổng hợp nên mạch bổ sung Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 đến 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tức đến hàng tỷ Lịc sử phát minh PCR Thử nghiệm PCR nhà khoa học người Mỹ tên Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Lúc Kary Mullis nhà hố sinh học tầm thường, làm việc phịng thí nghiệm không đại Ý tưởng phát minh đến đầu K Mullis cách tình cờ ông lái xe qua vùng đồi núi bắc California vào buổi chiều mà đầu miên man suy nghĩ cơng trình nhân ADN mà ơng làm phịng thí nghiệm, ông bị chạy lố đường nên phải lùi xe quay lối cũ Khi lùi xe vậy, ông thấy rõ hai bánh xe bị tách khỏi hai bánh xe cũ!! Hình ảnh làm loé sáng đầu ông ý tưởng dùng nhiệt độ để làm biến tính sợi đơi DNA thành hai mạch đơn Nhờ ơng phát minh thử nghiệm PCR Cơng trình nghiên cứu ơng gửi đến tờ Nature bị từ chối ban biên tập cho ông tác giả vô danh Do ông gửi đến tờ Scientific American ban biên tập tạp chí khoa học nhận diện phát minh lớn, họ đăng tải số báo (1985) Vol 253, 34-157 Chỉ thời gian ngắn sau đó, K Mullis tiếng giới khoa học thời thực ước mơ nhiều nhà khoa học thời nhân DNA ống nghiệm mà không cần phải nhờ đến tế bào chủ vi khuẩn hay nấm men, đồng thời mở nhiều triển vọng nghiên cứu ứng dụng Tám năm sau, phát minh đem lại cho tác giả giải Nobel hóa học (1993) Có thể nói lịch sử khoa học, có nhà khoa học có kỳ tích vậy: Đạt giải Nobel năm sau phát minh!! Mà thật kỳ tích xứng đáng, PCR cơng cụ cách mạng nghiên cứu ứng dụng y sinh học 10 chìa khóa kỹ thuật giúp hồn thiện PCR Cho đến ngày hơm nay, để trở thành công cụ thiếu nhiều phịng thí nghiệm y sinh học dùng nghiên cứu phịng thí nghiệm lâm sàng dùng chẩn đốn, có tiến kỹ thuật đóng góp vào làm cho kỹ thuật PCR nguyên thủy K Mullis phức tạp trở thành kỹ thuật PCR ngày đơn giản hiệu Ba tiến kỹ thuật là: Phát sản xuất enzyme polymerase chịu nhiệt Enzyme polymerase chịu nhiệt tách chiết từ vi khuẩn ❚ ✁r♠✂s aquaticus phân lập bùn đất suối nước nóng Hoa Kỳ, mà polymerase chịu nhiệt thường gọi Taq polymerase (Taq viết tắt từ Thermus aquaticus) dù ngày đa số có nguồn gốc từ vi khuẩn E coli hay vi khuẩn không chịu nhiệt khác tái tổ hợp di truyền với gene chịu trách nhiệm sản xuất polymerase chịu nhiệt Nhờ có polymerase chịu nhiệt mà người làm thí nghiệm khơng phải mở nắp tube phản ứng để bổ sung enzyme polymerase sau giai đoạn biến tính (94oC) chu kỳ nhiệt Cũng nhờ có enzyme polymerase chịu nhiệt mà người làm thí nghiệm có kết PCR đặc hiệu nhờ thực giai đoạn bắt cặp mồi sợi khuôn nhiệt độ bắt cặp tối hảo mồi thay phải ln ln để nhiệt độ bắt cặp mồi nhiệt độ kéo dài sợi bổ sung 37oC kỹ thuật PCR nguyên thủy K Mullis, phải dùng enzyme polymerase không chịu nhiệt tách chiết từ E coli Chế tạo máy luân nhiệt hoạt động hiệu Đó máy tạo chu kỳ nhiệt với buồng ủ nhiệt có nhiệt độ lên xuống xác đồng nhất, tốc độ gia giảm nhiệt cực nhanh theo chu kỳ Một chìa khóa kỹ thuật góp phần làm điều ứng dụng cơng nghệ Peltier chế tạo máy điều hịa nhiệt độ cho phi thuyền không gian Hoa Kỳ vào chế tạo buồng ủ nhiệt máy luân nhiệt (còn gọi máy chu kỳ nhiệt), mà hãng MJ research sở hữu chủ sáng chế Buồng ủ nhiệt máy luân nhiệt sử dụng hiệu ứng Peltier làm kim loại dẫn nhiệt cao, đặt thiết bị Peltier có cấu tạo hai mảnh kim loại đặc biệt đặt áp vào Hai mảnh kim loại thiết bị nối với hai cực nguồn điện điều chỉnh tự động để chiều dòng điện qua 11 Cảm ứng nhiệt (To sensor) Buồng ủ nhiệt Thiết bị Peltier Quạt giải nhiệt mảnh kim lọai thiết bị Peltier Nguồn điện Bộ vi xử lý Chu kỳ nhiệt Hình 2: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt Peltier thiết bị thay đổi theo chiều hay theo chiều ngược lại Chính đổi chiều dòng điện làm cho hai mảnh kim loại thiết bị Peltier bị nóng lên mặt lạnh mặt khác bị đảo ngược lại nhiệt độ, nghĩa mặt nóng bị lạnh mặt lạnh bị nóng lên Như vậy, chu kỳ nhiệt mà người sử dụng nhập vào vi sử lý máy sử dụng để điều khiển chiều cường độ dòng điện qua hai mảnh kim loại thiết bị Peltier, làm cho buồng ủ nhiệt lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt nhập vào ( 2) Hiện nay, đa số máy luân nhiệt sử dụng buồng ủ nhiệt kim loại hoạt động theo nguyên lý Peltier nhờ thiết kế máy ngày gọn nhẹ hơn, có nhiều chức hơn, kể chức gradient tức chức thực nhiệt độ bắt cặp mồi thay đổi cách tuyến tính theo hàng ngang hay theo hàng dọc buồng ủ nhiệt Ngoài ra, nhờ thiết kế buồng ủ nhiệt phù hợp sử dụng kim loại dẫn nhiệt thoát nhiệt nhanh để làm buồng ủ nhiệt nên máy luân nhiệt Peltier thực PCR với thời gian nhanh Một loại buồng ủ nhiệt khác hãng Idaho phát triển, buồng ủ khí Với loại buồng ủ này, ống nghiệm phản ứng treo quay ly tâm nhẹ liên tục buồng ủ với nhiệt độ buồng làm nóng lên nguội xuống nhờ quạt thổi khí nóng hay mát vào buồng ủ theo chu kỳ điều khiển từ vi xử lý nhận lệnh từ 12 Tube PCR Quạt thổi nhiệt vào Mâm đặt tube PCR ln quay trịn chạy máy Tube PCR Bộ cảm biến nhiệt Thiết bị sinh nhiệt Bộ vi xử lý Chu kỳ nhiệt Hình 3: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt khí chương trình nhiệt nhập vào máy ( 3) Ưu điểm máy PCR sử dụng buồng ủ khí thực PCR với giai đoạn nhiệt độ ngắn vài giây, đặc biệt PCR thực ống phản ứng mao quản (LightCycler Roche) Tuy nhiên loại buồng ủ khơng thể có chức gradient đưa nhiệt độ buồng ủ nhiệt xuống nhiệt độ lạnh muốn thực giữ lạnh ống phản ứng buồng ủ sau thực PCR Tìm phương pháp lọai trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại PCR nhạy cảm nhờ chất kỹ thuật khuếch đại DNA đích thành hàng tỷ sao, chất mà thách thức lớn việc ứng dụng PCR phịng thí nghiệm chẩn đoán chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại, gọi PCR carry-over Ngày hôm nay, thách thức nhà khoa học giải với giải pháp kỹ thuật hữu hiệu, giải pháp dùng enzyme UNG (Uracil-DNA glycosilase) Nguyên tắc giải pháp dùng PCR mix có thêm dUTP enzyme UNG từ bắt đầu sử dụng PCR chẩn đoán để sản phẩm PCR khuếch đại từ DNA đích đánh dấu khác biệt với DNA đích nhờ nhiều vị trí T trình tự chuỗi sản phẩm khuếch đại bị thay U enzyme polymerase nhầm lẫn T U thực khuếch đại Chính nhờ mà sản phẩm khuếch đại bị ngoại nhiễm vào PCR mix 13 40o C 10min Chạy PCR với PCR mix chứa dUTP UNG Chạy PCR với PCR mix chứa dUTP UNG Sản phẩm khuếch đại có T bị thay U Phân tử DNA đích ln có T Sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm có T bị thay U U sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm bị cắt bỏ UNG Phân tử DNA đích ln có T (1) Hình 4: Hình vẽ minh họa chế hoạt động chống ngoại nhiễm UNG (1) Nhờ sử dụng PCR mix có dUTP UNG mà sản phẩm khuếch đại đánh dấu khác biệt với DNA đích: nhiều vị trí T thay U (2) Nếu sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm vào PCR mix bị enzyme UNG phá hủy UNG nhận diện U cắt bỏ U nhờ trước chạy PCR ủ o PCR mix 40 C 10 phút nhiệt độ hoạt động o tối hảo UNG (3) Sau thời gian ủ 40 C/10 phút, PCR mix vào chu kỳ nhiệt PCR, sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm không tham gia vào trình khuếch đại bị nát vụn bị biến tính, đồng thời enzyme UNG bị bất hoạt giai đọan nhiệt độ biến tính PCR, sản phẩm khuếch đại từ DNA đích lại bị đánh dấu nhiều vị trí T bị thay U PCR mix ln có dUTP DNA đích khơng bị UNG phá khơng có U (2) Sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm bị phá huỷ giai đoạn biến tính nick 30X-40X 94oC/30s-1min 55-60oC/30s-1min 72oC/30s-1min PCR mix chứa dUTP and UNG nick Sản phẩm khuếch đại lại có T bị thay U DNA đích cịn nguyên vẹn tham gia giai đoạn PCR (3) UNG bị bất hoạt nhiệt độ biến tính khơng thể tham gia vào phản ứng khuếch đại bị enzyme UNG phá hủy trước thực PCR ( 4) Chính nhờ giải pháp chống ngoại nhiễm enzyme mà ngày hơm phịng thí nghiệm dễ dàng ứng dụng PCR chẩn đoán, cần thực hood làm việc chuyên biệt phịng thí nghiệm, khơng thiết phải thiết kế lại phịng thí nghiệm để có phịng chun biệt địi hỏi trước Có thể nói giải pháp chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại UNG tạo hội để phòng thí nghiệm lâm sàng quốc gia có thu nhập thấp thực ước mơ mà trước họ khơng nghĩ làm được, ứng dụng PCR chẩn đốn trị m i (primers) Mồi đoạn oligonucleotides dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổ sung với hai đầu đoạn DNA mà người làm thí nghiệm muốn nhân Mồi giữ vai trò định để polymerase tổng hợp sợi bổ sung để trượt sợi khuôn tổng hợp sợi bổ sung, polymerase phải nhận diện nucleotide đầu 3’ mồi bắt cặp 14 với nucleotide sợi khuôn ( 5) Nếu khơng có mồi hay nucleotide đầu 3’ mồi không bắt cặp với nucleotide sợi khn polymerase khơng nhận diện đầu 3’ mồi, trượt sợi khuôn để tổng hợp sợi bổ sung (hình 6) Do nói mồi đóng vai trị định tính đặc hiệu PCR để nhân đoạn DNA đặc hiệu Vd: Muốn chẩn đốn lao PCR phải thiết kế cho cặp mồi bắt cặp đoạn DNA đặc hiệu có gene DNA vi khuẩn lao mà khơng có vi khuẩn khác DNA từ thể vật chủ Để cho mồi bắt cặp cách hoàn toàn đặc hiệu sợi khn phải trì giai đoạn bắt cặp chu kỳ nhiệt nhiệt độ tối hảo cho bắt cặp mồi, gọi nhiệt độ bắt cặp (Ta), thường thấp nhiệt độ chảy (Tm) mồi khoảng 10oC Nhiệt độ chảy phụ thuộc nhiều vào chiều dài phụ thuộc vào tỷ lệ G C thành phần mồi, muốn mồi có Ta cao, phải thiết kế mồi cho có tỷ lệ G C cao Để thiết kế mồi, người làm thí nghiệm sử dụng phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi (ví dụ phần mềm Primer Premier 5.0) Phần mềm dị trình tự DNA đích đưa vào để tự động lựa chọn cặp mồi tối ưu theo thơng số mà người làm thí nghiệm mong muốn (ví dụ: chiều dài mồi, Ta mồi, chiều dài sản phẩm khuếch đại ) Trình tự DNA đích đưa vào trình tự gene đích Hình 5: Polymerase nhận diện nucleotide đầu 3’ mồi bắt cặp với nucleotide sợi khuôn nên trượt sợi khuôn để tổng họp sợi bổ sung Hình 6: Một nucleotide đầu 3’ mồi không bắt cặp với nucleotide sợi bồ sung polymerase khơng nhận diện nên trượt sợi khuôn để tổng họp sợi bổ sung 15 hay đoạn DNA đích tải từ ngân hàng liệu gene, hay từ kết nghiên cứu giải trình tự đoạn gene mà người làm thí nghiệm quan tâm Người làm thí nghiệm dùng phần mềm thiết kế mồi để tự dị trình tự DNA đích lựa chọn cặp mồi theo thơng số mà mong muốn, đặc biệt thông số nhiệt độ bắt cặp mồi chiều dài sản phẩm khuếch đại mà mong muốn Sau có trình tự cặp mồi, người làm thí nghiệm phải blast search với trình tự DNA có ngân hàng liệu gene NCBI để xác định trình tự mồi thiết kế đặc hiệu cao với DNA đích pha PCR mix Thể tích PCR mix = Thể tích phản ứng – Thể tích mẫu cho vào Ví dụ thể tích phản ứng muốn pha 50 ml thể tích mẫu cho vào 10 ml, thể tích PCR mix phải 40 ml Một PCR mix thông thường chứa thành phần liệt kê sau đây: § PCR buffer 1X pha từ PCR 10X (Tris HCl 100 mM KCl 500 mM) § MgCl2 từ 1.5 mM đến mM tùy thăm dò để xác định nồng độ tối ưu § Mồi xi mồi ngược từ 10 pm đến 50 pm cho thể tích phản ứng § ✄☎✆ polymerase từ 1.25 U đến 2.5 U tùy nhà sản xuất § dNTP với nồng độ 200 mM cho loại § Nếu muốn chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại thêm dUTP đạt nồng độ 200 mM UNG với hàm lượng 0.1 đến 1U cho thể tích phản ứng Để pha PCR mix, người làm thí nghiệm phải chuẩn bị tất thuốc thử dụng cụ cần thiết hood sạch, tốt clean bench, đặt phòng tách biệt với phòng làm xét nghiệm PCR Các dụng cụ sử dụng micropipette, đầu micropipette, tube, chai phải chuyên biệt khơng mang khỏi phịng đem từ phịng thí nghiệm khác vào Các thuốc thử phải giữ lạnh hay giữ đông tủ lạnh hay tủ đơng chun biệt phịng Phải dùng nước khử ion tuyệt đối đạt chất lượng 18.2 mega-Ohm khử trùng để pha PCR mix Phải dùng micropipette tuyệt đối xác để pha PCR mix micropipette phải lau cồn để khô clean bench trước sau dùng Nên sử dụng đầu micropipette có lọc sản xuất hãng có tiếng chất lượng 16 (như Eppendorf, Greiner, Axygen ) đầu micropipette không bị bám nước bên thành lấy thể tích dung dịch Trước tiến hành pha PCR mix, thuốc thử phải giữ giá giữ lạnh hay giá đặt hộp đựng đá bào Các thuốc thử cần phải rã đông để chúng tự rã đông đá bào hay giá lạnh Người làm thí nghiện khơng nên pha PCR mix phải lấy số thuốc thử với thể tích ml, khó xác Do vậy, nên pha master mix với tối thiểu hay 10 PCR mix Tính tốn để thể tích thuốc thử lấy khơng có số lẻ ml Nên lập bảng minh họa ả để tính tốn kiểm sốt khơng để thiếu thành phần cho vào để pha PCR master mix Bảng 1: STT Bảng thiết lập trước pha master mix cho 100 PCR mix với thể tích phản ứng 25 ml thể tích mẫu cho vào PCR mix ml Thành phần gốc PCR buffer 10X* MgCl2 Taq polymerase dNTP Nồng độ hay hàm Nồng độ hay hàm lượng Nồng độ hay hàm lượng Thể tích phải lấy lượng gốc thể tích pứ 100 thể tích phản ứng để pha master mix 10X 1X 1X 250ml 50mM 1.5mM 1.5mM 75ml** 5U/ml 1.25U 125U 25ml 25mM/each 200mM/each 200mM/each 20ml** Mồi xuôi 100pm/ml 10pm 1000pm 10ml Mồi ngược 100pm/ml 10pm 1000pm 10ml dUTP 100mM 200mM 200mM 5ml UNG 1U/ml 1U 100U 100ml Nước khử ion Cho đủ (qsp) 20ml Cho đủ (qsp) 2000ml 1505ml *Nếu PCR 10X cung cấp có sẵn MgCl2 15 mM khơng thêm MgCl2 vào nồng độ MgCl2 địi hỏi 1.5 mM Nhưng nồng độ MgCl2 đòi hỏi 1.5 mM phải thêm MgCl2 vào **Được tính tốn theo cơng thức CV = C’V’, với C nồng độ gốc, V thể tích gốc cần phải lấy, C’ nồng độ cần phải pha, V’ tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ 2500 ml, tổng thể tích 100 phản ứng, phản ứng 25 ml) Sau pha, giữ master mix đá bào, lấy PCR mix cho vào tube PCR để thực kiểm tra chất lượng PCR master mix pha xem có đạt độ nhạy mong muốn hay khơng (được trình bày phần kế tiếp) Nếu kết đạt, phân nhỏ PCR master mix pha thành thể tích PCR mix cho vào tube PCR đặt sẵn giá lạnh hay giá ngâm đá bào Sau phân thành PCR mix, đậy chặt nắp tube PCR lại giữ tủ đông -18oC đến -30oC (khơng nên giữ -70oC làm cho enzyme ✝✞✟ polymerase PCR mix bị hỏng) đưa vào sử dụng Thời gian giữ PCR mix tùy thuộc nhiều vào chất lượng 17 thuốc thử dùng để pha PCR master mix, kể chất lượng nước khử ion Do người làm thí nghiệm, muốn pha nhiều PCR mix để dùng dần, phải thường xuyên kiểm tra độ nhạy PCR mix để biết thời gian lưu trữ PCR pha Người làm thí nghiệm pha sẵn PCR master mix 2X (đậm đặc lần) chưa có mồi, MgCl2, dUTP UNG, phân nhỏ vào tube sạch, tube dùng để pha master mix 50 hay 100 PCR mix, giữ tủ đông -18oC đến -30oC để dùng dần Bả hướng dẫn pha PCR master mix 2X cho 2000 PCR mix ❇ả♥✠ 2: STT Bảng hướng dẫn cách pha PCR master mix 2X cho 2000 PCR mix với thể tích phản ứng 25 ml Thành phần gốc Nồng độ hay hàm Nồng độ hay hàm lượng Nồng độ hay hàm lượng Thể tích phải lấy lượng gốc thể tích pứ 2000 thể tích phản ứng để pha master mix PCR buffer 10X* 10X 2X 2X 5.000ml Taq polymerase 5U/ml 1.25U 125U 500ml dNTP 25mM/each 200mM/each 200mM/each 400ml** Nước khử ion Cho đủ (qsp) 12.5ml Cho đủ (qsp) 25.000ml 19.100ml *Nếu PCR 10X cung cấp có sẵn MgCl2 15mM PCR master mix 2X pha có sẵn mM **Được tính tốn theo cơng thức CV = C’V’, với C nồng độ gốc, V thể tích gốc cần phải lấy, C’ nồng độ cần phải pha, V’ tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ 25.000 ml, tổng thể tích 2000 phản ứng, phản ứng 12.5 ml) Bảng 3: STT Bảng thiết lập trước pha PCR master mix từ PCR master mix 2X để sau phân thành 100 PCR mix với thể tích phản ứng 25 ml thể tích mẫu cho vào PCR mix ml Thành phần gốc PCR master mix 2X* MgCl2 Nồng độ hay Nồng độ hay hàm lượng Nồng độ hay hàm lượng Thể tích phải lấy hàm lượng gốc thể tích pứ 100 thể tích phản ứng để pha master mix 2X 1X 1X 1250ml 50mM 1.5mM 1.5mM 75ml** Mồi xuôi 100pm/ml 10pm 1000pm 10ml Mồi ngược 100pm/ml 10pm 1000pm 10ml dUTP 100mM 200mM 200mM 5ml UNG 1U/ml 1U 100U 100ml Nước khử ion Cho đủ (qsp) 20ml Cho đủ (qsp) 2000ml 550ml *Nếu PCR master mix 2X cung cấp có sẵn MgCl2 mM khơng thêm MgCl2 vào nồng độ MgCl2 địi hỏi 1.5mM Nhưng nồng độ MgCl2 đòi hỏi 1.5 mM phải thêm MgCl2 vào **Được tính tốn theo cơng thức CV = C’V’, với C nồng độ gốc, V thể tích gốc cần phải lấy, C’ nồng độ cần phải pha, V’ tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ 2500 ml, tổng thể tích 100 phản ứng, phản ứng 25 ml) Bảng minh họa cách pha PCR master mix 1X từ PCR master mix 2X pha sẵn (nếu không muốn tự pha, mua từ nhà sản xuất có uy tín) Người làm thí nghiệm pha PCR mix để sử dụng cách thêm mồi, MgCl2, dUTP, UNG bổ sung thêm nước khử ion vào 18 ể tra nhạy PCR mix pha Để kiểm tra độ nhạy PCR mix pha, trước hết người làm thí nghiệm phải có dung dịch DNA đích biết sẵn số copies Dung dịch DNA đích chuẩn bị phịng thí nghiệm cách tách chiết toàn genomic DNA tác nhân đích (vi khuẩn hay virus) biết số lượng, dung dịch chứng [+] plasmid DNA chèn DNA đích Với dung dịch genomic DNA tác nhân đích tùy thuộc vào số copies đoạn DNA đích diện genomic DNA mà biết tác nhân đích mang hay nhiều copies DNA đích (ví dụ với PCR mix phát M tuberculosis, DNA đích đoạn chèn IS 6110 vi khuẩn hay genomic DNA mang đến 16-25 copies IS 6110; DNA đích 16s rDNA genomic DNA mang copy, vi khuẩn tách chiết copy DNA đích), nhờ mà tính số copies DNA đích có dung dịch genomic DNA tách chiết từ huyền dịch chứa số lượng tế bào tác nhân đích biết Với dung dịch chứng [+] plasmid DNA chứa đoạn chèn DNA đích, tính số copies plasmid DNA có dung dịch từ lượng C ng plasmid DNA Cách tính sau: § mole cặp base đoạn DNA có khối lượng # 650gr, plasmid dài L base (kể đoạn DNA chèn vào) có khối lượng (650 x L) gr hay (650 x 109 x L) ng § Theo định luật Avogadro, mole có (6.022 x 1023) phân tử (hay số copies plasmid) § Do dung dịch plasmid DNA có nồng độ C ng/ml số copies plasmid DNA có dung dịch là: N (copies/ml) = (6.022 x 1023) x C / (650 x 109 x L) copies/ml Để kiểm tra độ nhạy PCR mix, người làm thí nghiệm pha lỗng liên tiếp dung dịch DNA đích biết số copies dung dịch TE 1X để đạt nồng độ DNA đích 1000, 100, 10, 1/10 copies thể tích cho vào PCR mix Cho nồng độ DNA đích pha lỗng vào PCR mix Phải dùng PCR mix làm chứng [-] dung dịch cho vào PCR mix TE 1X Cho tất PCR mix chuẩn bị xong vào buồng ủ nhiệt máy ln nhiệt Chạy chương trình ln nhiệt thích hợp Độ nhạy PCR mix xác định số lượng copies DNA đích thấp cho vào ống phản ứng mà cho sản phẩm khuếch đại mong muốn 19 thấy điện di Độ nhạy PCR mix gọi LOD (giới hạn phát hiện: Limit Of Detection) PCR mix Để dùng chẩn đốn PCR mix phát tác nhân vi sinh gây bệnh nhiễm trùng phải đạt LOD = copies DNA đích cho vào ống phản ứng Nếu không đạt độ nhạy khơng nên sử dụng PCR mix pha vào xét nghiệm PCR chẩn đốn cần giảm độ nhạy độ pha loãng làm cho xét nghiệm PCR giảm độ nhạy gấp 10 lần cho dù khâu khác xét nghiệm có độ nhạy cao Hình hai kết kiểm tra độ nhạy PCR mix công ty Nam Khoa sản xuất để phát HBV (đọc kết điện di thạch) M tuberculosis (đọc kết điện di chip) ❍ì✡☛ 7: Kết kiểm tra chất lượng PCR mix phát HBV (HBV-PCR mix, bên trái) đọc điện di agarose PCR mix phát M tuberculosis (MTB-PCR mix, bên phải) đọc diện di chip bio-analyzer Agilent Khi làm kiểm tra chất lượng, luôn so sánh PCR mix sản xuất với PCR mix sản xuất dùng để xem chất lượng có tương đương khơng DNA đích để kiểm tra chất lượng HBV-PCR mix dung dịch plasmid DNA biết rõ số copies pha loãng liên tiếp giếng số giếng chứa copy (plasmid DNA, tức tương đương copy DNA đích) thể thích 10 ml cho vào PCR mix DNA đích để kiểm tra chất lượng MTB-PCR mix dung dịch genomic DNA biết rõ số copies pha loãng liên tiếp giếng số giếng chứa fg (tương đương khồi lượng genomic DNA, chứa 16-25 copies IS6110) thể thích 10 ml cho vào PCR mix Kết cho thấy HBV-PCR mix đạt độ nhạy phát copy DNA đích (giếng số 4, vạch điện di kích thước 259 bps), MTB-PCR mix đạt độ nhạy copy DNA đích (giếng số 5, vạch điện di kích thước 249 bps) Trong hai kết kiểm tra chất lượng này, thấy có diện vạch điện di kích thước 190 bps, sản phẩm khuếch đại chứng nội sử dụng chung mồi với DNA đích để chứng minh PCR mix đạt chất lượng dù có khuếch đại chứng nội Các PCR th ng đ c sử dụng chẩn đoán phát tác nhân nhiễm trùng Tùy vào cách thiết kế để đạt độ nhạy độ đặc hiệu mà nhà nghiên cứu hay người làm thí nghiệm sử dụng nhiều loại PCR khác để áp dụng chẩn đoán phát tác nhân gây nhiễm trùng Xin nêu sau số thường sử dụng phịng thí nghiệm hay kit thương mại 20 PCR đơn m i (monoplex PCR) Chính PCR kinh điển sử dụng có cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn DNA đích đặc hiệu từ vi sinh vật muốn phát Ví dụ PCR phát Mồi F Mồi R PCR HBV sử dụng cặp mồi đặc hiệu đoạn DNA gene S virus viêm gan B Hình theo minh họa nguyên tắc ✎✏✑✒ 8: Minh họa nguyên tắc PCR đơn mồi PCR đơn mồi PCR đa m i (multiplex PCR) Là PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích đặc hiệu từ nhiều vi sinh vật muốn phát đồng thời Để thiết kế Multiplex PCR quan trọng phải thiết kế mồi có nhiệt độ bắt cặp (Ta) lên DNA đích, đồng thời mồi không bắt cặp với nhau, quan trọng độ nhạy phát tác nhân đích khơng bị giảm mà tương đương độ nhạy PCR đơn mồi Tuy nhiên khó để đạt điều kiện vậy, muốn phát tác nhân vi sinh trực tiếp bệnh phẩm Do vậy, PCR đa mồi phát t☞✌✍ tác nhân vi sinh áp dụng để phát nhiều tác nhân vi sinh lúc môi trường nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn từ thực phẩm lượng DNA vi khuẩn đích có mặt diện nhiều mơi trường tăng sinh Hình minh họa nguyên tắc PCR đa mồi DNA đích tác nhân vi sinh A Mồi FA DNA đích tác nhân vi sinh B Mồi FB Mồi R A PCR Mồi RB PCR Hình 9: Minh họa nguyên tắc PCR đa mồi phát hai tác nhân vi sinh lúc PCR tổ (nested PCR) Là PCR có hai giai đoạn: giai đoạn đầu PCR dùng cặp mồi ngồi (gọi PCR vịng ngồi) để khuếch đại đoạn DNA có chứa trình tự đặc hiệu muốn tìm, sau dùng sản phẩm PCR vịng ngồi làm khn cho vào ống PCR có cặp mồi (gọi PCR vịng trong) để khuếch đại trình tự đặc hiệu muốn tìm 21 ( 10-1) Ngồi nested PCR, cịn có semi-nested hay hemi-nested PCR biến thể nested PCR với mồi vịng ngồi dùng làm hai mồi cặp mồi vịng (hình 10-2) Ưu điểm nested PCR (và semi-nested hay hemi-nested PCR) làm tăng độ nhạy PCR mà mồi cho trình tự đặc hiệu muốn tìm có độ nhạy thấp (như trường hợp phải dùng mồi có degenerative base) Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp nguy ngoại nhiễm cao phải mở tube PCR vịng sản phẩm PCR vịng ngồi vào DNA đích DNA đích Mồi Fout Mồi Rout Mồi Fout Mồi Rout PCR vịng ngồi PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Mồi Fin Mồi Rin Mồi Fout PCR vòng Mồi Rin PCR vòng (1) (2) Sản phẩm PCR vòng Sản phẩm PCR vịng Hình 10: Minh họa ngun tắc (1) nested PCR (2) semi-nested/hemi-nested PCR PCR tổ không dừng (non-stop nested PCR) Là PCR tổ thiết kế để hai giai đoạn PCR vòng ngồi PCR vịng thực tube PCR nhờ mà sau hoàn tất PCR vịng ngồi chạy tiếp chương trình PCR vịng khơng cần dừng lại nhờ sản phẩm khuếch đại PCR vịng ngồi trở thành gốc cho PCR vòng trong tube phản ứng (hình 11) Để làm non-stop nested PCR, nhà nghiên cứu phải thiết kế mồi vịng ngồi DNA đích Mồi Fout PCR vịng ngồi cho có nhiệt độ bắt cặp cao C đến 10oC so với mồi vòng để chạy o Sản phẩm PCR vịng ngồi Mồi Fin PCR vịng ngồi với nhiệt độ bắt cặp thích Mồi Rin PCR vịng o Ta vịng < Ta vịng ngồi 8-10 C hợp cho PCR vịng ngồi khơng có bắt cặp mồi PCR vịng lên DNA đích; 22 hàm lượng < Mồi Rin Ta vịng ngồi > Ta vịng 8-10 C o đồng thời nhà nghiên cứu phải tối ưu Mồi Rout hàm lượng < Mồi Fin Sản phẩm PCR vòng ✓✔✕✖ 11: Minh họa nguyên tắc non-stop nested PCR cho tỷ lệ mồi vòng ngồi so với mồi vịng cho sau chạy PCR vịng khơng cịn mồi vịng ngồi để tiếp tục bắt cặp lên DNA đích Ưu điểm non-stop nested PCR vừa có độ nhạy cao, vừa tránh nguy ngoại nhiễm mà nested PCR phải gặp phải mở nắp tube PCR vịng sản phẩm PCR vịng ngồi vào, đồng thời áp dụng phương pháp chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại cách thêm dUTP UNG vào PCR mix (phương pháp áp dụng cho nested PCR) Touch-down PCR Là PCR có chương trình ln nhiệt có nhiệt độ bắt cặp giảm dần 10 hay 20 chu kỳ đầu, sau chu kỳ giảm 0.5oC đến 1oC, hay qua đến bước giảm nhiệt độ với bước giảm 5oC, để đạt đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp mồi Trong 10-20 chu kỳ có nhiệt độ bắt cặp giảm dần này, chương trình luân nhiệt có hai bước nhiệt độ biến tính bắt cặp khơng có bước kéo dài Hai sơ đồ sau minh họa chương trình luân nhiệt cho Touch-down PCR có nhiệt độ bắt cặp giảm dần (sơ 1) hay giảm bước (sơ 2) đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp mồi: 20 chu kỳ 35 chu kỳ o o 94 C/15 giây o 55 C/30 giây 94 C/15 giây chu kỳ o 72 C/7 phút o 65 C/15 giây o giảm 0.5 C sau chu kỳ o 72 C/1 phút ❙ơ đồ 1: Một ví dụ minh họa chương trình ln nhiệt Touch-down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm dần 10 chu kỳ 10 chu kỳ o 94 C/15 giây o 60 C/15 giây 94 C/15 giây 65 C/15 giây 35 chu kỳ o 94 C/15 giây o o 55 C/30 giây chu kỳ o 72 C/7 phút o o 72 C/1 phút Sơ đồ 2: Một ví dụ minh họa chương trình luân nhiệt Touch-down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm bước Touch-down PCR thường nhà nghiên cứu sử dụng để làm tăng độ đặc hiệu mồi bắt cặp vào DNA đích Lý nhờ nhiệt độ bắt cặp hạ xuống dần làm cho mồi đưa dần đến vị trí bổ sung với mạch khn DNA đích, tránh tượng mồi bắt cặp vào vị trí khơng đặc hiệu Chúng tơi thường sử dụng touch-down PCR PCR cho nhiều sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu biểu điện di thấy nhiều vạch phụ mà giải pháp điều chỉnh khác không giải 23 RT-PCR Là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát RNA Để thực PCR trước hết RNA đích phải phiên mã ngược (RT, reverse transcription) thành cDNA, sau dùng PCR để khuếch đại trình tự đích cDNA cặp mồi đặc hiệu cho trình tự Vì phải thực hai giai đoạn RT đến PCR, nên kỹ thuật gọi kỹ thuật RT-PCR Giai đoạn phiên mã ngược (RT) giai đoạn quan trọng định thành công RT-PCR Enzyme sử dụng giai đoạn Reverse transcriptase tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu chuột, hay từ Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy gia cầm Enzyme reverse transcriptase loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA), giai đoạn RT gọi giai đoạn tổng hợp cDNA Để enzyme reverse RNA transcriptase tổng hợp RT cDNA từ sợi khn cDNA mạch đơn RNA, cần phải có PCR mồi đặc hiệu bám lên sợi khuôn RNA cần dNTP để enzyme reverse trancriptase trượt Sản phẩm PCR ✘✙nh 12: RT-PCR với giai đọan RT dùng mồi đặc hiệu mạch khn RNA kéo RNA dài mạch cDNA RT Mồi sử dụng cDNA giai đoạn RT ✗ồi đặc hiệu cho trình tự RNA PCR phiên mã ngược thành Sản phẩm PCR cDNA (hình 12), mồi mồi xi hay mồi Hình 13: RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi ngẫu nhiên 24 ngược giai đoạn PCR tùy chiều 5’ đến 3’ RNA đích bắt cặp mồi Nhà nghiên cứu sử dụng loại mồi có nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên gọi ✚ồ✐ ngẫu nhiên (random hexamer) để phiên mã ngược tồn RNA có mẫu thành cDNA ( 13) Tuy nhiên mồi ngẫu nhiên có hiệu để phiên mã ngược đoạn cDNA dài 600 bases, cịn muốn có đoạn cDNA dài 600bps phải dùng mồi đặc hiệu hiệu Ngoài mồi đặc hiệu mồi ngẫu nhiên, muốn có cDNA mRNA biểu từ gene, nhà nghiên cứu dùng mồi Oligo(dT)15 (gọi mồi poly T) mRNA ln có poly(A)+ Mồi Oligo(dT)15 thường dùng để làm thư viện cDNA biểu gene dùng để phát vi khuẩn sống bệnh phẩm (ví dụ phát vi khuẩn lao sống mẫu đàm) Đối tượng RT RNA đích Bản chất RNA dễ bị phân hủy môi trường bị enzyme RNAse tiết từ vi sinh vật môi trường, chai lọ, thiết bị, dụng cụ dung dịch Enzyme RNAse lại bền, khó hủy nhiệt độ Do thao tác pha chế thuốc thử để pha phản ứng RT phải tuyệt đối tôn trọng nguyên tắc vô trùng thực với dụng cụ, thiết bị, thuốc thử tinh Để pha dung dịch RT, phải chuẩn bị đầy đủ điều kiện cách pha PCR mix Tùy thuộc vào enzyme reverse transcriptase loại nào, hãng sản xuất mà pha dung dịch phản ứng RT Dưới ví dụ minh họa thành phần phản ứng RT thể tích 20 ml: § MgCl2 5mM § Reverse Transcription Buffer (10mM Tris-HCl [pH 9.0 at 25°C], 50mM KCl, 0.1% Triton X-100) 1X Đ dNTP/each 1mM Đ Recombinant RNasinđ Ribonuclease Inhibitor (RNAsin) 1U/μl § AMV Reverse Transcriptase (High Conc.) 15U/μg RNA § Mồi đặc hiệu 15pm – 100pm (nếu dùng mồi ngẫu nhiên hay mồi poly T cho 0.5μg/μg RNA phiên mã) § Thể tích nước khử ion (đã xử lý DEPC) cho vào đến 15ml (để thể tích mẫu chứa RNA phiên mã thành cDNA cho vào 5ml) 25 RNA Dung dịch RT sau pha xong nên sử dụng cách 25oC cho mẫu chứa RNA đích vào Sau đó, cDNA ống nghiệm phản ứng giữ 42oC nhiệt độ 42oC 10-15 phút để cDNA RNAse H mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA enzyme reverse transcriptase tổng 42oC hợp cDNA Nếu dùng mồi ngẫu RNAse H nhiên trước ủ 42oC, nên để 85oC ống nghiệm phản ứng nhiệt độ RNAse H phịng thí nghiệm 10 phút để mồi bắt cặp vào sợi RNA khuôn Nếu ✛✜nh 14: cDNA Nguyên tắc hoạt động thuốc thử tổng hợp cDNA công ty Nam Khoa sản xuất dùng mồi đặc hiệu thời gian ủ 42oC kéo dài đến 60 phút Sau hoàn tất tổng hợp cDNA 42oC, enzyme reverse transcriptase phải bị hủy cách đưa ống nghiệm phản ứng lên 85oC vòng phút Sản phẩm cDNA sẵn sàng đưa vào khuếch đại PCR với cặp mồi đặc hiệu Nếu chưa thực PCR giữ sản phẩm cDNA tủ đơng Công ty Nam Khoa nghiên cứu sản xuất thuốc thử sẵn sàng sử dụng để tổng hợp cDNA Sản phẩm ống nghiệm PCR chứa sẵn thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA Người sử dụng cần cho vào ống nghiệm thể tích tách chiết RNA từ mẫu thử tiến hành ủ ống nghiệm qua giai đoạn nhiệt độ thời gian theo hướng dẫn có sản phẩm cDNA để thực bước PCR Nguyên tắc thuốc thử tổng hợp cDNA sử dụng mồi ngẫu nhiên mồi Oligo(dT)15 để tổng hợp toàn RNA từ mẫu thử thành cDNA từ RNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase Ngồi hệ thống phản ứng cịn có enzyme RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp vào cDNA sau phiên mã ngược thành cDNA Thành ph✵n thuốc thử ống nghiệm PCR 0.2 chứa ống 3ml RT mix bao gồm đủ hóa chất thuốc thử cần thiết cho phản ứng tổng hợp cDNA theo nguyên tắc nêu Các ống nghiệm phản ứng giữ nhiệt độ từ -18oC đến -30oC Phương pháp thực tổng hợp cDNA là: người làm thí nghiệm cần cho ml dịch tách chiết RNA mẫu thử (hay bệnh phẩm) vào ống nghiệm 26 phản ứng, pipette lên xuống nhẹ nhàng vài lần để trộn Sau đặt ống nghiệm vào máy luân nhiệt để chạy chương trình luân nhiệt 25oC phút để mồi ngẫu nhiên bắt cặp vào RNA đích, 42oC 30 phút để enzyme reverse transcriptase tổng hợp cDNA đồng thời RNAseH cắt bỏ RNA đích khỏi cDNA, cuối ủ 85oC phút để phá hủy enzyme reverse transcriptase enzyme RNAse H sau chúng hoàn tất nhiệm vụ 14 minh họa nguyên tắc hoạt động thuốc thử tổng hợp cDNA Có hai phương pháp thực RT-PCR Đó phương pháp RT-PCR hai bước, phương pháp RT-PCR bước Trong ♣✢ươ✣✤ pháp RT-PCR hai bước, người làm thí nghiệm thực giai đoạn RT để tổng hợp cDNA ống nghiệm, sau lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phương pháp có nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại phải mở nắp tube PCR sản phẩm cDNA giai đoạn RT vào Tuy nhiên ngày nguy hoàn toàn bị loại bỏ nhờ việc cho dUTP UNG vào PCR mix giai đoạn PCR Trong phương pháp RT-PCR m✺t bước, người làm thí nghiệm thực hai giai đoạn RT giai đoạn PCR ống phản ứng, nghĩa sau cho tách chiết RNA từ mẫu thử vào ống phản ứng, giai đoạn RT thực trước sau giai đoạn PCR liền theo sau Để thực RT-PCR bước, ống phản ứng phải có đủ thành phần hóa chất thuốc thử để chạy RT PCR, tức phải có enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT enzyme Taq polymerase sử dụng cho PCR Ngồi có loại DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn chịu nhiệt Themus thermophilus, đặt tên TthPol, có hai khả năng: thực phiên mã ngược có diện Mn++ khả nhân DNA có diện Mg++, dùng enzyme làm RT-PCR bước Trong phương pháp RT-PCR bước, toàn sản phẩm cDNA tham gia vào PCR không thiết phải có mồi riêng cho RT mồi PCR sử dụng làm mồi cho RT RT-PCR bước nhiều người thích RT-PCR hai bước tiện lợi tránh nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại phải mở tube PCR sản phẩm cDNA vào Tuy nhiên RT-PCR bước, sử 27 dụng phương pháp chống ngoại nhiễm cách cho dUTP enzyme UNG vào dung dịch phản ứng UNG cắt bỏ toàn cDNA tổng hợp giai đoạn RT dụ c PCR cơng nghệ gene Nói cách tóm tắt, cơng nghệ gene cơng nghệ sản xuất protein mong muốn từ gene chèn vector (plasmid, phage hay virus) để chuyển thể tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn, vi nấm hay tế bào có nhân sử dụng tế bào tái tổ hợp để làm nhà máy sinh học sản xuất protein mong muốn Trong công nghệ sinh học phân tử, chìa khóa kỹ thuật phải làm cô lập gene mong muốn Đối với gene khơng có intron nhà nghiên cứu lập gene từ DNA gene tách chiết từ tế bào đích Đối với gene có intron gene phải lập từ cDNA phiên mã ngược từ mRNA tách chiết từ tế bào có biểu tính trạng từ gene hay có hoạt động chức đặc trưng cho gene Trước có PCR, việc lập gene mong muốn từ DNA gene công phu Các nhà nghiên cứu phải tách chiết DNA gene phải nguyên vẹn lượng lớn tế bào đích dùng enzyme cắt hạn chế để cắt nhỏ DNA gene thành đoạn có kích thước khác biệt Sau điện di agarose để tách biệt đoạn DNA theo Gene mong muốn kích thước trãi dài tồn Cắt với RE Bộ gene chiều dài Các mãnh DNA gel điện di Dùng Điện di phương Chuyển lên màng pháp thấm mao quản hay thấm qua Lai với dị đặc hiệu hút chân khơng để chuyển toàn vạch DNA gel Phát ✥✦nh 15: Kỹ thuật Southern bloting lai dị đánh dấu để biết vị trí đọan DNA trình tự đặc hiệu gene mong muốn 28 điện di qua màng nylon (gọi kỹ thuật Southern bloting) Dùng cách đoạn dò đặc hiệu gene muốn tìm đánh dấu enzyme hay đồng vị phóng xạ phủ màng nylon để lai tìm vị trí đoạn DNA có mang trình tự đặc hiệu gene ( 15) Từ vị trí xác định màng lai này, cắt mảnh gel điện di (được thực song song với gel dùng Southern bloting) vị trí xác định màng, có hy vọng bắt đoạn DNA chứa gene mong muốn Tuy nhiên để có trọn vẹn gene mong muốn, nhà nghiên cứu phải thực kỹ thuật nhiều lần, không DNA gene cắt enzyme cắt hạn chế mà phải thử nhiều enzyme cắt hạn chế, không DNA gene mà đoạn DNA từ vị trí gel xác định có mang trình tự đặc hiệu gene Và cịn phải kết hợp với nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác Cơng trình có kéo dài hàng chục năm thành công Nếu muốn cô lập gene mong muốn từ mRNA, nhà nghiên cứu phải tách chiết thành công mRNA từ lượng lớn tế bào có biểu gene, thực phiên mã ngược mRNA tách chiết thành cDNA với mồi Oligo(dT)15, sau chèn vào vector với điều kiện thật tối ưu để vector nhận cDNA, cuối chuyển thể vào tế bào vi khuẩn để lập thư viện cDNA điều kiện tối ưu cho vi khuẩn tái tổ hợp nhận vector mà Từ thư viện cDNA này, chọn lọc để biết tế bào vi khuẩn mang cDNA gene mong muốn Với phát minh kỹ thuật PCR tiến làm cho PCR ngày trở thành công cụ dễ dàng thực phịng thí nghiệm việc lập gene mong muốn trở thành dễ dàng Để có trọn vẹn gene mong muốn từ DNA gene, nhà nghiên cứu cần thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho trình tự hai đầu đoạn gene DNA gene, cần tách chiết €CR lượng nhỏ DNA N = nx109 gene, không cần phải nguyên vẹn, từ lượng nhỏ tế bào hay mơ đích, thực PCR, ✧★nh 16: có gene mong muốn với số lượng hàng tỷ 29 Với PCR, dễ dàng để có hàng tỷ gene mong muốn nhờ khuếch đại trình tự gene từ lượng nhỏ DNA gene với cặp mồi đặc hiệu cho trình tự hai đầu gene ( 16) Cũng vậy, để có gene mong muốn từ mRNA, nhà nghiên cứu cần tách chiết mRNA từ lượng nhỏ tế bào hay mơ đích có biểu gene thực RT-PCR với mồi đặc hiệu cho trình tự hai đầu đoạn gene, có hàng tỷ gene mong muốn (hình 17) Thậm chí khơng có tế bào hay mơ đích, nhà nghiên cứu dùng PCR để khuếch đại gen mong muốn từ đoạn oligo ngắn đặt tổng hợp cho chúng có trình tự bổ sung phần lên đầu để dùng chúng làm mồi cho nhau, kết hợp với mồi đặc hiệu cho đoạn tổng hợp (hình 18) mRNA mRNA RT mồi Oligo (dT)15 RT mồi đặc hiệu cDNA cDNA PCR mồi đặc hiệu đầu gene ✩✪nh 17: PCR mồi đặc hiệu đầu gene Phương pháp cô lập gene mong muốn từ mRNA với giai đoạn RT dùng mồi Oligo(dT)15 hay dùng hai mồi đặc hiệu cho hai đầu đoạn gene giai đoạn PCR Oligo A Oligo A PCR Sản phẩm AB Oligo C PCR Sản phẩm ABC Oligo D PCR Gene mong muốn Hình 18: Phương pháp tổng hợp gene mong muốn từ đọan oligo ngắn hợp dài khoảng 80-100 bps Như vậy, nhờ cơng cụ PCR mà giai đoạn khó khăn cơng nghệ gene, có tay gene mong muốn, thực dễ dàng với thời gian ngắn vài ngày, thay phải cần nhiều năm trước có cơng cụ PCR Chính nhờ vậy, cơng nghệ gene có nhiều tiến đáng kể qua sản phẩm protein sản xuất đưa vào sử dụng y học, dược phẩm, nông nghiệp, thủy sản môi trường Chúng tơi trình bày 30 chi tiết công nghệ sách “ ườ dụ ỹ ậ ọc ọc” sớm xuất sau sách PCR pháp y Hiện nay, PCR công cụ hiệu giám định pháp y để xác định tơng tích nạn nhân qua di thể để lại, truy tầm xác định thủ phạm qua dấu vết sinh học để lại trường hay nạn nhân, xác định quan hệ huyết thống qua xác định dấu vân tay DNA cá nhân mối liên hệ huyết thống dấu vân tay DNA này, cuối xác định hài cốt lâu năm thuộc gia đình có người thân bị tích Cơ sở việc ứng dụng nhờ có PCR mà dấu vết DNA muốn tìm mẫu khuếch đại phân tích Các dấu vết DNA thường đoạn lặp lặp lại ngắn (short tandem repeat, STR) diện DNA gene cá thể di truyền theo định luật Mendel qua hệ, trình tự vịng D ty thể di truyền theo bên ngoại cá nhân Chúng trình bày nội dung “ dấ DNA” sách PCR chẩn đoán sàng lọc bệnh lý di truy n Có thể nói PCR công cụ hữu hiệu phát sàng lọc bệnh lý di truyền biến đổi gene mức độ phân tử mà phương tiện di truyền tế bào phát Khơng vậy, PCR cịn công cụ hữu hiệu để sàng lọc trước sanh bệnh lý di truyền qua phát biến đổi gene mức độ phân tử mặt cấu trúc, ví dụ Thalassemia, Duchene hay số lượng bệnh lý tam thể 13, 18, 21 mẫu tế bào lấy từ gai nhau, từ dịch ối sản phụ thời kỳ sớm thai kỳ để giúp nhà điều trị có biện pháp can thiệp chấm dứt thai kỳ sớm nhờ mà gia đình khơng phải chịu gánh nặng phải sinh đứa bị bệnh lý di truyền Ngồi ra, PCR cịn dùng để phát cá nhân khỏe mạnh mang gene tiềm ẩn bệnh di truyền, ví dụ bệnh Thalassemia, Duchene để có tham vấn tiền nhân hay trước sanh, nhờ mà làm giảm hay loại trừ bệnh lý di truyền quần thể, giảm gánh nặng xã hội phải đối phó với bệnh lý di truyền Chúng tơi trình bày chi tiết cơng cụ sách “Các kỹ thuật sinh học phân tử thường áp dụng nghiên cứu y sinh học” sớm xuất sau sách 31 PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng Nguyên tắc PCR khuếch đại đoạn DNA đích ống nghiệm phản ứng để sau phát chúng, PCR trở thành cơng cụ chẩn đốn nhạy cảm nhất, chưa có thử nghiệm sánh kịp, để phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay vi sinh vật phát xét nghiệm khác) bệnh phẩm khác Chúng tơi trình bày chi tiết vấn đề “K ệ ể PCR/real-time d PCR s kỹ thuật sinh học phân tử khác nghiên cứu chẩn đốn” PCR địn bẩy thúc đẩy nhanh cơng nghệ giải trình tự Có thể nói khơng sai khơng có ứng dụng cơng cụ PCR kỹ thuật giải trình tự gen nhà khoa học khơng thể hồn tất cơng trình giải mã gen người sớm dự định 10 năm, từ kết cơng trình này, nhiều cánh cửa y sinh học mở với ứng dụng đầy triển vọng công nghệ dược phẩm protein, sinh-tin học (bio-informatic), chẩn đoán bệnh gen-chip Lý để nói PCR địn bẩy để thúc đẩy nhanh cơng nghệ giải trình nhờ có PCR mà nhà khoa học thay đổi phản ứng giải trình tự phương pháp giải trình tự enzyme Sanger thành phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự với hiệu phản ứng tốt nhiều nhạy nhiều Ngoài ra, nhờ có PCR mà sản phẩm cần giải trình tự nhân thành nhiều DNA/RNA gene virus có bệnh phẩm PCR khuếch đại đọan DNA ngắn DNA hay RNA gen virus trực tiếp bệnh phẩm Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR so chuỗi để tìm trình tự trùng lắp đầu Nối trình tự với để có trình tự hồn chỉnh DNA/RNA gene virus có mẫu ✫✬nh 19: Nguyên tắc giải trình tự trực tiếp DNA/RNA gene virus gây bệnh có bệnh phẩm mà khơng cần phải nuôi cấy phân lập virus cấy tế bào 32 đồng chiều dài trình tự, mà có kết giải trình tự xác Với PCR kết hợp với giải trình tự, nhà nghiên cứu giải trình tự trọn vẹn DNA hay RNA gene virus gây bệnh có mẫu thử mà khơng cần phải nuôi cấy virus vào tế bào cách thiết kế mồi đặc hiệu cho đoạn gene mà đoạn có trình tự hai đầu trùng lắp nhau, dùng PCR để khuếch đại đoạn DNA lên Giải trình tự sản phẩm PCR này, cuối so chuỗi để tìm trình tự trùng lắp làm sở để lắp ghép nối đoạn trình tự giải với thành trình tự DNA gene hồn chỉnh (hình 19) Chúng tơi trình bày chi tiết cơng nghệ PCR giải trình tự “ sách ✸✸ ả ... phẩm PCR vịng ngồi Mồi Fin Mồi Rin Mồi Fout PCR vòng Mồi Rin PCR vòng (1) (2) Sản phẩm PCR vòng Sản phẩm PCR vịng Hình 10: Minh họa ngun tắc (1) nested PCR (2) semi-nested/hemi-nested PCR PCR... nested PCR) Là PCR tổ thiết kế để hai giai đoạn PCR vịng ngồi PCR vòng thực tube PCR nhờ mà sau hồn tất PCR vịng ngồi chạy tiếp chương trình PCR vịng không cần dừng lại nhờ sản phẩm khuếch đại PCR. .. phải mở tube PCR vòng sản phẩm PCR vịng ngồi vào DNA đích DNA đích Mồi Fout Mồi Rout Mồi Fout Mồi Rout PCR vịng ngồi PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng ngồi Sản phẩm PCR vịng