PCR thuctephattrien

Kinh nghiệm xây dựng phát triển PCR/real-time PCR số kỹ thuật sinh học phân tử khác nghiên cứu chẩn đoán Từ yêu cầu thực tế phải tiếp cận y học đại chẩn đoán điều trị Cần giải pháp tồn diện chẩn đốn sinh học phân tử bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính Bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính hậu tình trạng nhiễm virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) virus viêm gan C (HCV=hepatitis C virus) gây Bệnh nhân bị nhiễm HBV HCV qua đường máu tiêm chích, truyền máu, nhổ răng, châm cứu, làm móng, hay thủ thuật xâm lấn dụng cụ bị nhiễm virus Ngoài ra, nhiễm trùng HBV HCV cịn xãy qua đường tình dục, mẹ truyền qua sinh nở Theo thông tin từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới số nhà nghiên cứu nước, Việt Nam quốc gia đứng hàng đầu tần suất nhiễm HBV qua xét nghiệm phát kháng nguyên bề mặt virus (HBsAg) máu, với tỷ lệ người bình thường có HBsAg dương tính 10-30% Thường diễn tiến tự nhiên người bị nhiễm HBV đa số tự khỏi hệ thống miễn dịch tạo kháng thể bảo vệ kháng thể đặc hiệu HBsAg Chỉ có số ít, hệ thống miễn dịch thể họ nhận diện kháng nguyên bề mặt virus kháng nguyên lạ để tạo đáp ứng miễn dịch mà người bị mang HBV thể lâu dài lúc xét nghiệm phát HBsAg dương tính Nếu khơng có tác nhân nguy gây tổn hại tế bào gan (như uống rượu, béo phì, gan nhiễm Sơ đồ 4: Hướng dẫn định xét nghiệm để điều trị theo dõi hiệu điều trị đặc hiệu bệnh nhân bị bệnh viêm gan virus B mạn tính 146 mở, hay bị tác nhân lý hoá khác) HBV nhân thành virus khơng hồn chỉnh (chỉ có vỏ capsid mà khơng có lõi DNA) tạo số lượng giới hạn virus hoàn chỉnh, họ người lành mang HBV mà (carrier) không phát triển thành viêm gan mạn tính Tuy nhiên có nguy thương tổn tế bào gan xãy HBV phát triển nhiều tế bào gan, lượng virus hồn chỉnh phóng thích nhiều vào máu (³105 copies/1ml máu) đồng thời gây tổn hại tế bào gan để trở thành bệnh viêm gan mạn tính Nếu khơng kiểm sốt nhân HBV viêm gan mạn tính dẫn đến hậu khó tránh khỏi xơ gan dẫn đến ung thư gan hay thẳng đến ung thư gan Do vậy, trước người có xét nghiệm HBsAg dương tính nhà lâm sàng thiết phải cho định làm thử nghiệm xác định xem máu người nhiễm có mang HBV hồn chỉnh hay khơng xét nghiệm PCR phát HBV-DNA, dương tính phải biết số lượng HBV hồn chỉnh có 105 copies/1ml hay khơng xét nghiệm qPCR để định lượng HBV-DNA Nếu lượng HBV máu 105 khơng cần thiết phải điều trị HBV cịn nhân giới hạn tế bào gan chưa gây tổn hại tế bào gan Nhưng lượng virus ³105 cần phải xem xét gan có bị tổn thương chưa thơng qua xét nghiệm men gan ALT Nếu lượng ALT vượt bình thường (1,5 hay tối đa lần bình thường, nam bình thường 33UI cịn nữ bình thường 19IU) phải cho định điều trị thuốc kháng virus lamivudine, adefovir, entecavir, interferon hay sử dụng từ ban đầu liệu pháp kết hợp lamivudine với adefovir, với entecavir, hay với interferon Nếu lượng ALT cịn bình thường phải làm sinh thiết gan để làm xét nghiệm giải phẩu bệnh xem gan có bị thương tổn mơ học khơng, hay khơng muốn làm sinh thiết gan làm fibroscan gan bệnh nhân giá trị fibroscan cho biết tình trạng tổn hại mơ gan dù khơng xác sinh thiết gan Ngồi ra, cần thiết phải làm thêm thử nghiệm định lượng AFP (alpha foeto-protein) bệnh nhân cần có chứng mơ học có tổn thương gan hay lượng AFP vượt giới hạn bình thường phải cho định điều trị bệnh nhân thuốc kháng virus Hiện nhà điều trị khơng cịn ảo vọng trị HBV khỏi thể bệnh nhân nhiễm HBV dễ dàng bị tái phát sau ngưng điều trị Lý yếu HBV ln tồn nhân tế bào gan dạng cccDNA (covalently closed circular 147 DNA) để làm nguồn gốc di truyền virus, dạng không bị tác động thuốc kháng virus nucleosides analogs Tuy nhiên có nhiều chứng cho thấy khơng kiểm sốt mà để lượng HBV hồn chỉnh máu lên q cao bệnh viêm gan mạn tính có nguy diễn tiến đến suy gan bù, hay xơ gan tiến triển ung thư gan Do vậy, sau bắt đầu điều trị bệnh nhân bị viêm gan virus B mạn tính, nhà điều trị phải thường xuyên theo dõi hiệu điều trị đặc hiệu mà họ cho bệnh nhân cách phải định kỳ tháng cho bệnh nhân làm xét nghiệm qPCR định lượng HBV-DNA (nếu lượng HBV-DNA cịn định lượng được) hay PCR định tính phát HBV-DNA (nếu HBV-DNA ngưỡng phát định lượng) lượng HBV-DNA ngưỡng phát Quan điểm nhà điều trị phải liên tục trì liệu pháp kháng virus để khống chế lượng virus mức phát mà phải theo dõi tái xuất virus xét nghiệm PCR phát HBV-DNA máu bệnh nhân định kỳ tháng Nếu sau thời gian điều trị đặc hiệu (thường tháng) mà lượng virus không giảm log (100 lần), hay không đạt đến ngưỡng 103/ml, hay trình điều trị, xét nghiệm HBV-DNA dương tính trở lại, bác sĩ điều trị phải nghĩ đến khả virus kháng thuốc, đặc biệt kháng lamivudine Lúc xét nghiệm sinh học phân tử mà bác sĩ nên định thực bệnh nhân xét nghiệm định genotype phát đột biến kháng lamivudine, adefovir entecavir virus HBV bệnh nhân để tuỳ thuộc vào genotype đột biến mà điều chỉnh liệu pháp kháng virus thích hợp Trước đây, nhà lâm sàng thường đánh giá hiệu điều trị đặc hiệu qua xét nghiệm miễn dịch cho biết có dấu hiệu chuyển đảo huyết bệnh nhân, Sơ đồ 5: Sơ đồ hướng dẫn định theo dõi hiệu điều trị đặc hiệu bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính 148 nghĩa HBeAg (kháng nguyên tiết HBV - thơng số cho biết có tình trạng virus nhân bản) trở nên âm tính xuất kháng thể kháng HBe Tuy nhiên HBV có đột biến precore làm cho virus khơng thể tạo kháng nguyên HBe mà có kháng thể kháng HBe nên muốn xác định chắn có chuyển đảo huyết thật hay khơng nhà lâm sàng phải định xét nghiệm phát đột biến precore bệnh nhân HBeAg [-], có kháng thể kháng HBeAg, mà HBVDNA cịn [+] Ngồi ra, nghiên cứu gần cho biết đột biến precore (vị trí 1896) đặc biệt core-promoter (vị trí 1762/64) có liên quan đến diễn tiến viêm gan mạn tính, xơ gan, ung thư gan bệnh nhân Do xét nghiệm sinh học phân tử phát đột biến precore yêu cầu thực tiến từ nhà điều trị Sơ đồ tóm tắt qui trình cho định xét nghiệm để điều trị theo dõi điều trị viêm gan B mạn tính Ngồi viêm gan B, nhiễm viêm gan virus C vấn đề cần quan tâm nay, đặc biệt Việt Nam Theo ghi nhận tình hình nhiễm viêm gan C tỷ lệ người bình thường Việt Nam nhiễm virus viêm gan C khoảng 2-10%, xem thuộc nhóm quốc gia có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C cao thứ nhì giới Khác với nhiễm viêm gan B với đa số trường hợp người nhiễm tạo kháng thể bảo vệ loại trừ virus số trở thành người lành mang trùng; có đến 85% người nhiễm viêm gan virus C khơng có miễn dịch bảo vệ, dù có xuất kháng thể đặc hiệu (anti-HCV [+]), bị diễn tiến đến viêm gan mạn tính đến xơ gan với 20% số có nguy diễn tiến đến ung thư gan Do mà dù tỷ lệ người nhiễm viêm gan C Việt Nam thấp nhiễm viêm gan B tình trạng bệnh tật nhiễm virus viêm gan C mang lại cao, không thua mà chí cịn viêm gan B Nguy hiểm bệnh viêm gan C mạn tính lại bệnh mà ánh sáng y học đại lại bệnh chữa khỏi hồn tồn với xác suất thành cơng đến 60% Tuy nhiên, định điều trị đặc hiệu viêm gan C mạn tính interferon a phối hợp với ribavirin phát đồ chuẩn nay, bác sĩ cần phải xác định bệnh nhân mang virus viêm gan C máu xét nghiệm định tính HCV-RNA xét nghiệm anti-HCV xét nghiệm sàng lọc cho truyền máu xét nghiệm chẩn đốn lâm sàng, người có kết anti-HCV [+] khơng mang 149 virus viêm gan C mà kết tình trạng nhiễm mầm bệnh trước khỏi Sau xác định người bệnh dương tính HCV-RNA, trước cho định điều trị bác sĩ cần phải làm thêm hai xét nghiệm định lượng HCV-RNA định genotype virus Lý bác sĩ cần phải đánh giá hiệu điều trị mà cho bệnh nhân sau tháng sau tháng điều trị phương pháp đánh giá định lượng lại HCV-RNA Nếu kết định lượng cho thấy virus biến sau tháng điều trị đáp ứng siêu vi nhanh với dự hậu thành công điều trị tốt Nếu lượng virus giảm 100 lần (trên hay log) sau tháng bắt đầu điều trị đáp ứng siêu vi sớm đánh giá điều trị cho hiệu tiếp tục Nếu lượng virus không giảm log phương pháp điều trị cho bệnh nhân không hiệu cần phải cân nhắc để điều chỉnh (dùng loại interferon a khác có dược động dược lực tốt hơn, bắt buộc bệnh nhân phải tuân thủ ) Để định thời gian điều trị bác sĩ cần phải biết genotype HCV bệnh nhân, genotype cần phải trì thời gian điều trị 48 tuần hay hơn, thuộc genotype khác thời gian điều trị ngắn 24 tuần Sau hoàn tất thời gian cần phải điều trị bệnh nhân, trước định ngưng điều trị, bác sĩ cần phải xác định xem bệnh nhân HCV-RNA chưa xét nghiệm định tính HCV-RNA ngưng điều trị HCV-RNA hồn tồn âm tính Sau ngưng điều trị bệnh nhân virus, bác sĩ phải khuyến cáo bệnh nhân làm xét nghiệm định đính HCV-RNA tháng lần để theo dõi xem bệnh nhân có bị tái phát khơng Bất lúc HCV-RNA dương tính lại dấu hiệu tái phát bác sĩ phải xem xét điều trị lại cho bệnh nhân phải theo thực lại qui trình xét nghiệm Sơ đồ tóm tắt qui trình nêu Cần xét nghiệm kịp thời nhạy cảm để chẩn đoán phát tác nhân vi sinh gây bệnh mà phương tiên vi sinh hay miễn dịch khơng hữu hiệu Bên cạnh bệnh viêm gan mạn tính virus B virus C, y học Việt Nam cịn phải đối phó với bệnh nhiễm trùng khác mà vấn đề phát tác nhân vi sinh gây bệnh cần thiết phải có phương tiện xét nghiệm nhạy cảm hơn, kịp thời hơn, an toàn Theo đánh giá tổ chức y tế giới, Việt Nam 22 nước mang gánh nặng nhiễm lao cao giới Ngồi với tình trạng gia tăng tỷ lệ 150 nhiễm HIV/AIDS Việt Nam (có thể q 300.000 theo dự đốn Bộ Y Tế) nguy phải đối phó với tình trạng nhiễm lao tăng cao cộng đồng Do mà vấn đề nâng cao lực phịng thí nghiệm lâm sàng xét nghiệm phát lao vấn đề mà y học Việt Nam phải đặt với phương pháp nhuộm tìm trực khuẩn kháng acid (AFB), độ nhạy phát đạt 64% lao phổi, 27% lao phổi, 9% lao màng não; nhuộm kháng acid bị phụ thuộc nhiều vào kỹ người đọc lame kết xác định bệnh nhân có thật nhiễm lao hay khơng có nhiều trực khuẩn kháng acid khác khơng phải vi khuẩn lao diện bệnh phẩm Với phương pháp ni cấy độ nhạy cao 77% lao phổi, 67% lao phổi 39% lao màng não thời gian để có kết khơng thể trước tuần sử dụng phương pháp cấy nhanh với môi trường MGITT hay phải tháng sử dụng phương pháp cấy với môi trường Lowenstein Jensen Chính nên bệnh viện hay phịng khám, có nhiều trường hợp bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng X-quang nghi ngờ lao phổi, hầu hết trường hợp lâm sàng chẩn đốn nghi ngờ lao ngồi phổi hay lao màng não mà kết xét nghiệm bác sĩ nhận thường soi không thấy, cấy không Thực tế đòi hỏi nhà lâm sàng phải yêu cầu xét nghiệm PCR phát lao bệnh phẩm khác theo nhiều nghiên cứu giới, PCR cải thiện đáng kể độ nhạy phát lao không lao phổi mà lao phổi lao màng não Hơn kết PCR cho phép xác định nhiễm lao mà không cần phải làm thêm xét nghiệm vi sinh xác định phương pháp nhuộm kháng acid hay ni cấy, với PCR người làm xét nghiệm phát đoạn DNA đích đặc hiệu cho vi khuẩn lao cho mycobacteria khác lao Một bệnh nhiễm khác mà thực tế đòi hỏi phải triển khai xét nghiệm khuếch đại nucleic acid sở kỹ thuật PCR để phát tác nhân gây bệnh, bệnh sốt Dengue gây sốt xuất huyết Dĩ nhiên việc chẩn đốn lâm sàng bệnh nhân có phải bị sốt Dengue gây sốt xuất huyết hay không thật khơng khó bệnh nhân xuất bất thường số lượng tiểu cầu (giảm tiểu cầu) dung tích hồng cầu (tăng dung tích hồng cầu) hay có triệu chứng vào shock Tuy nhiên 151 để phát bệnh nhân có phải sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue ngày đầu bệnh thật vấn đề nan giải giai đoạn sớm mặt lâm sàng hay cận lâm sàng, bệnh nhân khơng có biểu đặc hiệu sốt siêu vi Thử nghiệm miễn dịch học phát kháng thể đặc hiệu Dengue, chí kháng thể IgM, bắt đầu dương tính vào ngày thứ hay bệnh lúc kết xét nghiệm khơng cịn hữu dụng lâm sàng biểu lâm sàng sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue rõ Vì khơng thể chẩn đốn xác định sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue ngày đầu bệnh nên có hai tình huống: (1) Hoặc bệnh nhân không theo dõi để điều trị kịp thời vào đến bệnh viện vào bệnh cảnh shock nặng bác sĩ phải vất vả cứu bệnh nhân hay trở tay không kịp; (2) Hoặc mùa dịch sốt xuất huyết bệnh viện bị tràn ngập bệnh nhân lâm sàng nghi ngờ sốt xuất huyết mà chưa có cớ chứng minh bệnh nhân bị sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue Do thực tế đòi hỏi phòng thí nghiệm lâm sàng phải có phương tiện đủ sức để chẩn đốn phát Dengue sớm ngày đầu bệnh, phương tiện khơng có khác thử nghiệm RTPCR phát RNA virus Dengue máu bệnh nhân nhờ lượng virus xuất cao máu ngày đầu bệnh, chí ngày bệnh Trong sản phụ khoa nay, nhà lâm sàng nghiên cứu y học cần thiết phải có kết phát xác định genotype HPV từ quệt hay sinh thiết cổ tử cung để phát sớm nguy sinh ung thư cổ tử cung phụ nữ khoa học chứng minh tác nhân gây ung thư cổ tử cung phụ nữ số genotype HPV nguy cao (như 16, 18 ) Xét nghiệm thực phương pháp tế bào học hay mô học mà phải thực kỹ thuật sinh học phân tử khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu vùng gene L1 virus sau xác định trình tự đặc hiệu genotype virus, kỹ thuật PCR theo sau lai phân tử Hiện ngành y tế cịn phải đối phó thêm với bệnh có nguy gây dịch cao cúm gà H5N1, biện pháp để đối phó với dịch bệnh người phải phát sớm tác nhân H5N1 mẫu 152 bệnh lấy từ người nghi ngờ nhiễm bệnh để bệnh nhân sớm điều trị đặc hiệu sớm phát ổ dịch lây cho người để sớm cách ly đối phó Tuy nhiên phát H5N1, xây dựng phương pháp virus học nuôi cấy phịng thí nghiệm lâm sàng điều khơng hữu dụng lâm sàng kết nuôi cấy có nhanh được, đồng thời khơng an tồn khó có phịng thí nghiệm lâm sàng đạt cấp độ an toàn sinh học Do xét nghiệm thích hợp hữu dụng để thực phịng thí nghiệm lâm sàng khơng có khác xét nghiệm RT-PCR phát H5N1 xét nghiệm địi hỏi phải thực phịng thí nghiệm có trang bị an toàn sinh học cấp kết xét nghiệm khơng nhạy cảm mà cịn đến tay lâm sàng vịng khơng q sau lấy mẫu Để đối phó với đại dịch HIV/AIDS, việc phổ biến kiến thức tránh lây nhiễm hay tránh hành vi có nguy cao bị lây nhiễm cộng đồng, vấn đề điều trị đặc hiệu có hiệu cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS vấn đề mà nhà quản lý y tế cần phải thực có điều trị đặc hiệu hiệu bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS trở lại với cộng đồng giảm thiểu nguy lây nhiễm nhờ lượng virus máu dịch thể bệnh nhân bị khống chế ngưỡng phát Để điều trị cách hiệu cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS, nhà y học cần phải có phương tiện xét nghiệm định lượng virus máu bệnh nhân để thay đổi phát đồ điều trị lượng virus tăng lên hay xuất trở lại trình điều trị Do xét nghiệm định lượng virus HIV xét nghiệm cần thiết phải triển khai kỹ thuật dễ tiếp cận để thực xét nghiệm kỹ thuật real-time PCR Ngoài việc theo dõi hiệu điều trị đặc hiệu, xét nghiệm phát định lượng HIV cịn có giá trị chẩn đoán cho trẻ sơ sinh để phát cháu có bị nhiễm bệnh từ mẹ truyền qua khơng, yêu cầu mà phương pháp miễn dịch phát kháng thể đặc hiệu HIV đáp ứng trẻ có kết HIV [+] qua miễn dịch kháng thể đặc hiệu HIV phát máu trẻ kháng thể từ mẹ truyền qua thời kỳ bào thai Với tiến ghép tạng Việt Nam, xét nghiệm phát CMV xét nghiệm cần thiết phải thực người cho quan để tránh nguy người 153 nhận bị nhiễm bùng phát bệnh phải nhận liệu pháp ức chế miễn dịch sau ghép Nếu dựa vào xét nghiệm phát kháng thể đặc hiệu CMV huyết người cho tạng kết chắn khơng đủ đặc hiệu để nói lên người cho mang CMV truyền tác nhân gây bệnh sang người nhận kháng thể tồn lâu sau bệnh nhên khỏi bệnh Do cần phải có xét nghiệm phát trực tiếp tác nhân CMV bạch cầu máu người cho, xét nghiệm đáp ứng yêu cầu xét nghiệm PCR/real-time phát hiện/định lượng CMV-DNA Ngồi ra, thực tế y học đại mà tiếp cận đòi hỏi nhà lâm sàng phục vụ yêu cầu xét nghiệm phát và/hay định lượng nhiều tác nhân gây bệnh khác phương pháp khuếch đại nucleic acid sở kỹ thuật PCR real-time PCR Ví dụ để phát nguyên muộn phụ nữ, nhà lâm sàng cần phải có xét nghiệm PCR phát C trachomatis N gonorrhoeae mẫu quệt cổ tử cung nước tiểu Để phát tác nhân viêm não màng não virus, xét nghiệm PCR phát HSV hay RT-PCR phát Enterovirus 71 dịch não tuỷ cần triển khai Để phát H pylori mẫu sinh tiết vết loét dày tá tràng xét nghiệm PCR phát tác nhân xét nghiệm thiếu Hay giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện, xét nghiệm PCR phát S aureus kháng methicillin (MRSA) từ tay quệt mũi trước nhân viên y tế người chăm sóc bệnh nhân xét nghiệm cần thiết phải thực độ nhạy cảm cao qui trình thực đơn giản kết có nhanh nhiều so với xét nghiệm vi sinh truyền thống Đến thực tế triển khai kỹ thuật PCR, real-time PCR Các rào cản Vậy thực tế đòi hỏi nhà khoa học, đặc biệt nhà y học phải nhanh chóng phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại, PCR real-time PCR vào chẩn đoán hổ trợ cho theo dõi điều trị bệnh nhân Việt Nam Tuy nhiên nhiều nhà khoa học quản lý y tế nước ngần ngại với khả Các lý họ cho là: (1) thử nghiệm khó thực cách chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng; (2) giá 154 nghiệm cao vượt ngồi khả người bệnh Chúng ta thử phân tích có không? Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật khó thực cách chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng? PCR real-time PCR kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt độ nhờ nguyên liệu dNTP, enzyme polymerase chịu nhiệt, cặp mồi đoạn oligonucleotide đơn dài khoảng 20-25 base có trình tự bổ sung đặc hiệu với hai đầu đoạn DNA đích cần nhân Nhờ chu kỳ nhiệt mà đoạn DNA đích nhân theo cấp số nhân để sau 30 đến 40 chu kỳ, đoạn DNA đích nhân thành hàng tỷ dễ dàng phát Với phương pháp PCR (ngày gọi PCR kinh điển), kết PCR phát dựa vào điện di để xác định kích thước và/hay dựa vào lai với dị đặc hiệu để xác định trình tự đặc hiệu sản phẩm khuếch đại xem có trùng khớp với kích thước và/hay trình tự đoạn DNA đích khơng Với phương pháp real-time PCR kết PCR đọc q trình chạy PCR mà khơng cần phải thực giai đoạn phân tích sau PCR nhờ khả phát huỳnh quang ống phản ứng q trình chạy PCR có sản phẩm khuếch đại xuất PCR mix Huỳnh quang sớm xuất số lượng đoạn DNA đích ban đầu mẫu thử cho vào PCR mix nhiều, nhờ ngun lý mà real-time PCR khơng dùng để phát mà để định lượng DNA đích ban đầu có mẫu thử Nhờ khuếch đại phát nên PCR real-time PCR đạt độ nhạy nói chưa có kỹ thuật so sánh nổi: Giới hạn thấp phát phân tử Chính vậy, PCR real-time PCR công cụ hữu dụng phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Tuy nhiên câu hỏi nhiều người đặt liệu PCR real-time PCR có đặc hiệu khơng đạt độ nhạy cao vậy? Vì theo lý luận thống kê thơng thường xét nghiệm đạt độ nhạy cao độ đặc hiệu thấp xuống Để trả lời câu hỏi này, phải so sánh độ đặc hiệu PCR so với nuôi cấy phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Nuôi cấy xét nghiệm đặc hiệu để phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh có ni cấy xác định diện tác nhân vi sinh vật gây bệnh có mặt mẫu thử Qua nhìn phân tử thấy ni 155 cấy chẳng qua phân lập khuếch đại gen vi sinh vật gây bệnh từ thành hàng tỷ sau xác định gen khuếch đại vi sinh vật dựa vào kiểu hình sinh vật hố học mà gen qui định Xét nghiệm PCR realtime PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh khơng khác ni cấy, khơng phải nuôi cấy gen mà đoạn gen đặc hiệu vi sinh vật gây bệnh (không phải môi trường phân lập nuôi cấy vi sinh phức tạp khác mà đơn giản ống phản ứng chứa PCR mix) thành hàng tỷ sau định danh xem có vi sinh vật muốn tìm khơng dựa vào kích thước và/hay trình tự nucleotide Do đó, thừa nhận nuôi cấy đặc hiệu phải thừa nhận PCR đặc hiệu chẳng khác ni cấy mà lại nhạy cảm ni cấy nhiều ni cấy bị phụ thuộc nhiều khâu lấy mẫu, chuyên chở mẫu, thời gian trì hỗn từ lấy mẫu đến bắt đầu tiến hành nuôi cấy, đặc biệt phải chọn lựa cho mơi trường thích hợp cho khâu phân lập; mà yếu tố lại thường thực cách chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng quốc gia có thu nhập thấp Vậy lại ngần ngại phát triển ứng dụng xét nghiệm PCR real-time phịng thí nghiệm lâm sàng để phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho khó thực xét nghiệm cách chuẩn mực? Trong xét nghiệm PCR real-time PCR lại dễ thực chuẩn mực xét nghiệm vi sinh nhiều vì: (1) Khi khơng làm xét nghiệm khơng cần phải giữ mơi trường chuyên chở thời gian có hạn vi sinh, bệnh phẩm xét nghiệm PCR giữ điều kiện lạnh 2-8oC hay giữ đông thời gian chun chở đến phịng thí nghiệm, giữ -70oC mẫu thử cịn ngun giá trị để làm xét nghiệm PCR sau nhiều năm (2) Nếu thuốc thử cung cấp hay pha chế dạng kit bước làm xét nghiệm PCR đơn giản dễ chuẩn hoá: Trước hết tách chiết nucleic acid từ mẫu thử kit tách chiết thích hợp; sau cho tách chiết vào ống phản ứng chứa PCR mix thích hợp để thực chu kỳ nhiệt cho khuếch đại nucleic acid đích; cuối phát sản phẩm khuếch đại nucleic acid đích (nếu real-time PCR bước nầy thực trình chạy PCR) Trong đó, q trình làm xét nghiệm vi sinh phức tạp 156 khó chuẩn hóa nhiều địi hỏi người làm xét nghiệm phải có đủ kiến thức để chuẩn bị, lựa chọn qui trình với thuốc thử mơi trường ni cấy thích hợp cho vi sinh vật đích, đặc biệt phải có kiến thức kinh nghiệm để bắt vi sinh vật đích diện bệnh phẩm PCR real-time PCR cịn có nhiều ưu điểm vượt trội khác so với xét nghiệm vi sinh như: (1) Kết chung đến tay bác sĩ lâm sàng nhanh xét nghiệm vi sinh, không kể từ bắt đầu làm xét nghiệm (2) Phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phịng thí nghiệm lâm sàng khơng có khả phát với xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống tác nhân virus (HCV, HBV, HPV ), tác nhân vi sinh triển khai ni cấy phịng thí nghiệm lâm sàng khả gây dịch cao (H5N1) hay khó ni cấy (C trachomatis, L pneumophila), hay có mặt bệnh phẩm (M tuberculosis lao phổi, tác nhân viêm màng não mủ cụt đầu ), tác nhân ni cấy thời gian có kết chung q lâu (M tuberculosis) Ngồi ra, mối lo ngại mà nhiều người quan tâm, vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại, dễ xãy phòng xét nghiệm lâm sàng nguy tích tụ dễ dàng dẫn đến ngoại nhiễm vào thuốc thử bệnh phẩm qua dụng cụ qua tay người làm xét nghiệm Ngày nay, nhờ sử dụng hệ thống chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại men UNG dUTP cho vào PCR mix (để làm cho sản phẩm khuếch đại có nhiều vị trí T bị thay U nhờ mà bị khác biệt với DNA nguyên thuỷ để bị men UNG phá huỷ trước vào trình khuếch đại) mà thử nghiệm PCR real-time PCR dễ dàng triển khai thực phịng thí nghiệm lâm sàng cần bố trí vùng làm việc tách biệt, khơng cần phải phịng tách biệt trước Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật đắt tiền không? Trang bị đắt tiền cho phịng thí nghiệm lâm sàng làm xét nghiệm PCR real-time PCR máy PCR máy real-time PCR Tuy nhiên nhờ công nghệ ngày tiến ngày có nhiều cơng ty cung cấp máy nên thiết bị ngày có nhiều tính hoạt động hữu hiệu mà giá thành lại ngày rẽ hơn, không vượt q khả trang bị nhiều phịng thí 157 nghiệm lâm sàng Nếu tính khấu hao thiết bị giá thành xét nghiệm tháng khoảng 800USD với thời gian sử dụng thiết bị năm Vậy xét nghiệm PCR real-time PCR quốc gia tiên tiến lại đắt, bệnh nhân phải trả tiền cho xét nghiệm không 100USD? Lý chủ yếu phịng thí nghiệm lâm sàng nơi thường phải mua kit xét nghiệm PCR real-time PCR từ công ty sản xuất kit chẩn đoán (như Roche Diagnostic) với giá thành đắt để đảm bảo xét nghiệm thực cách chuẩn mực Tại quốc gia thu nhập thấp Việt Nam chúng ta, làm chắn xét nghiệm PCR real-time PCR chẳng thể áp dụng dù thực tế cần phải có xét nghiệm Chúng ta biết PCR real-time PCR kỹ thuật hoàn toàn mở cho phép nhà nghiên cứu tiếp cận để tự pha thuốc thử thực xét nghiệm chịu trách nhiệm kết xét nghiệm mà thực (thường gọi homebrew) Tuy nhiên làm chắn đối phó với vấn đề chất lượng xét nghiệm PCR real-time PCR khác biệt phịng thí nghiệm lâm sàng với Do giải pháp hay phải có kit PCR realtime PCR sản xuất nước cung cấp đến phịng thí nghiệm lâm sàng Các kit không đạt độ nhạy độ đặc hiệu cao, mà cịn phải có đầy đủ chuẩn mực để người làm xét nghiệm kiểm sốt sơ sót xãy trình làm xét nghiệm Nhờ vậy, chất lượng xét nghiệm PCR real-time PCR chuẩn mực, đạt mức cao cách đồng phịng thí nghiệm lâm sàng, đồng thời giá thành xét nghiệm hồn tồn chấp nhận Thực tế triển khai PCR real-time PCR Xuất phát từ nhận định trên, thời gian qua liên tục phát triển hoàn thiện kit PCR real-time PCR để đưa vào ứng dụng nhiều phịng thí nghiệm lâm sàng có trang bị PCR Việt Nam Như nói trên, để đảm bảo chất lượng cao đồng xét nghiệm PCR real-time PCR thực phòng thí nghiệm lâm sàng áp dụng cho chẩn đốn, thử nghiệm kit cung cấp để làm thử nghiệm phải ln ln có đầy đủ chuẩn mực sau: (1) Kit khuếch đại đạt độ nhạy cao có chứng để xác định độ nhạy thông qua chứng [+] cung cấp với số copies xác định để người sử dụng 158 kiểm tra (2) Có chứng nội sử dụng chung mồi với nucleic acid đích cung cấp với hàm lượng copies tối thiểu để người thực thí nghiệm cho vào mẫu chứng âm [-] mẫu thật thật âm tính thực xét nghiệm với mẫu thử nhờ mà kiểm tra q trình xét nghiệm có bị ngoại nhiễm khơng suốt q trình thao tác xét nghiệm chứng minh độ nhạy kit tách chiết kit khuếch đại (3) Người thực thí nghiệm cịn cho chứng nội vào PCR mix với tách chiết mẫu thử để xác định mẫu âm tính âm tính thật mà khơng phải âm tính PCR bị ức chế (4) Có hệ thống chống ngoại nhiễm dUTP UNG pha chung vào PCR mix để sản phẩm khuếch đại bị phá huỷ không cho tham gia vào trình khuếch đại (5) Trong PCR định lượng, chuẩn trên, để đảm bảo xét nghiệm định lượng, mẫu chuẩn biết rõ hàm lượng copies DNA đích cung cấp dạng bền vững với yêu cầu người làm xét nghiệm phải tự cho vào PCR mix nhằm đánh giá thao tác pipetting làm định lượng xây dựng đường chuẩn lần làm xét nhiệm để tạo xở định lượnh xác Cho đến nay, triển khai thực xét nghiệm PCR realtime PCR sản xuất kit tương ứng đạt tất chuẩn mực trên, là: (1) Xét nghiệm kit PCR phát HBV-DNA (hình 69) dựa khuếch đại đích 259bp gen S, đạt độ nhạy 10 copies/ml huyết Có chứng âm huyết tương người bình thường, chứng dương 100 copies/ml plasmid chèn đoạn DNA đích để chứng minh độ nhạy phản ứng khai báo Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho Hình 69: Kết xét nghiệm PCR phát HBV-DNA NK thực với HBV-PCR kit sản phẩm khuếch đại khác biệt DNA đích với kích thước 195bp, cung cấp lượng tối thiểu để kiểm soát độ nhạy tách chiết, khuếch đại kiểm tra ngoại nhiễm, xác định mẫu có bị âm tính ức chế khơng 159 (2) Xét nghiệm kit RT-PCR phát HCV-RNA (hình 70) dựa khuếch đại đoạn 240bp vùng 5’NC, đạt độ nhạy 50 copies/ml huyết mà người sử dụng kiểm chứng nhờ chứng [+] chứa 200copies/ml plasmid chèn DNA đích Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp kích thước 195bp khác biệt với DNA đích sử dụng Hình 70: Kết xét nghiệm RT-PCR phát HCV-RNA thực với NKHCV-RTPCR kit mồi Chứng nội cung cấp nồng độ tối thiểu để người làm thí nghiệm cho vào với mẫu thử để tách chiết RNA với mẫu thử nhờ kiểm tra hiệu tách chiết RNA mẫu thử phát ức chế mẫu thử kết âm tính Chứng âm mẫu huyết thật âm tính cung cấp kiểm tra nguy ngoại nhiễm thao tác xét nghiệm (3) Xét nghiệm kit PCR phát MTB-DNA (hình 71) dùng chẩn đốn lao dựa khuếch đại đoạn DNA đích 249bp đoạn chèn IS6110 diện từ 16 đến 30 copies genome vi khuẩn M tuberculosis, nhờ độ nhạy xét nghiệm đạt đến mức phát 1fg (1/10 genome vi khuẩn) thể tích mẫu thử cho vào ống phản ứng Cũng xét nghiệm PCR khác, Hình 71: Kết xét nghiệm PCR phát MTB-DNA thực NK với MTB-PCR kit có chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đoạn DNA đích nhờ người làm xét nghiệm kiểm chứng được độ nhạy PCR mix Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch đại khác biệt DNA đích với kích thước 195bp cung cấp lượng tối thiểu để kiểm tra hiệu tách chiết DNA kít tách chiết DNA, 160 chứng minh mẫu âm tính khơng bị ức chế, chứng minh độ nhạy PCR mix (4) Xét nghiệm kit RT-PCR phát định type virus Dengue (hình 72) hay sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue Xét nghiệm kit chứa đầy đủ chứng dương, chứng nội đạt chuẩn mực xét nghiệm PCR dùng chẩn đoán xét nghiệm kit mà phát triển Đây xét nghiệm kit RT-PCR có khả vừa phát vừa định type virus Dengue qua vòng PCR đa mồi mà kết đạt Hình 72: Kết xét nghiệm RT-PCR phát định type virus Dengue gây sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue nhạy phương pháp dựa qui trình kinh điển Lanciotti cần phải qua hai vòng PCR với vòng làm tổ bên vịng định type virus Áp dụng thực tế lâm sàng, xét nghiệm kít chứng tỏ có khả phát định type Dengue sớm, ngày đầu bệnh, trước có dấu hiệu giảm tiểu cầu (5) Xét nghiệm kit PCR-ELISA phát định type HPV (hình 73) mãnh sinh thiết hay quệt cổ tử cung Đây xét nghiệm kit phát triển dựa nguyên tắc sử dụng mồi đặc hiệu gen L1 virus để khuếch đại đoạn DNA dài 450bp bị đánh dấu digoxygenine nhờ sử dụng PCR mix có thêm dig-dUTP Hình 73: Nguyên tắc xét nghiệm kit định type HPV NK HPV-PCR-ELISA phát Sau định genotype HPV cách lai sản phẩm khuếch đại giếng ELISA có dị đặc hiệu 161 genotype gắn giếng qua nối hoá học streptavidine-biotin (streptavidine phủ giếng nối với dò đặc hiệu gắng biotin đầu 5’) Sản phẩm lai “probe-sản phẩm khuếch đại” phát cộng hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu digoxygenine đánh dấu men peroxidase tá chất TMB Xét nghiệm kit PCRELISA chúng tơi có khả phát sau định genotype 10 genotype thường gặp HPV là: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 58 Hiện xét nghiệm kit bệnh viện Phụ Sản Từ Dũ sử dụng thành xét nghiệm dùng tầm soát sàng lọc ung thư sớm cổ tư cung phụ nữ (6) Các xét nghiệm kit PCR để phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác PCR phát HSV, CMV, multiplex PCR phát đồng thời N gonorrhoeae C trachomatis, L monocytogenes, nonstop nested PCR phát H5 Tất đạt chuẩn mực PCR dùng chẩn đốn (hình 74) (7) Xét nghiệm kit realtime PCR phát định lượng HBV-DNA huyết bệnh nhân nhiễm HBV dựa PCR khuếch đại đoạn đặc hiệu dài khỏang 190bp từ gene polymerase HBV-DNA Xét nghiệm kit đạt độ nhạy 10 copies/ml huyết Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch đại có trình tự khác biệt DNA đích nhờ phát với dị NK Hình 74: Kết xét nghiệm PCR với kit HSV-PCR NK phát Herpes simplex virus (trên), CMV-PCR phát cytomegalo virus (giữa), NKNGRCHLmultiplex PCR phát N gonorrhoeae C trachomatis (dưới) taqman gắn màu huỳnh quang TexasRed, Hex, hay Joe khác biệt với dò taqman gắn màu FAM phát sản phẩm khuếch đại DNA đích Chứng nội cung cấp lượng tối thiểu vào PCR mix với tách chiết mẫu thử nhờ kiểm tra ức chế có 162 mẫu âm tính Có chứng âm huyết tương người bình thường, chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đoạn DNA đích nhờ chứng minh độ nhạy phản ứng khai báo Các nồng độ DNA đích chuẩn cung cấp dạng bền vững nhờ mà đường chuẩn xây dựng đạt R³0.990 PCR efficiency đạt 90-105% (8) Xét nghiệm kit RT real-time PCR phát định lượng HCV-RNA huyết bệnh nhân nhiễm HCV dựa PCR khuếch đại đoạn đặc hiệu vùng 5’-NC genome HCV Xét nghiệm kit đạt độ nhạy 50 copies/ml huyết Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch đại có trình tự khác biệt cDNA đích nhờ phát phân biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích với nguyên tắc kit real-time PCR phát HBV Chứng nội cung cấp lượng tối thiểu vào với mẫu thử nhờ kiểm tra hiệu tách chiết RNA phát ức chế Chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đoạn DNA đích nhờ chứng minh độ nhạy phản ứng khai báo Các nồng độ DNA đích chuẩn cung cấp dạng A bền vững nhờ mà đường chuẩn xây dựng đạt R³0.990 PCR efficiency đạt 90-105% C (9) Xét nghiệm kit RT B real-time PCR định lượng HIV1-RNA huyết bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS dùng theo dõi hiệu điều trị đặc hiệu Xét nghiệm dựa PCR khuếch đại Hình 75: Kết xét nghiệm định genotype HBV với kit NKHBV genotype-PCR (A), xét nghiệm phát đột biến YMDD kháng lamivudine HBV với kit NKHBVlamiR-PCR (B), NK xét nghiệm định genotype HCV với kit HCVinoLIPA genotype-core PCR (C) đoạn đặc hiệu vùng gag gene genome HIV1 Xét nghiệm kit đạt độ nhạy 100 copies/ml huyết Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng 163 mồi cho sản phẩm khuếch đại có trình tự khác biệt cDNA đích nhờ phát phân biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích với nguyên tắc kit real-time PCR phát HBV Chứng nội cung cấp lượng tối thiểu vào với mẫu thử nhờ kiểm tra hiệu tách chiết RNA phát ức chế Chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đoạn DNA đích nhờ chứng minh độ nhạy phản ứng khai báo Các nồng độ DNA đích chuẩn cung cấp dạng bền vững nhờ mà đường chuẩn xây dựng đạt R³0.990 PCR efficiency ln đạt 90- Hình 76: Một số xét nghiệm PCR RT-PCR phát tác nhân virus gây bệnh tôm Các xèt nghiệm đạt đầy đủ chuẩn mực kỹ thuật cho xét nghiệm PCR RT-PCR dành cho chẩn đốn 105% (10) Ngồi ra, để cung cấp thêm giải pháp toàn diện xét nghiệm sinh học phân tử dùng chẩn đoán theo dõi hiệu điều trị viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính, chúng tơi phát triển xét nghiệm kit như: Nested multiplex PCR định genotype HBV, PCR-RFLP phát đột biến YMDD vị trí 204 180 đề kháng lamivudine HBV, PCR core kit định genotype HCV 164 phương pháp lai với dị inoLIPA (hình 75) Các xét nghiệm kit hồn tồn triển khai phịng thí nghiệm có trang bị phương tiện PCR (11) Trong lĩnh vực thủy sản, công ty Nam Khoa công ty hàng đầu phát triển xét nghiệm PCR realtime PCR phát xác định tỷ lệ tôm nhiễm virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, MrNV với đầy đủ chuẩn mực dành cho chẩn đốn Cơng ty nhà tiên phong phát triển phương pháp xác định tỷ lệ tôm nhiễm bệnh phương pháp real-time kỹ thuật định lượng tương đối Hình 76 minh họa số kit PCR RT-PCR công ty Nam Khoa phat triển để phát virus gây bệnh cho tôm Và thực tế triển khai kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử khác Thật nay, nhu cầu đến từ nhà lâm sàng nghiên cứu y học khơng địi hỏi phải phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR real-time PCR, mà đòi hỏi nhà khoa học phải sớm đưa kỹ thuật sinh học phân tử đại khác vào ứng dụng Một kỹ thuật mà nhận thấy cần phải thực kỹ thuật giải trình tự Quan điểm ứng dụng kỹ thuật không nghiên cứu mà phải phục vụ cho chẩn đốn lâm sàng Chính mà năm 2005, chúng tơi đầu tư máy giải trình tự CEQ8000 có chức năng: giải trình tự, phân tích đoạn, phát SNP Năm 2007 nâng cấp thêm chức thực nghiên cứu biểu gen đồng thời đầu tư thêm thiết bị giải trình tự ABI 3130XL có 16 capillaries Với chức giải trình tự, chúng tơi thành cơng triển khai xét nghiệm: (1) Định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ xét nghiệm định lượng HCV-RNA kit NK HCV RT realtime TQPCR; (2) Định genotype phát đột biến kháng lamivudine, adefovir entecavir kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ gene rt HBV; (3) Phát đột biến precore HBV để tiên đoán dự hậu viêm gan virus B mạn tính; (4) Phát M tuberculosis kháng rifampicine, INH, ethambutol trực tiếp từ bệnh phẩm với kết vòng 72 Ngoài ra, chức khác CEQ8000 chức phân tích đoạn chúng tơi triển khai xét nghiệm xác định quan hệ huyết thống, chức phát SNP triển 165 khai để phát tính đa dạng lồi đột biến, chức biểu gene nghiên cứu ung thư hiệu điều trị thuốc trị ung thư Kết luận Đã nhà khoa học, có tri thức định Các tri thức đến từ sách hay phương tiện tra cứu mà ngày hôm dễ dàng tiếp cận Đã nhà nghiên cứu lĩnh vực y học có mong muốn làm điều từ kiến thức mà có để ứng dụng vào giải số thực tế địi hỏi chẩn đốn nghiên cứu y học nước Vấn đề yếu để tri thức mà có khơng tri thức suông mà phải biến thành sản phẩm? Đây câu hỏi mà nghĩ nhiều người muốn biết để trả lời Chúng tơi nghĩ có câu thơ Goethe có lẽ giúp có kim nam để trả lời câu hỏi trên: “Knowing is not enough, we must apply Willing is not enough, we must do” Với lời phóng dịch người bạn chúng tôi: “Tri thức chẳng đủ Nếu không đem trãi nghiệm với đời Ước vọng trở thành vô nghĩa Nếu ngồi ôm mộng chơi vơi” Ngoài ra, để tránh bị nhà sản xuất nước ngồi chê bai mặt chất lượng, chúng tơi cho đừng có tự thua cho TIỀN NÀO CỦA ĐÓ, mà phải trả lời trau dồi tri thức để vươn đến đỉnh cao khoa học TRI THỨC ĐẾN ĐÂU CHẤT LƯỢNG ĐẾN ĐĨ 166 ... pháp real-time PCR kết PCR đọc q trình chạy PCR mà khơng cần phải thực giai đoạn phân tích sau PCR nhờ khả phát huỳnh quang ống phản ứng trình chạy PCR có sản phẩm khuếch đại xuất PCR mix Huỳnh... tách biệt trước Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật đắt tiền không? Trang bị đắt tiền cho phịng thí nghiệm lâm sàng làm xét nghiệm PCR real-time PCR máy PCR máy real-time PCR Tuy nhiên nhờ công... hoàn thiện kit PCR real-time PCR để đưa vào ứng dụng nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có trang bị PCR Việt Nam Như nói trên, để đảm bảo chất lượng cao đồng xét nghiệm PCR real-time PCR thực phịng