Tài liệu kỹ thuật PCR basic

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là phản ứng khuếch đại gen. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.

9 Polymerase Chain Reaction Các vấn ñề cơ bản PCR là gì? PCR là thử nghiệm nhân bản một ñoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Thử nghiệm ñược thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng từ 10µl ñến 50µl với các thành phần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thường ñược gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối ña ở 72 o C và bền ñược với nhiệt ñộ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, và dCTP); (3) DNA chứa các ñoạn DNA ñích sẽ ñược nhân bản trong ống phản ứng; (4) các ñoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các ñoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 – 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách ñặc hiệu với trình tự của 2 ñầu ñoạn DNA sẽ ñược nhân bản; (5) ion Mg ++ trong muối MgCl 2 ở nồng ñộ thích hợp, (6) dung dịch ñệm Tris-KCl ñể làm dung môi thích hợp cho phản ứng. Khi ống nghiệm phản ứng này ñược cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt ñộ trong máy sẽ làm cho nhiệt ñộ trong buồng ủ nhiệt của máy thay ñổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra. Nguyên tắc của PCR Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt ñộ sẽ bao gồm 3 giai ñoạn nhiệt ñộ (hình 1): (1) Đầu tiên nhiệt ñộ sẽ ñược ñưa lên 94 o C, ở nhiệt ñộ này các liên kết hydro của mạch ñôi DNA sẽ bị mất ñi, nhờ vậy DNA ñích bị biến tính thành các mạch ñơn; giai ñoạn 94 o C Biến tính 55 o C-65 o C Bắt cặp 72 o C Kéo dài Chu kỳ Chu k ỳ 2 Chu k ỳ 3 Chu kỳ 4 Hình 1: Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA ñích qua các chu kỳ nhiệt 10 nhiệt ñộ này ñược gọi là giai ñoạn biến tính. (2) Kế ñó nhiệt ñộ sẽ ñược hạ ñến 55 o C- 65 o C là nhiệt ñộ thích hợp ñể các ñoạn mồi tìm ñến bắt cặp bổ sung vào hai ñầu của ñoạn DNA ñích, giai ñoạn nhiệt ñộ này ñược gọi là giai ñoạn bắt cặp. (3) Cuối cùng, nhiệt ñộ ñược ñưa lên 72 o C là nhiệt ñộ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase ñể kéo các dNTP lại ñầu 3’ của ñoạn mồi ñang bắt cặp trên ñầu 5’ của sợi DNA ñích ñể bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA ñích ñã ñược nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này ñược lặp ñi lặp lại liên tục 30 ñến 40 lần thì từ một DNA ñích ñã nhân bản ñược thành 2 30 ñến 2 40 bản sao, tức là ñến hàng tỷ bản sao. Lịc sử phát minh PCR Thử nghiệm PCR ñược một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Lúc ñó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học khá tầm thường, làm việc tại một phòng thí nghiệm cũng không hiện ñại mấy. Ý tưởng của phát minh này ñến trong ñầu K. Mullis một cách tình cờ khi ông lái xe qua một vùng ñồi núi tại bắc California vào một buổi chiều mà trong ñầu vẫn cứ miên man suy nghĩ về công trình nhân bản ADN mà ông ñang làm tại phòng thí nghiệm, và rồi ông bị chạy lố ñường nên phải lùi xe quay về lối cũ. Khi lùi xe như vậy, ông chợt thấy rõ hai làn bánh xe mới bị tách khỏi hai làn bánh xe cũ!! Hình ảnh này chợt làm loé sáng ra trong ñầu ông ý tưởng dùng nhiệt ñộ ñể làm biến tính sợi ñôi DNA thành hai mạch ñơn Nhờ ñó ông ñã phát minh ra thử nghiệm PCR. Công trình nghiên cứu này ñược ông gửi ñến tờ Nature nhưng bị từ chối vì ban biên tập cho ông là một tác giả vô danh. Do vậy ông gửi bài ñến tờ Scientific American và ban biên tập tạp chí khoa học này ñã nhận diện ñược ñây là một phát minh lớn, họ ñăng tải ngay trong số báo (1985) Vol. 253, 34-157. Chỉ một thời gian ngắn sau ñó, K. Mullis lập tức ñược nổi tiếng trong giới khoa học thời bấy giờ vì ñã thực hiện ñược ước mơ của nhiều nhà khoa học thời ñó là nhân bản ñược DNA trong ống nghiệm mà không cần phải nhờ ñến các tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men, ñồng thời mở ra ñược rất nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng. Tám năm sau, phát minh này ñã ñem lại cho tác giả một nữa giải Nobel hóa học (1993). Có thể nói trong lịch sử khoa học, hiếm có một nhà khoa học nào có ñược một kỳ tích như vậy: Đạt ñược giải Nobel chỉ 8 năm sau phát minh!!. Mà quả thật kỳ tích này cũng rất xứng ñáng, vì PCR chính là một công cụ cách mạng nhất trong nghiên cứu và ứng dụng y sinh học. 11 chìa khóa kỹ thuật ñã giúp hoàn thiện PCR Cho ñến ngày hôm nay, ñể có thể trở thành một công cụ không thể thiếu ñược trong nhiều phòng thí nghiệm y sinh học dùng trong nghiên cứu cũng như phòng thí nghiệm lâm sàng dùng trong chẩn ñoán, ñã có 3 tiến bộ kỹ thuật ñã ñóng góp vào làm cho kỹ thuật PCR nguyên thủy của K. Mullis vốn dĩ khá phức tạp trở thành kỹ thuật PCR ngày nay khá ñơn giản và hiệu quả. Ba tiến bộ kỹ thuật ñó là: 1. Phát hiện và sản xuất ñược các enzyme polymerase chịu nhiệt Enzyme polymerase chịu nhiệt ñầu tiên ñược tách chiết từ vi khuẩn s aquaticus phân lập ñược trong bùn ñất của các suối nước nóng tại Hoa Kỳ, chính vì vậy mà polymerase chịu nhiệt thường ñược gọi là Taq polymerase (Taq viết tắt từ Thermus aquaticus) dù ngày nay ña số có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli hay các vi khuẩn không chịu nhiệt khác ñược tái tổ hợp di truyền với gene chịu trách nhiệm sản xuất polymerase chịu nhiệt. Nhờ có polymerase chịu nhiệt mà người làm thí nghiệm không phải mở nắp tube phản ứng ñể bổ sung enzyme polymerase sau mỗi giai ñoạn biến tính (94 o C) của mỗi chu kỳ nhiệt. Cũng nhờ có enzyme polymerase chịu nhiệt mà người làm thí nghiệm có thể có kết quả PCR ñặc hiệu hơn nhờ có thể thực hiện ñược giai ñoạn bắt cặp của mồi trên sợi khuôn ở nhiệt ñộ bắt cặp tối hảo của mồi thay vì phải luôn luôn ñể nhiệt ñộ bắt cặp của mồi và nhiệt ñộ kéo dài sợi bổ sung ở 37 o C như là trong kỹ thuật PCR nguyên thủy của K. Mullis, phải dùng enzyme polymerase không chịu nhiệt tách chiết từ E. coli. 2. Chế tạo ñược các máy luân nhiệt hoạt ñộng hiệu quả hơn Đó là các máy tạo chu kỳ nhiệt với buồng ủ nhiệt có nhiệt ñộ lên xuống chính xác và ñồng nhất, tốc ñộ gia giảm nhiệt cực nhanh theo chu kỳ. Một trong các chìa khóa kỹ thuật góp phần làm ñược ñiều này là ứng dụng công nghệ Peltier trong chế tạo các máy ñiều hòa nhiệt ñộ cho phi thuyền không gian Hoa Kỳ vào chế tạo các buồng ủ nhiệt của máy luân nhiệt (còn gọi là máy chu kỳ nhiệt), mà hãng MJ research chính là sở hữu chủ của sáng chế này. Buồng ủ nhiệt của các máy luân nhiệt sử dụng hiệu ứng Peltier này ñược làm bằng kim loại dẫn nhiệt cao, ñặt trên một thiết bị Peltier có cấu tạo là hai mảnh kim loại ñặc biệt ñặt áp vào nhau. Hai mảnh kim loại của thiết bị này ñược nối với hai cực của nguồn ñiện và ñược ñiều chỉnh tự ñộng ñể chiều của dòng ñiện ñi qua 12 thiết bị ñược thay ñổi theo chiều này hay theo chiều ngược lại. Chính sự ñổi chiều dòng ñiện ñã làm cho hai mảnh kim loại của thiết bị Peltier bị nóng lên ở mặt này và lạnh ñi ở mặt khác sẽ bị ñảo ngược lại nhiệt ñộ, nghĩa là mặt nóng sẽ bị lạnh ñi và mặt lạnh sẽ bị nóng lên. Như vậy, chu kỳ nhiệt mà người sử dụng nhập vào sẽ ñược bộ vi sử lý của máy sử dụng ñể ñiều khiển chiều và cường ñộ dòng ñiện ñi qua hai mảnh kim loại của thiết bị Peltier, làm cho buồng ủ nhiệt ñược lên xuống nhiệt ñộ theo chu kỳ nhiệt ñã nhập vào ( 2). Hiện nay, ña số các máy luân nhiệt ñều sử dụng buồng ủ nhiệt bằng kim loại hoạt ñộng theo nguyên lý Peltier nhờ có thể thiết kế máy ngày càng gọn nhẹ hơn, có nhiều chức năng hơn, kể cả chức năng gradient tức là chức năng thực hiện nhiệt ñộ bắt cặp mồi thay ñổi một cách tuyến tính theo hàng ngang hay theo hàng dọc trên buồng ủ nhiệt. Ngoài ra, nhờ thiết kế buồng ủ nhiệt phù hợp cũng như sử dụng các kim loại dẫn nhiệt và thoát nhiệt nhanh ñể làm buồng ủ nhiệt nên các máy luân nhiệt Peltier vẫn có thể thực hiện PCR với thời gian nhanh hơn. Một loại buồng ủ nhiệt khác ñã ñược hãng Idaho phát triển, ñó là buồng ủ khí. Với loại buồng ủ này, các ống nghiệm phản ứng ñược treo và quay ly tâm nhẹ liên tục trong buồng ủ với nhiệt ñộ trong buồng ñược làm nóng lên và nguội xuống nhờ quạt thổi khí nóng hay mát vào buồng ủ theo chu kỳ ñược ñiều khiển từ một bộ vi xử lý nhận lệnh từ Chu kỳ nhiệt Bộ vi xử lý Nguồn ñiện Cảm ứng nhiệt (T o sensor) Thiết bị Peltier Buồng ủ nhiệt 2 mảnh kim lọai của thiết bị Peltier Hình 2: Sơ ñồ khối minh họa nguyên tắc hoạt ñộng của máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt Peltier Quạt giải nhiệt 13 chương trình nhiệt ñược nhập vào máy ( 3). Ưu ñiểm của các máy PCR sử dụng buồng ủ khí là có thể thực hiện PCR với các giai ñoạn nhiệt ñộ rất ngắn chỉ trong vài giây, ñặc biệt khi PCR ñược thực hiện trong ống phản ứng mao quản (LightCycler của Roche). Tuy nhiên loại buồng ủ này không thể có chức năng gradient cũng như không thể ñưa nhiệt ñộ buồng ủ nhiệt xuống nhiệt ñộ lạnh nếu muốn thực hiện giữ lạnh ống phản ứng trong buồng ủ sau khi thực hiện PCR. 3. Tìm ñược phương pháp lọai trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại PCR rất nhạy cảm nhờ bản chất của kỹ thuật này là khuếch ñại một DNA ñích thành hàng tỷ bản sao, và cũng chính do bản chất này mà thách thức lớn nhất của việc ứng dụng PCR trong các phòng thí nghiệm chẩn ñoán là chống ñược ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại, ñược gọi là PCR carry-over. Ngày hôm nay, thách thức này ñã ñược các nhà khoa học giải quyết với một giải pháp kỹ thuật rất hữu hiệu, ñó là giải pháp dùng enzyme UNG (Uracil-DNA glycosilase). Nguyên tắc của giải pháp này là dùng các PCR mix có thêm dUTP và enzyme UNG ngay từ khi bắt ñầu sử dụng PCR trong chẩn ñoán ñể các sản phẩm PCR khuếch ñại từ DNA ñích sẽ ñược ñánh dấu khác biệt với DNA ñích nhờ nhiều vị trí T trên trình tự chuỗi của sản phẩm khuếch ñại bị thay thế bởi U do enzyme polymerase nhầm lẫn giữa T và U khi thực hiện khuếch ñại. Chính nhờ vậy mà sản phẩm khuếch ñại nếu bị ngoại nhiễm vào PCR mix mới sẽ Hình 3: Sơ ñồ khối minh họa nguyên tắc hoạt ñộng của máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt bằng khí Chu kỳ nhiệt Bộ vi xử lý Quạt thổi nhiệt vào và ra Tube PCR Tube PCR Mâm ñặt tube PCR luôn quay tròn khi chạy máy Thiết bị sinh nhiệt Bộ cảm biến nhiệt 14 không thể tham gia vào phản ứng khuếch ñại vì sẽ bị enzyme UNG phá hủy trước khi thực hiện PCR ( 4). Chính nhờ giải pháp chống ngoại nhiễm bằng enzyme này mà ngày hôm nay các phòng thí nghiệm có thể dễ dàng ứng dụng PCR trong chẩn ñoán, chỉ cần thực hiện trong các hood làm việc chuyên biệt ở trong cùng một phòng thí nghiệm, không nhất thiết phải thiết kế lại phòng thí nghiệm ñể có các phòng chuyên biệt như ñòi hỏi trước ñây nữa. Có thể nói giải pháp chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại bằng UNG ñã tạo cơ hội ñể các phòng thí nghiệm lâm sàng tại các quốc gia có thu nhập thấp thực hiện ñược ước mơ mà trước ñây họ không bao giờ nghĩ có thể làm ñược, ñó là ứng dụng ñược PCR trong chẩn ñoán. trò của m i (primers) Mồi là những ñoạn oligonucleotides dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổ sung với hai ñầu của ñoạn DNA mà người làm thí nghiệm muốn nhân bản. Mồi giữ vai trò quyết ñịnh ñể polymerase tổng hợp ñược sợi bổ sung vì ñể có thể trượt ñược trên sợi khuôn tổng hợp sợi bổ sung, polymerase phải nhận diện ñược nucleotide ở ñầu 3’ của mồi bắt cặp ñược Hình 4: Hình vẽ minh họa cơ chế hoạt ñộng chống ngoại nhiễm của UNG (1) Nhờ sử dụng PCR mix có dUTP và UNG mà sản phẩm khuếch ñại ñược ñánh dấu khác biệt với DNA ñích: nhiều vị trí T ñược thay bằng U. (2) Nếu sản phẩm khuếch ñại ngoại nhiễm vào PCR mix mới thì sẽ bị enzyme UNG phá hủy vì UNG sẽ nhận diện U sẽ cắt bỏ U nhờ trước khi chạy PCR chúng ta luôn ủ PCR mix ở 40 o C trong 10 phút là nhiệt ñộ hoạt ñộng tối hảo của UNG. (3) Sau thời gian ủ 40 o C/10 phút, PCR mix vào các chu kỳ nhiệt của PCR, sản phẩm khuếch ñại ngoại nhiễm sẽ không tham gia ñược vào quá trình khuếch ñại vì sẽ bị nát vụn khi bị biến tính, ñồng thời enzyme UNG cũng bị bất hoạt ở các giai ñọan nhiệt ñộ biến tính của PCR, sản phẩm khuếch ñại từ DNA ñích lại bị ñánh dấu bằng nhiều vị trí T bị thay bởi U vì PCR mix luôn có dUTP. ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG PhântửDNA ñích luôncó T Sảnphẩmkhuếch ñại có T bị thaybởiU ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG PhântửDNA ñích luôncó T PhântửDNA ñích luôncó T Sảnphẩmkhuếch ñại có T bị thaybởiU ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG 40 o C trong10min PhântửDNA ñích luôncó T Sảnphẩmkhuếch ñạingoại nhiễmcó T bị thaybởiU DNA ñíchkhôngbị UNG phávìkhôngcóU U trongsảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmbịcắtbỏbởiUNG ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG 40 o C trong10min ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG 40 o C trong10min PhântửDNA ñích luôncó T PhântửDNA ñích luôncó T Sảnphẩmkhuếch ñạingoại nhiễmcó T bị thaybởiU DNA ñíchkhôngbị UNG phávìkhôngcóU DNA ñíchkhôngbị UNG phávìkhôngcóU U trongsảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmbịcắtbỏbởiUNG U trongsảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmbịcắtbỏbởiUNG DNA ñíchvẫncòn nguyênvẹnsẽthamgia giai ñoạnPCR Sảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmsẽbịphá huỷởgiai ñoạnbiếntính nick nick PCR mix chứa dUTP and UNG 30X-40X 94oC/30s-1min 55-60oC/30s-1min 72oC/30s-1min UNG bị bấthoạt ở nhiệt ñộ biếntính Sảnphẩmkhuếch ñạilại có T bị thaybởiU DNA ñíchvẫncòn nguyênvẹnsẽthamgia giai ñoạnPCR DNA ñíchvẫncòn nguyênvẹnsẽthamgia giai ñoạnPCR Sảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmsẽbịphá huỷởgiai ñoạnbiếntính nick nick Sảnphẩmkhuếch ñại ngoạinhiễmsẽbịphá huỷởgiai ñoạnbiếntính nick nick PCR mix chứa dUTP and UNG 30X-40X 94oC/30s-1min 55-60oC/30s-1min 72oC/30s-1min PCR mix chứa dUTP and UNG 30X-40X 94oC/30s-1min 55-60oC/30s-1min 72oC/30s-1min UNG bị bấthoạt ở nhiệt ñộ biếntính UNG bị bấthoạt ở nhiệt ñộ biếntính Sảnphẩmkhuếch ñạilại có T bị thaybởiU (1) (2) (3) 15 với một nucleotide ở sợi khuôn ( 5). Nếu không có mồi hay nucleotide ở ñầu 3’ của mồi không bắt cặp ñược với một nucleotide trên sợi khuôn thì polymerase không nhận diện ñược ñầu 3’ của mồi, không thể trượt ñược trên sợi khuôn ñể tổng hợp ñược sợi bổ sung (hình 6). Do vậy có thể nói mồi ñóng vai trò quyết ñịnh tính ñặc hiệu của PCR ñể nhân bản một ñoạn DNA ñặc hiệu nào ñó. Vd: Muốn chẩn ñoán lao bằng PCR thì phải thiết kế cho ñược cặp mồi chỉ bắt cặp ñược một ñoạn DNA ñặc hiệu chỉ có trên bộ gene DNA của vi khuẩn lao mà không có trên các vi khuẩn khác và cả DNA từ cơ thể vật chủ. Để cho mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn ñặc hiệu trên sợi khuôn thì phải duy trì giai ñoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt ñộ tối hảo cho sự bắt cặp của mồi, gọi là nhiệt ñộ bắt cặp (Ta), thường thấp hơn nhiệt ñộ chảy (Tm) của mồi khoảng 10 o C. Nhiệt ñộ chảy phụ thuộc rất nhiều vào chiều dài và nhất là phụ thuộc vào tỷ lệ G và C trong thành phần của mồi, do vậy muốn mồi có Ta cao, phải thiết kế mồi sao cho có tỷ lệ G và C cao. Để thiết kế ñược mồi, người làm thí nghiệm có thể sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi (ví dụ phần mềm Primer Premier 5.0). Phần mềm này sẽ dò trên trình tự DNA ñích ñược ñưa vào ñể tự ñộng lựa chọn các cặp mồi tối ưu theo các thông số mà người làm thí nghiệm mong muốn (ví dụ: chiều dài của mồi, Ta của mồi, chiều dài sản phẩm khuếch ñại ). Trình tự DNA ñích ñược ñưa vào có thể là trình tự của gene ñích Hình 5: Polymerase nhận diện ñược nucleotide ở ñầu 3’ của mồi bắt cặp với nucleotide ở sợi khuôn nên trượt ñược trên sợi khuôn ñể tổng họp sợi bổ sung Hình 6: M ộ t khi nucleotide ở ñầu 3’ của mồi không bắt cặp ñược với nucleotide trên sợi bồ sung thì polymerase sẽ không nhận diện ñược nên không thể trượt ñược trên sợi khuôn ñể tổng họp sợi bổ sung 16 hay ñoạn DNA ñích tải từ ngân hàng dữ liệu gene, hay từ kết quả nghiên cứu giải trình tự của ñoạn gene mà người làm thí nghiệm quan tâm. Người làm thí nghiệm cũng có thể dùng phần mềm thiết kế mồi ñể tự dò trên trình tự DNA ñích và lựa chọn cặp mồi theo các thông số mà mình mong muốn, ñặc biệt là các thông số như nhiệt ñộ bắt cặp mồi là bao nhiêu và chiều dài sản phẩm khuếch ñại mà mình mong muốn là bao nhiêu. Sau khi ñã có ñược các trình tự của các cặp mồi, người làm thí nghiệm phải blast search với các trình tự DNA có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI ñể xác ñịnh các trình tự mồi thiết kế là ñặc hiệu cao với DNA ñích. pha PCR mix Thể tích của một PCR mix = Thể tích phản ứng – Thể tích mẫu ñược cho vào. Ví dụ nếu thể tích phản ứng chúng ta muốn pha là 50 µl và thể tích mẫu cho vào là 10 µl, thì thể tích một PCR mix sẽ phải là 40 µl. Một PCR mix thông thường chứa các thành phần ñược liệt kê sau ñây:  PCR buffer 1X ñược pha từ PCR 10X (Tris HCl 100 mM và KCl 500 mM).  MgCl 2 có thể từ 1.5 mM ñến 5 mM tùy thăm dò ñể xác ñịnh nồng ñộ tối ưu.  Mồi xuôi và mồi ngược có thể từ 10 pm ñến 50 pm cho một thể tích phản ứng.  polymerase có thể từ 1.25 U ñến 2.5 U tùy nhà sản xuất.  dNTP với nồng ñộ 200 µM cho từng loại.  Nếu muốn chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại thì thêm dUTP ñạt nồng ñộ 200 µM và UNG với hàm lượng 0.1 ñến 1U cho một thể tích phản ứng. Để pha ñược PCR mix, người làm thí nghiệm phải chuẩn bị tất cả mọi thuốc thử và dụng cụ cần thiết trong một hood sạch, tốt nhất là một clean bench, ñặt trong một phòng tách biệt với phòng làm xét nghiệm PCR. Các dụng cụ ñược sử dụng như các micropipette, ñầu micropipette, các tube, chai phải chuyên biệt không ñược mang ra khỏi phòng cũng như ñem từ các phòng thí nghiệm khác vào. Các thuốc thử phải ñược giữ lạnh hay giữ ñông trong các tủ lạnh hay tủ ñông chuyên biệt trong phòng. Phải dùng nước khử ion tuyệt ñối ñạt chất lượng 18.2 mega-Ohm và khử trùng ñể pha các PCR mix. Phải dùng các micropipette tuyệt ñối chính xác ñể pha các PCR mix và các micropipette này phải ñược lau sạch bằng cồn và ñể khô trong clean bench trước và sau khi dùng. Nên sử dụng các ñầu micropipette có lọc ñược sản xuất bởi các hãng có tiếng về chất lượng 17 (như Eppendorf, Greiner, Axygen ) vì các ñầu micropipette này không bị bám nước bên trong thành khi lấy các thể tích dung dịch. Trước khi tiến hành pha PCR mix, các thuốc thử phải ñược giữ trong các giá giữ lạnh hay các giá ñặt trong các hộp ñựng ñá bào. Các thuốc thử cần phải rã ñông sẽ ñể chúng tự rã ñông trong ñá bào hay trong các giá lạnh. Người làm thí nghiện không nên pha chỉ một PCR mix vì phải lấy một số thuốc thử với thể tích dưới 1 µl, và như vậy thì sẽ khó chính xác. Do vậy, nên pha một master mix với tối thiểu 5 hay 10 PCR mix. Tính toán như thế nào ñể thể tích thuốc thử ñược lấy sẽ không có số lẻ của µl. Nên lập một bảng như minh họa trong ả 1 dưới ñây ñể tính toán và kiểm soát không ñể thiếu các thành phần ñược cho vào ñể pha một PCR master mix. Bng 1: Bảng ñược thiết lập trước khi pha một master mix cho 100 PCR mix với thể tích phản ứng là 25 µl và thể tích mẫu cho vào PCR mix là 5 µl. STT Thành phần gốc Nồng ñộ hay hàm lượng gốc Nồng ñộ hay hàm lượng trong 1 thể tích pứ Nồng ñộ hay hàm lượng trong 100 thể tích phản ứng Thể tích phải lấy ñể pha master mix 1 PCR buffer 10X* 10X 1X 1X 250µl 2 MgCl 2 50mM 1.5mM 1.5mM 75µl** 3 Taq polymerase 5U/µl 1.25U 125U 25µl 4 dNTP 25mM/each 200µM/each 200µM/each 20µl** 5 Mồi xuôi 100pm/µl 10pm 1000pm 10µl 6 Mồi ngược 100pm/µl 10pm 1000pm 10µl 7 dUTP 100mM 200µM 200µM 5µl 8 UNG 1U/µl 1U 100U 100µl 9 Nước khử ion Cho ñủ (qsp) 20µl Cho ñủ (qsp) 2000µl 1505µl *Nếu PCR 10X ñược cung cấp có sẵn MgCl 2 15 mM thì sẽ không thêm MgCl 2 vào nữa vì nồng ñộ MgCl 2 ñòi hỏi ở ñây chỉ 1.5 mM. Nhưng nếu nồng ñộ MgCl 2 ñòi hỏi trên 1.5 mM thì phải thêm MgCl 2 vào. **Được tính toán theo công thức CV = C’V’, với C là nồng ñộ gốc, V là thể tích gốc cần phải lấy, C’ là nồng ñộ cần phải pha, và V’ là tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ này là 2500 µl, tổng thể tích của 100 phản ứng, mỗi phản ứng 25 µl). Sau khi ñã pha, vẫn giữ master mix trong ñá bào, lấy một ít PCR mix cho vào tube PCR ñể thực hiện kiểm tra chất lượng PCR master mix ñược pha xem có ñạt ñộ nhạy mong muốn hay không (ñược trình bày trong phần kế tiếp). Nếu kết quả ñạt, phân nhỏ PCR master mix ñã pha thành từng thể tích PCR mix cho vào các tube PCR ñược ñặt sẵn trên các giá lạnh hay các giá ngâm trong ñá bào. Sau khi ñã phân thành các PCR mix, ñậy chặt các nắp tube PCR lại và giữ trong tủ ñông -18 o C ñến -30 o C (không nên giữ -70 o C vì sẽ làm cho enzyme polymerase trong PCR mix bị hỏng) cho ñến khi ñưa vào sử dụng. Thời gian giữ ñược PCR mix bao lâu là tùy thuộc rất nhiều vào chất lượng các 18 thuốc thử ñược dùng ñể pha PCR master mix, kể cả chất lượng nước khử ion. Do vậy người làm thí nghiệm, nếu muốn pha nhiều PCR mix ñể dùng dần, thì phải thường xuyên kiểm tra ñộ nhạy của PCR mix ñể biết ñược thời gian lưu trữ các PCR mình ñã pha. Người làm thí nghiệm cũng có thể pha sẵn PCR master mix 2X (ñậm ñặc 2 lần) chưa có mồi, MgCl 2 , dUTP và UNG, rồi phân nhỏ vào các tube sạch, mỗi tube có thể dùng ñể pha các master mix 50 hay 100 PCR mix, giữ ở tủ ñông -18 o C ñến -30 o C ñể dùng dần. Bả 2 dưới ñây hướng dẫn các pha PCR master mix 2X cho 2000 PCR mix.  2: Bảng hướng dẫn cách pha một PCR master mix 2X cho 2000 PCR mix với thể tích phản ứng là 25 µl. STT Thành phần gốc Nồng ñộ hay hàm lượng gốc Nồng ñộ hay hàm lượng trong 1 thể tích pứ Nồng ñộ hay hàm lượng trong 2000 thể tích phản ứng Thể tích phải lấy ñể pha master mix 1 PCR buffer 10X* 10X 2X 2X 5.000µl 3 Taq polymerase 5U/µl 1.25U 125U 500µl 4 dNTP 25mM/each 200µM/each 200µM/each 400µl** 9 Nước khử ion Cho ñủ (qsp) 12.5µl Cho ñủ (qsp) 25.000µl 19.100µl *Nếu PCR 10X ñược cung cấp có sẵn MgCl 2 15mM thì PCR master mix 2X ñược pha sẽ có sẵn 3 mM. **Được tính toán theo công thức CV = C’V’, với C là nồng ñộ gốc, V là thể tích gốc cần phải lấy, C’ là nồng ñộ cần phải pha, và V’ là tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ này là 25.000 µl, tổng thể tích của 2000 phản ứng, mỗi phản ứng 12.5 µl). Bng 3: Bảng ñược thiết lập trước khi pha một PCR master mix từ PCR master mix 2X ñể sau ñó phân thành 100 PCR mix với thể tích phản ứng là 25 µl và thể tích mẫu cho vào PCR mix là 5 µl. STT Thành phần gốc Nồng ñộ hay hàm lượng gốc Nồng ñộ hay hàm lượng trong 1 thể tích pứ Nồng ñộ hay hàm lượng trong 100 thể tích phản ứng Thể tích phải lấy ñể pha master mix 1 PCR master mix 2X* 2X 1X 1X 1250µl 2 MgCl 2 50mM 1.5mM 1.5mM 75µl** 5 Mồi xuôi 100pm/µl 10pm 1000pm 10µl 6 Mồi ngược 100pm/µl 10pm 1000pm 10µl 7 dUTP 100mM 200µM 200µM 5µl 8 UNG 1U/µl 1U 100U 100µl 9 Nước khử ion Cho ñủ (qsp) 20µl Cho ñủ (qsp) 2000µl 550µl *Nếu PCR master mix 2X ñược cung cấp có sẵn MgCl 2 3 mM thì sẽ không thêm MgCl 2 vào nữa vì nồng ñộ MgCl 2 ñòi hỏi ở ñây chỉ 1.5mM. Nhưng nếu nồng ñộ MgCl 2 ñòi hỏi trên 1.5 mM thì phải thêm MgCl 2 vào. **Được tính toán theo công thức CV = C’V’, với C là nồng ñộ gốc, V là thể tích gốc cần phải lấy, C’ là nồng ñộ cần phải pha, và V’ là tổng thể tích phản ứng (trong ví dụ này là 2500 µl, tổng thể tích của 100 phản ứng, mỗi phản ứng 25 µl). Bảng 3 minh họa một cách pha PCR master mix 1X từ PCR master mix 2X ñã pha sẵn này (nếu không muốn tự pha, có thể mua từ các nhà sản xuất có uy tín). Người làm thí nghiệm có thể pha các PCR mix ñể sử dụng bằng cách thêm mồi, MgCl 2 , dUTP, UNG và bổ sung thêm nước khử ion vào. [...]... ph i m tube PCR vũng trong ủ cho s n ph m PCR vũng ngoi vo DNA ủớch DNA ủớch M i Fout M i Rout M i Fout M i Rout PCR vũng ngoi PCR vũng ngoi S n ph m PCR vũng ngoi S n ph m PCR vũng ngoi S n ph m PCR vũng ngoi S n ph m PCR vũng ngoi M i Fin M i Rin M i Fout PCR vũng trong M i Rin PCR vũng trong (1) (2) S n ph m PCR vũng trong S n ph m PCR vũng trong Hỡnh 10: Minh h a nguyờn t c (1) nested PCR v (2) semi-nested/hemi-nested... nested PCR v (2) semi-nested/hemi-nested PCR 4 PCR t khụng d ng (non-stop nested PCR) L PCR t nhng ủ c thi t k ủ c hai giai ủo n PCR vũng ngoi v PCR vũng trong ủ u ủ c th c hi n trong cựng m t tube PCR nh v y m sau khi hon t t PCR vũng ngoi thỡ ch y ti p chng trỡnh PCR vũng trong ch khụng c n d ng l i nh s n ph m khu ch ủ i c a PCR vũng ngoi tr thnh b n g c cho PCR vũng trong ngay trong cựng tube ph... i 20 1 PCR ủn m i (monoplex PCR) Chớnh l PCR kinh ủi n nh t ch s d ng cú m t c p m i ủ c hi u ủ khu ch ủ i m t ủo n DNA ủớch ủ c hi u t vi sinh v t M iF mu n ủ c phỏt hi n Vớ d PCR phỏt hi n M iR PCR HBV s d ng c p m i ủ c hi u m t ủo n DNA trờn gene S c a virus viờm gan B  Hỡnh 8 theo ủõy minh h a nguyờn t c c a 8: Minh h a nguyờn t c PCR ủn m i PCR ủn m i 2 PCR ủa m i (multiplex PCR) L PCR s d... c PCR ủa m i DNA ủớch c a tỏc nhõn vi sinh A M i FA DNA ủớch c a tỏc nhõn vi sinh B M i FB M i RA PCR M i RB PCR Hỡnh 9: Minh h a nguyờn t c PCR ủa m i phỏt hi n hai tỏc nhõn vi sinh cựng m t lỳc 3 PCR t (nested PCR) L PCR cú hai giai ủo n: giai ủo n ủ u l PCR dựng m t c p m i ngoi (g i l PCR vũng ngoi) ủ khu ch ủ i m t ủo n DNA trong ủú cú ch a cỏc trỡnh t ủ c hi u mu n tỡm, sau ủú dựng s n ph m PCR. .. vũng ngoi ny lm khuụn cho vo ng PCR cú c p m i trong (g i l PCR vũng trong) ủ khu ch ủ i trỡnh t ủ c hi u mu n tỡm ny 21 ( 10-1) Ngoi nested PCR, cũn cú semi-nested hay hemi-nested PCR l bi n th c a nested PCR v i m t m i vũng ngoi ủ c dựng lm m t trong hai m i c a c p m i vũng trong (hỡnh 10-2) u ủi m c a nested PCR (v c semi-nested hay hemi-nested PCR) l lm tng ủ nh y c a PCR khi m m i cho trỡnh t ủ... non-stop nested PCR, nh DNA ủớch M i Fout nghiờn c u ph i thi t k m i vũng ngoi sao PCR vũng ngoi cho cú nhi t ủ b t c p cao hn 8 C ủ n 10oC so v i m i vũng trong ủ khi ch y o S n ph m PCR vũng ngoi M i Fin PCR vũng ngoi v i nhi t ủ b t c p thớch M i Rin PCR vũng trong o Ta vũng trong < Ta vũng ngoi 8-10 C h p cho PCR vũng ngoi s khụng cú s b t c p c a m i PCR vũng trong lờn DNA ủớch; S n ph m PCR vũng trong... c hi n RT -PCR ú l phng phỏp RT -PCR hai b c, v phng phỏp RT -PCR m t b c )p Trong 01 phỏp RT -PCR hai b c, ng i lm thớ nghi m th c hi n giai ủo n RT ủ t ng h p cDNA trong m t ng nghi m, sau ủú l y s n ph m cDNA cho vo ng nghi m PCR ch a PCR mix v i m i ủ c hi u ủ ch y giai ủo n PCR khu ch ủ i trỡnh t DNA ủớch mu n tỡm Phng phỏp ny s cú nguy c ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i do ph i m n p tube PCR ủ cho... qu ki m tra ch t l ng PCR mix phỏt hi n HBV (HBV -PCR mix, bờn trỏi) ủ c trờn ủi n di agarose v PCR mix phỏt hi n M tuberculosis (MTB -PCR mix, bờn ph i) ủ c trờn di n di b ng chip bio-analyzer c a Agilent Khi lm ki m tra ch t l ng, luụn luụn so sỏnh gi a PCR mix m i s n xu t v i PCR mix ủó s n xu t v ủang dựng ủ xem ch t l ng cú tng ủng khụng DNA ủớch ủ ki m tra ch t l ng HBV -PCR mix l dung d ch plasmid... UNG vo PCR mix c a giai ủo n PCR Trong phng phỏp RT -PCR mSt b c, ng i lm thớ nghi m th c hi n c hai giai ủo n RT v giai ủo n PCR trong cựng m t ng ph n ng, ngha l sau khi cho tỏch chi t RNA t m u th vo ng ph n ng, giai ủo n RT s ủ c th c hi n tr c v sau ủú giai ủo n PCR s ủi li n theo sau th c hi n ủ c RT -PCR m t b c, trong ng ph n ng ph i cú ủ cỏc thnh ph n húa ch t v thu c th ủ ch y RT v PCR, t... i quy t ủ c 23 6 RT -PCR L phng phỏp PCR m nucleic acid ủớch c n ph i phỏt hi n l RNA cú th th c hi n ủ c PCR ny thỡ tr c h t RNA ủớch ph i ủ c phiờn mó ng c (RT, reverse transcription) thnh cDNA, r i sau ủú s dựng PCR ủ khu ch ủ i trỡnh t ủớch trong cDNA b ng c p m i ủ c hi u cho trỡnh t ny Vỡ ph i th c hi n hai giai ủo n RT r i m i ủ n PCR, nờn k thu t ny ủ c g i l k thu t RT -PCR Giai ủo n phiờn . phải mở tube PCR vòng trong ñể cho sản phẩm PCR vòng ngoài vào. 4. PCR tổ không dừng (non-stop nested PCR) Là PCR tổ nhưng ñược thiết kế ñể cả hai giai ñoạn PCR vòng ngoài và PCR vòng trong. nested PCR và (2) semi-nested/hemi-nested PCR Mồi F out Mồi R out DNA ñích PCR vòng ngoài Mồi F in Mồi R in PCR vòng trong Sản phẩm PCR vòng ngoài Sản phẩm PCR vòng ngoài Sản phẩm PCR. thaybởiU ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG PhântửDNA ñích luôncó T PhântửDNA ñích luôncó T Sảnphẩmkhuếch ñại có T bị thaybởiU ChạyPCR vớiPCR mix chứa dUTP vàUNG 40 o C