Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng , phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái

Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng , phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái

Bộ nôgn nghiệp và phát triển nông thôn Viện thổ nhưỡng nông hóa

Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước

nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng

phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái

D1-1-ĐGMOI

Bản tự đánh giá

Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới Của đề tài KHCN cấp nhà nước

(Kèm theo quyết định số 13/2004/QĐ-BKHCN ngày 25/5/2004 của Bộ trưởng Bộ Khoa học và công nghệ )

1 Tên Dự án: Nghiên cứa sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái Mã số: KC.04.DA11

2 Thuộc chương trình: Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học 3 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phạm Văn Toản

ThS Lương Hữu Thành 4 Cơ quan chủ trì: Viện Thổ nhưỡng Nông hoá 5 Thời gian thực hiện: 6/2005- 6/2007

6 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 6.400,000 triệu đồng Trong đó, kinh phí từ NSNN: 1.959,985 triệu đồng 7 Tình hình thực hiện Dự án so với hợp đồng

7.1 Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc

So với hợp đồng đã ký kết giữa Bộ KHCN, Ban chủ nhiệm chương trình KC.04 và cơ quan chủ trì Dự án, Dự án đã hoàn thành tốt tất cả các nội dung chính sau:

- Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm ở qui mô công nghiệp - Hoàn thiện qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng - Sản xuất thử nghiệm 8.000 tấn phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng - Xây dựng 6 mô hình trình diễn hiệu quả của phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng

Tổng hợp kết quả thực hiện dự ỏn KC04.DA11

Số lượng TT

Tờn sản phẩm và chỉ tiờu chất lượng chủ yếu Theo hợp đồng

Thực hiện

Mức độ thức hiện so với

hợp đồng 1 Chủng vi sinh vật đa hoạt tớnh (cố định nitơ,

phõn giải lõn, đối khỏng vi sinh vật gõy bệnh vựng rễ cõy trồng cạn

10 11 Vượt

2 Quy trỡnh cụng nghệ sản xuất chế phẩm vi 1 1 Đạt

sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm ở quy mô công nghiệp tạo sản phẩm có mật độ vi sinh vật đa hoạt tính đạt 109 CFU/g chế phẩm

3 Quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng được áp dụng tại cơ sở sản xuất

chức năng qui mô 1-5 ha/mô hình

6 9 Vượt 6 Cơ sở sản xuất sử dụng công nghệ của dự án 1-2 5 Vượt

9 Đào tạo cán bộ và công nhân kỹ thuật sản xuất phân hữu cơ VSV chức năng

26 Vượt 10 Tập huấn nông dân kỹ thuật sử dụng phân

hữu cơ VSV chức năng

Chñ nhiÖm Dù ¸n

PGS.TS Ph¹m V¨n To¶n ThS L−¬ng H÷u Thµnh

1

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Dự án SXTN: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh đa

chủng, đa chức năng ứng dụng cho cây trồng qui mô công nghiệp; mã số

KC.04.DA11 thuộc chương trình “Nghiên cứu khoa học và phát triển công

nghệ sinh học KC.04” được đặt ra với mục đích: Hoàn thiện công nghệ sản

xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp cho một số cây trồng trên vùng sinh thái và tổ chức chuyển giao công nghệ, ứng dụng vào sản xuất nhằm tạo mô hình sản xuất và sử dụng hỗn hợp vi sinh vật nhiều chức năng như một loại phân bón có tác dụng nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, tiết kiệm phân hoá học, đồng thời có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng do nấm và vi khuẩn gây nên, góp phần phát triển nông phẩm an toàn

Dự án được thực hiện trong 2 năm (24 tháng) từ tháng 5 năm 2005 đến tháng 6 năm 2007 với tổng số kinh phí là 6.400 triệu đồng, trong đó, từ ngân sách sự nghiệp khoa học: 2.200 triệu đồng (năm 2006 không thực hiện vì không có kinh phí) Dưới đây là một số thông tin chung về dự án:

1 Tên dự án: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh đa chủng, đa

chức năng ứng dụng cho cây trồng qui mô công nghiệp

2 Thuộc chương trình KHCN cấp nhà nước: Nghiên cứu khoa học và phát

triển Công nghệ sinh học

2

10 Cơ quan phối hợp chính:

- Liên hiệp khoa học & sản xuất CNSH-MT, Viện KH&CN Việt Nam - Trung tâm CNSH, Viện Hoá học công nghiệp

- Trung tâm Nghiên cứu & Thực nghiệm đậu đỗ, Trung tâm Chuyển giao & Khuyến nông, Trung tâm cây có củ, Viện KHKTNNVN (nay là Viện cây lương thực và cây thực phẩm

- Viện Bảo vệ thực vật

- Công ty TNHH Hữu cơ, Đông Hoà, Dĩ An, Bình Dương, - Công ty sinh hoá hữu cơ Polyfa, Buôn Mê Thuột, Đắc Lắc - Công ty Thiên Sinh, chi nhánh phía Bắc; Gia Lâm, Hà Nội

- Trung tâm ứng dụng Khoa học và Công nghệ, Sở KH&CN tỉnh Đăklăk - Công ty Cổ phần đầu tư khai thác mỏ

11 Danh sách cá nhân chính tham gia dự án

5 Cao Thanh Tâm CN Bộ môn VSV, Viện TNNH 6 Đào Văn Thông ThS Bộ môn VSV, Viện TNNH 7 Phạm Bích Hiên ThS Viện Khoa học nông nghiệp VN 8 Phạm Việt Cường TS Liên hiệp KH&SX CNSH-MT

KC.04.04 (2001-2004) : “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV đa

chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (Viện

KHKTNNVN) chủ trì đã được Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn công nhận, đưa vào áp dụng trong sản xuất (Quyết định 2421/QĐ/BNN-KHCN ngày 17/8/2004 và kết quả nghiên cứu triển khai của đề tài KHCN.02.06B giai

đoạn 1999-2000: Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm phân

bón VSV hỗn hợp phục vụ phát triển nông, lâm nghiệp bền vững do Viện

KHKTNNVN chủ trì đã được nghiệm thu ngày 20/3/2001 đạt mức xuất sắc Dự án cũng được xây dựng trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu triển khai các đề tài khoa học cấp Nhà nước do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) chủ trì giai đoạn 1991 -1998 đó là:

3

- Đề tài KH cấp Nhà nước KHCN.02.06A (1996-1998): Nghiên cứu áp dụng

các giải pháp công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón VSV cố định nitơ, phân giải lân trong nông lâm nghiệp do Viện

KHKTNNVN chủ trì, đã được nghiệm thu ngày 20/4/1999 đạt mức xuất sắc - Đề tài KH cấp Nhà nước KC.08.01 (1991-1995): Nghiên cứu công nghệ sản

xuất và ứng dụng phân VSV cố định nitơ nhằm nâng cao năng suất lúa và cây trồng cạn do Viện KHKTNNVN chủ trì, được nghiệm thu ngày 10/01/1996

đạt mức xuất sắc

- Đề án lưu giữ nguồn gen VSV nông nghiệp thuộc chương trình hàng năm của Bộ Khoa học & Công nghệ về công tác thu thập, tuyển chọn và lưu giữ nguồn gen cây trồng, vật nuôi và VSV do Viện KHKTNNVN chủ trì Hiện nay quĩ gen VSV nông nghiệp đang bảo quản lưu giữ trên 600 chủng VSV sử dụng cho công tác nghiên cứu triển khai phân bón VSV, thuốc bảo vệ thực vật sinh học, chế phẩm VSV cải tạo môi trường, và chuyển đổi sinh học và được bổ sung hàng năm thêm hàng trăm chủng, giống VSV mới từ nhiều nguồn khác nhau Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng cho việc nghiên cứu phát triển các

sản phẩm VSV sử dụng trong sản xuất nông nghiệp

13 Nội dung chính của Dự án

13.1 Xây dựng, thử nghiệm và hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc qui mô công nghiệp

- Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV vật đa chủng, chức năng đậm đặc từ tổ hợp các VSV cố định đạm, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp nuôi cấy chìm ở qui mô công nghiệp (công suất 1500 lít/mẻ)

- Sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc

- Đánh giá chất lượng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng, đậm đặc Nghiên cứu xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng chế phẩm VSV đa chủng, chức

năng đậm đặc

13.2 Sản xuất thử nghiệm và phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất trên trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc và cơ chất hữu cơ đã xử lý

- Phối hợp với các đơn vị liên doanh, liên kết xây dựng qui trình xử lý cơ chất hữu cơ làm chất mang cho phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng - Đào tạo, tập huấn cán bộ kỹ thuật tại đơn vị liên doanh, liên kết, phối hợp

sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc và cơ chất hữu cơ đa xử lý

- Nghiên cứu đánh giá khả năng sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng đối với cây trồng tại một số vùng sinh thái

4

- Phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng và ứng dụng sản phẩm trên diện tích 2000 ha/năm tương đương với 8.000 tấn phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trong 2 năm

- Tổ chức khuyến cáo và mở rộng qui mô sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng cho các đối tượng cây trồng thông qua các mô hình trình diễn tại các vùng sinh thái khác nhau

13.3 Đào tạo bồi dưỡng đội ngũ cán bộ, công nhân kỹ thuật

- Đào tạo nâng cao trình độ cho 2 cán bộ khoa học về qui trình công nghệ sản xuất phân vi sinh vật đa chủng, chức năng qui mô công nghiệp làm hạt nhân cho việc triển khai công nghệ tại cơ quan chủ trì dự án và đơn vị phối hợp, liên doanh, liên kết dự án

- Đào tạo nâng cao tay nghề cho 5 công nhân kỹ thuật tham gia nghiên cứu triển khai sản xuất phân VSV đa chủng, chức năng tại cơ quan chủ trì dự án, đơn vị phối hợp và liên doanh, liên kết của dự án về kỹ thuật sản xuất, kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm tạo ra, đồng thời tổ chức các hoạt động nhằm mở rộng thông tin khoa học về sản phẩm phân VSV đa chủng, chức năng cho đội ngũ cán bộ kỹ thuật tại cơ sở sản xuất và địa phương

- Tập huấn nông dân về kỹ thuật sử dụng, hỗ trợ thử nghiệm và xây dựng mô hình trình diễn hiệu quả phân VSV đa chủng, chức năng tại cơ sở sản xuất và sử dụng sản phẩm

14 Sản phẩm của Dự án

Sản phẩm của dự án theo hợp đồng số DA11 và hợp đồng số: 11/2006/HĐ-DA ký kết giữa Bộ Khoa học và Công nghệ và Cơ quan chủ trì và chủ nhiệm dự án như bao gồm:

lượng

Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

Ghi chú

1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm ở quy mô công nghiệp

01 10 chủng VSV đa hoạt tính,

Chế phẩm có mật độ VSV đa hoạt tính ≥ 109 CFU/g 2 Quy trình sản xuất phân hữu

cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng

01 Qui trình được áp dụng tại 1-2 cơ sở sản xuất

3 Phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng

8.000 tấn

- Sử dụng cho một số đối tượng cây trồng

- Mật độ VSV: 106 CFU/g 4 Mô hình trình diễn hiệu quả

của phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng ở mộ số vùng sinh thái

6 mô hình

Qui mô 1-5 ha/mô hình

5

PHẦN 2: KẾT QUẢ HOẠT ĐỘNG DỰ ÁN

I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Hiệu quả của VSV trong việc làm tăng khả năng sinh trưởng phát triển cây trồng, tiết kiệm phân bón hoá học cũng như tăng năng suất, chất lượng nông sản đã được khẳng định trong nhiều công trình nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới (5, 7, 13, 14, 20, 21, 25, 30) Các sản phẩm vi sinh như phân bón VSV cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, chế phẩm VSV kích thích sinh trưởng thực vật, chế phẩm VSV phòng trừ bệnh cây trồng đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp bền vững VSV tác động đến cây trồng trực tiếp hoặc gián tiếp Sự tác động trực tiếp của VSV đến cây trồng thể hiện qua sự tổng hợp, khoáng hoá hoặc chuyển hoá các chất dinh dưỡng xảy ra trong quá trình chuyển hoá vật chất của VSV như quá trình cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp auxin, giberellin, etylen, v.v Những vi khuẩn này có khả năng giúp cây trồng tăng khả năng huy động và dễ dàng sử dụng các nguồn dinh dưỡng từ môi trường Tác động gián tiếp đến sinh trưởng của cây trồng xảy ra khi các chủng VSV có khả năng làm giảm bớt hoặc ngăn chặn các ảnh hưởng có hại từ môi trường hoặc từ các VSV bất lợi đối với thực vật, trong đó VSV có thể cạnh tranh dinh dưỡng với VSV bất lợi hoặc sinh tổng hợp các chất có tác dụng trung hoà, phân huỷ, chuyển hoá các tác nhân có hại hoặc tiêu diệt, ức chế các VSV bất lợi Mỗi loại VSV trong tự nhiên có thể có 1 hoặc cả 2 tác động nêu trên đối với cây trồng (1, 2, 3, 9, 10, 11, 16, 23, 26, 29, 32, 35)

Kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ, Canada, Nga, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật cho thấy sử dụng chế phẩm VSV có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30 - 60 kg N/ha/năm hoặc thay thế 1/2 - 1/3 lượng lân vô cơ bằng quặng photphat Dịch nuôi cấy các VSV sinh tổng hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật như Azotobacter, Azospirilum, Rhizobium…có thể cung cấp 10-20 µgIAA/ml hoặc 20 µg GA3/ml do đó làm tăng khả năng nảy mầm, ra rễ của hạt giống, tăng khả năng phân chia mô tế bào, kích thích hoặc kìm hãm sự nở hoa, tăng khả năng sinh trưởng và năng suất củ quả và tăng tính chống chịu hạn Một số chất kháng sinh như Agrocin 84, Agrocin 434, Phenazines, Pyoluteorin…được sinh ra bởi Agrobacterium, Pseudomonas và Bacillus…có khả năng hạn chế bệnh tua mực ở cây quế, bệnh trụi ngọn ở cam chanh, bệnh héo xanh vi khuẩn, bệnh thối rễ do nấm ở cây họ cà và cây đậu đỗ

Tuy nhiên do hệ VSV rất đa dạng và mỗi VSV trong đất đều chịu nhiều tác động qua lại của các VSV khác cũng như điều kiện môi trường nên hiệu quả của các sản phẩm vi sinh trong các điều kiện khác nhau không giống nhau Một số nghiên cứu gần đây ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đức, Nhật, Mỹ, Anh, Úc cho thấy sản phẩm tổng hợp bao gồm tập hợp các nhóm VSV cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng VSV gây bệnh vùng

Trong khuôn khổ các đề tài, dự án nghiên cứu & triển khai các đơn vị khoa học trong cả nước đã tiến hành các nghiên cứu về VSV có ích ( cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật…), trên cơ sở đó nghiên cứu sản xuất thành công một số loại phân bón VSV Các sản phẩm phân bón VSV đơn chủng (Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin ) hay đa chủng ( phân hỗn hợp từ VSV cố định nitơ và phân giải lân: Biomix, Humix…) đã thể hiện được tác dụng nâng cao hiệu quả sử dụng phân khoáng, tăng cường trao đổi chất trong cây và qua đó nâng cao năng suất, chất lượng nông sản và tăng thu nhập cho người nông dân Kết quả nghiên cứu triển khai các đề tài, dự án về phân bón VSV đơn chủng và đa chủng được hiện trong các công trình đã công bố (20, 21)

Bên cạnh các VSV có lợi các VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng tồn tại trong đất đã gây nhiều thiệt hại cho sản xuất nông, lâm nghiệp Năng suất cây trồng ở nhiều nơi đã bị giảm từ 20-100% Nhiều nghiên cứu ở Việt Nam đã chỉ

ra Pseudomonas solanacearum là tác nhân chính gây bệnh chết ẻo ở cà chua, dưa, lạc và Aspergillus niger, Macropholina phaseomina, Sclerotium rolfsii và

Fusarium là tác nhân gây bệnh lở cổ rễ và bệnh thối rễ ở cà phê, tiêu và điều

(8, 12, 15) Ngoài các kỹ thuật canh tác đến nay chưa có biện pháp phòng trừ nào có hiệu quả Các công trình nghiên cứu gần đây của Viện Bảo vệ Thực vật, Viện KHKTNNVN, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện CNSH, Viện Khoa học Lâm nghiệp.v.v đã chứng minh một số VSV có khả năng ức chế và tiêu diệt nhiều vi sinh vật gây bệnh Kết quả này đã tạo ra cơ sở ban đầu cho giải pháp phòng trừ sinh học các nguồn bệnh nguy hiểm này (21)

Sản xuất và ứng dụng hỗn hợp VSV cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ như một loại phân bón chức năng sử dụng trong sản xuất nông lâm nghiệp là kết quả nghiên cứu của Viện KHKTNNVN phối hợp cùng Viện CNSH – Viện KH&CN Việt Nam và Viện KH lâm nghiệp Kết quả nghiên cứu đã chứng minh phân VSV đa chủng, chức năng có tác dụng tiết kiệm phân khoáng, giảm thiểu thuốc bảo vệ thực vật hoá học và góp phần tích cực cho việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững Sản phẩm đã được nghiên cứu đánh giá trong phòng thí nghiệm, thử nghiệm ảnh hưởng trên một số đối tượng cây trồng ở qui mô chậu vại, nhà lưới, vườn ươm và khảo nghiệm đồng ruộng cả

7

diện hẹp và diện rộng Kết quả thử, khảo nghiệm cho thấy phân VSV đa chủng, chức năng có khả năng gia tăng sinh khối và năng suất cây trồng Sự tăng năng suất được xác nhận ngay cả khi giảm 10-30% lượng dinh dưỡng khoáng N,P Số liệu tổng kết kết quả khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng và mô hình trình diễn tại một số địa phương cho thấy phân VSV đa chủng chức năng có khả năng gia tăng sinh khối và năng suất cây trồng Sự tăng năng suất được xác nhận ngay cả khi giảm một phần dinh dưỡng khoáng (N,P) Kết quả khảo nghiệm cũng xác định phân vi sinh vật đa chủng không những đem lại lợi ích về mặt cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng mà còn có tác dụng tích cực trong việc hạn chế bệnh vùng rễ ở các cây trồng thử nghiệm Kết quả nghiên cứu cơ chế tác dụng, qui trình công nghệ sản xuất qui mô phòng thí nghiệm và hiệu lực của loại phân mới này đã được công bố trên nhiều tạp chí khoa học trong và ngoài nước, đặc biệt trong Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc tổ chức tại Hà Nội tháng 12 năm 2003 phân bón VSV đa chủng chức năng, sản phẩm của Viện KHKTNNVN kết hợp cùng Viện CNSH và Viện KHLN đã được Hội đồng Khoa học chuyên ngành Đất, Phân bón và Hệ thống nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp & PTNT kiến nghị công nhận tiến bộ kỹ thuật và áp dụng rộng trong sản xuất (21)

Với khuôn khổ một đề tài nghiên cứu khoa học trong thời gian qua các cán bộ khoa học của đề tài mới tập trung nghiên cứu nhằm chứng minh khả năng sử dụng hỗn hợp VSV đa chức năng làm phân bón và tổ chức xây dựng, triển khai qui trình công nghệ sản xuất ở qui mô nhỏ Trong thời gian qua, mặc dù có hiệu quả và được người sử dụng tín nhiệm, song phân bón VSV đa chủng, chức năng chỉ mới được sử dụng ở phạm vi hết sức khiêm tốn Nguyên nhân chính của hạn chế này là do chưa có qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp Nhằm đáp ứng nhu cầu của thực tế sản xuất và nhanh chóng đưa tiến bộ khoa học vào sản xuất, việc nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất phân VSV đa chủng, chức năng ở qui mô công nghiệp tạo sản phẩm mới và phát triển trên diện rộng là hết sức cần thiết

Mục tiêu của dự án là hoàn thiện công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp cho một số cây trồng trên vùng sinh thái và tổ chức chuyển giao công nghệ, ứng dụng vào sản xuất nhằm tạo mô hình sản xuất và sử dụng hỗn hợp vi sinh vật nhiều chức năng như một loại phân bón có tác dụng nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, tiết kiệm phân hoá học, đồng thời có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng do nấm và vi khuẩn gây nên, góp phần phát triển nông phẩm an toàn

II LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đã được nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot trong khuôn khổ của đề tài KC.04.04 Sản phẩm đã được thử nghiệm trên cây trồng cho hiệu quả tốt Từ chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đề tài đã phối

8

hợp với một số công ty để sản xuất thử nghiệm phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng Sản phẩm phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng được khảo nghiệm trên một số cây trồng ở miền Bắc, miền Nam, Tây nguyên và được người sử dụng đánh giá cao Do mục tiêu của đề tài nghiên cứu là xây dựng công nghệ sản xuất phân VSV đa chủng chức năng ở qui mô pilot và thử nghiệm áp dụng tại một số cơ sở sản xuất, nên sản phẩm phân VSV đa chủng chức năng chỉ được ứng dụng trong khuôn khổ của đề tài trên diện tích khiêm tốn Kết quả thử, khảo nghiệm đồng ruộng đã cho thấy phân bón VSV đa chủng, chức năng có hiệu quả tốt trong trồng trọt, mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội cho người sử dụng và môi trường sinh thái Thực tế sản xuất nông, lâm nghiệp đang rất cần sản phẩm phân bón VSV đa chủng chức năng Nhằm hoàn thiện qui trình công nghệ tạo sản phẩm chất lượng cao ở qui mô lớn phục vụ công tác đưa nhanh tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất đáp ứng nhu cầu của của người sử dụng, dự án cần thiết phải triển khai các nghiên cứu thử nghiệm và hoàn thiện để xác định được tính ổn định của qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp; đồng thời phối hợp với các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ, hữu cơ sinh học ở các vùng sinh thái nghiên cứu hoàn thiện qui trình xử lý phân gia cầm, than bùn và các nguồn hữu cơ khác thành chất mang cho sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng Trên cơ sở đó dự án tổ chức sản xuất thử nghiệm và phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất Nhằm khuyến cáo phân bón VSV đa chủng, chức năng cho sản xuất dự án cũng đặt ra nội dung thử, khảo nghiệm phân VSV đa chủng, chức năng và xây dựng mô hình trình diễn trên diện rộng đối với một số cây trồng tại các vùng sinh thái Để dự án được thực hiện thành công và có thể chuyển giao cho sản xuất, dự án xác định việc đào tạo, bồi dưỡng cán bộ là nội dung quan trọng tiếp theo của dự án

Để giải quyết các nội dung nghiên cứu đáp ứng mục tiêu xác định nêu trên dự án đã sử dụng kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu sau (chi tiết các phương pháp nghiên cứu được tập hợp trong phụ lục 1):

- Nghiên cứu đặc điểm chung và điều kiện sinh trưởng phát triển của VSV theo các phương pháp nghiên cứu VSV thông dụng

- Phương pháp phân tích các chỉ tiêu lý hoá học của mẫu đất, phân bón theo 10TCN 378-99; 369-99; 370-99; 377-99; 373-99; 371-99; 375-99; 303-97; 361-99; 306-97; 307-97; 308-97; 302-97; 366-99

- Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ, phân giải lân VSV và chất lượng phân bón VSV theo TCVN 6166-2002; 6167-1996; 7185-2002; 10TCN 299-97; 298-97

- Đánh giá khả năng đối kháng vi khuẩn/ nấm bệnh vùng rễ cây trồng theo phương pháp khuyếch tán hoạt chất ức chế vi sinh vật trong môi trường thạch (27)

9

- Xác định tên VSV bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự gen 16S ARN ribosom và so sánh theo chương trình phần mềm Fasta Tên VSV được xác định với xác xuất tương đồng cao nhất (17)

- Xác định độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật theo hướng dẫn về phân loại cấp độ an toàn sinh học của cộng đồng Châu Âu số 90/679/EWG (31)

- Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng diện hẹp và diện rộng theo 10TCN 216-95 (216-2003): Qui phạm khảo nghiệm đồng ruộng hiệu lực của phân bón đối với cây trồng và “Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng” Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 3 lần lặp lại Số liệu nghiên cứu được xử lý theo chương trình thống kê và xử lý số liệu IRRISTAT

III NHỮNG NỘI DUNG ĐÃ THỰC HIỆN

Ngay sau khi Dự án được phê duyêt cơ quan chủ trì dự án đã tổ chức hội thảo kế hoạch triển khai dự án với sự tham gia của các cán bộ khoa học chủ chốt về các lĩnh vực có liên quan Nội dung nghiên cứu của dự án được thống nhất và phân công cụ thể cho các đơn vị và triển khai chi tiết trong các năm như sau:

Năm 2005:

- Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV vật đa chủng, chức năng đậm đặc từ tổ hợp các VSV cố định đạm, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp nuôi cấy chìm ở qui mô công nghiệp (công suất 1500 lít/mẻ)

- Sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc

- Đánh giá chất lượng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng, đậm đặc Nghiên cứu xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng chế phẩm VSV đa chủng, chức

năng đậm đặc

- Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình xử lý cơ chất hữu cơ làm chất

mang cho phân bón hữu cơ VSV đa chủng, chức năng

- Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc

và cơ chất hữu cơ đã xử lý

- Sản xuất thử nghiệm, đầu đánh giá khả năng sử dụng và bước đầu phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất

Năm 2006 và 2007

- Tiếp tục hoàn thiện qui trình sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng và phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng ở qui mô công nghiệp

- Tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng đối với cây trồng tại một số vùng sinh thái

10

- Tổ chức khuyến cáo và mở rộng qui mô sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng cho các đối tượng cây trồng thông qua các mô hình trình diễn tại các vùng sinh thái khác nhau

Nội dung và các đơn vị chính thực hiện dự án cụ thể như sau: Đơn vị thực hiện Nội dung thực hiện

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam/ Viện Thổ nhưỡng Nông hoá và các đơn vị trực thuộc

- Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc sử dụng cho cây trồng nông nghiệp và hồ tiêu

- Hoàn thiện công nghệ xử lý cơ chất hữu cơ và sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng sử dụng cho cây trồng nông nghiệp

- Phối hợp sản xuất, đánh giá khả năng sử dụng và khuyến cáo ứng dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên diện rộng

Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam

- Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc, cơ chất hữu cơ và phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng sử dụng cho cây công nghiệp

- Phối hợp sản xuất và khuyến cáo đưa vào sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng

Các công ty: TNHH Hữu cơ Bình Dương, Polyfa, Thiên Sinh, Cổ phần đầu tư khai thác mỏ, TT Ứng dụng KHCN Đắc Lắc

- Phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm đậm đặc và cơ chất đã xử lý

- Phối hợp khuyến cáo và tổ chức phát triển hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất

- Tiếp nhận chuyển giao công nghệ sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng

Các Sở nông nghiệp, Chi cục BVTV các tỉnh, Viện BVTV

Phối hợp đánh giá khả năng sử dụng và khuyến cáo ứng dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên diện rộng

IV KẾT QUẢ THỰC HIỆN 1 Kết quả khoa học công nghệ

1.1 Hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng trên thiết bị lên men chìm qui mô công nghiệp

1.1.1.Tuyển chọn, xác định bộ giống vi sinh vật đa hoạt tính

Từ bộ giống VSV thuộc đề tài KC04-04 và Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp, dự án đã tiến hành tuyển chọn và đánh giá hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật Trên cơ sở lý lịch khoa học về hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật đã biết về hoạt tính cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng vi khuẩn, nấm gây bệnh vùng rễ, kết quả cụ thể như sau:

11

a) Azotobacter

Theo lý lịch khoa học, 3 chủng Azotobacter, ký hiệu là 108, 70 và 106 là

những chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ tự do Để sử dụng các chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng, dự án tiến hành tuyển chọn ra những chủng có hoạt tính sinh học cố định

nitơ mạnh Kết quả kiểm tra hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter

được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter

Số liệu bảng 1 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định

nitơ, với hoạt tính hình thành etylen đạt từ 2207,2 đến 4345,6 µmol/ml/ngày, trong đó chủng 70 có khả năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 µmol/ml/ngày

Các chủng vi sinh vật sử dụng để sản xuất phân vi sinh vật chức năng đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các chủng này có tính chất đa hoạt tính sinh học Vì vậy, dự án đã đánh giá các hoạt tính sinh học khác của chủng

Trong khu hệ sinh thái tồn tại rất nhiều mối quan hệ giữa các quần thể sinh vật, quan hệ giữa VSV – VSV, VSV – Cây trồng, VSV - Động vật đất Lợi dụng mối quan hệ cạnh tranh giữa các quần thể vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo chế phẩm phân bón vi sinh vật chức năng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh vùng rễ thực vật Kết quả đánh giá khả năng

ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh thực vật của các chủng Azotobacter được trình bày trong bảng 3 Kết quả bảng 3 cho thấy cả ba chủng Azotobacter sử

dụng trong nghiên cứu đều có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh thực vật Chủng 70 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc, chủng 108 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc và cà chua, chủng 106 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc, cà chua và khoai tây

12

Bảng 2 Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng Azotobacter

Hàm lượng IAA thô (µg/ml)

Ghi chú: (-): Không có hoạt tính

Sinh tổng hợp polyshacarit là một trong các tính chất đặc trưng của

Azotobacter Sử dụng đặc tính này để cải thiện độ phì của đất trồng đã được

nhiều nhà khoa học quan tâm Kết quả nghiên cứu khả năng sinh polyshacarit của các chủng Azotobacter được thể hiện trong bảng 4

Bảng 4 Hàm lượng polyshacarit của các chủng Azotobacter

70 360 106 489 108 353

Kết quả bảng 4 cho thấy 3 chủng Azotobacter nghiên cứu đều có khả

năng sinh polyshacarit, lượng polyshacarit tạo thành đạt từ 353 đến 489 g

khô/lít Khả năng sinh polyshacarit của các chủng Azotobacter có ý nghĩa

trong sản xuất phân bón sinh học Các chủng sinh polyshacarit có tác dụng tốt cho sinh thái đất và cây trồng nhờ khả năng giữ ẩm cho đất, tăng chất dinh dưỡng cho cây trồng v.v…

Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải lân và đối kháng VSV gây bệnh

vùng rễ cây trồng cạn cho thấy các chủng Azotobacter có biểu hiện, song mức

độ không cao

b) Rhizobium

13

Rhizobium là vi khuẩn gram (-), hiếu khí, sống cộng sinh với cây họ đậu

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng có khả năng cố định nitơ và cung cấp nitơ cho cây chủ Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành nốt sần và

cố định nitơ của các chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện

Kết quả bảng 5 cho thấy, 3 chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu

đều có khả năng hình thành nốt sần và cố định nitơ, trong đó, chủng RA.42.2 có khả năng hình thành 222,5 nốt sần/cây và cố định được 5135,5 nmol C2H4/cây/ngày

Để có thể tạo nốt sần và cố định nitơ phân tử cung cấp cho đất và cây trồng, đòi hỏi các vi sinh vật cố định nitơ phải có khả năng cạnh tranh cao đối với các vi sinh vật có sẵn trong đất Khả năng cạnh tranh của các vi sinh vật trong đất được đánh giá thông qua tính kháng kháng sinh Kết quả nghiên cứu

đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng Rhizobium được thể hiện

Kết quả bảng 6 cho thấy, 3 chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu

đều không mọc được trên môi trường có bổ sung streptomycin, tetracilin Chủng RA.18 và RA.42.2 có khả năng phát triển trên môi trường chứa spectinomycin (30 ppm)

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng

14

thực vật (IAA), phân giải lân và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng

cạn cho thấy các chủng Rhizobium không thể hiện rõ nét

c) Bacillus

Khả năng chuyển hoá Ca3PO4 của các chủng Bacillus trên môi trường

đặc được tổng hợp trong bảng 7 cho thấy cả 9 chủng vi sinh vật đều có khả năng chuyển hoá Ca3PO4 thành dạng hoà tan, trong đó chủng B.14 có đường kính vòng phân giải phosphat khó tan lớn nhất (21,5mm), chủng B.08, B.18, B.10, B.24 có đường kính vòng phân giải phosphat khó tan từ 14,5-15,5mm và chủng B.17 có khả năng phân giải phosphat nhỏ nhất (đường kính vòng phân

giải = 4,0mm) Thời gian hình thành vòng phân giải đối với 8/9 chủng Bacillus

là 3 ngày, riêng chủng B14 có khả năng hình thành vòng phân giải photphat ngay sau 1 ngày nuôi cấy

Bảng 7 Khả năng phân giải Ca3(PO4)2 của các chủng Bacillus

trên môi trường đặc

TT Chủng vi khuẩn Đường kính (d) vòng phân giải photphat khó tan (mm) trên môi trường đặc sau 5 ngàynuôi cấy

Khả năng chuyển hoá lân từ các nguồn phốt phát khác nhau của chủng

Bacillus sử dụng trong nghiên cứu cho thấy các nguồn photphat khác nhau có

ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của Bacillus cũng như mức độ

hoà tan lân của chúng Ca3(PO4)2 là nguồn photpho được Bacillus sử dụng tốt

nhất Cả hai loại quặng apatit và photphorit đều không có ảnh hưởng tốt đến

sinh trưởng, phát triển của Bacillus Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung hai loại quặng apatit và photphorit mật độ Bacillus chỉ đạt 107-108CFU/ml.Sự sinh

2 ngµy4 ngµy6 ngµy8 ngµy10 ngµyThêi gian nu«i cÊy (ngµy)

16

Biểu đồ 2 Khả năng phát triển của B18 trong môi trường bổ sung nguồn các phosphate khác nhau

2 ngµy4 ngµy6 ngµy8 ngµy10 ngµy

Thêi gian nu«i cÊy (ngµy)

Để xác định khả năng bền vững của hoạt chất sinh học phân giải hợp chất photpho, dự án tiến hành đánh giá mức độ hoạt tính của vi khuẩn trong điều kiện ly tâm và xử lý nhiệt độ, trong đó vi khuẩn được nuôi trên môi trường có bổ sung Ca3(PO4)2 trong 3 ngày sau đó tiến hành ly tâm hoặc xử lý nhiệt độ và đo vòng phân giải lân trên môi trường đặc Kết quả nghiên cứư cho thấy các chủng vi khuẩn phân giải lân trong quá trình nuôi cấy đều làm giảm pH của môi trường, trong đó chủng B.14 trong điều kiện ly tâm có xử lý nhiệt độ 800C trong 10 phút thì hoạt tính phân giải lân không thể hiện nữa, các chủng còn lại không thay đổi hoạt tính phân giải lân khi xử lý ở độ nhiệt độ 800C trong 10 phút Như vậy chủng B.14 có khả năng đã sản sinh ra 1 loại men phosphataza phân giải hợp chất Ca3(PO4)2 Men này dễ bị phân huỷ trong điều kiện nhiệt độ cao Điều này cũng phù hợp với đặc điểm hình thái học của chủng vi khuẩn có khả năng sinh men phosphataza, chúng có khả năng phát triển trên môi trường thạch muối-khoai tây Trên môi trường này có thể nhận ra khá dễ dàng các khuẩn lạc vi khuẩn phân giải hợp chất photpho: đó là khuẩn lạc lớn nhày và xung quanh có vòng trong suốt

Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp IAA, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung DL-triptophan 1% Kết quả xác định hàm lượng IAA sau thời gian nuôi cấy từ 2-6 ngày được trình bày trong bảng 9 cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có khả năng sinh IAA với hàm lượng đạt từ 35-352 µg/ml môi trường, trong đó hàm lượng IAA đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung DL- triptophan 1% Chủng B14 có khả năng sinh IAA cao nhất (đạt 352 µg/ml), chủng B.24,B10 cho hàm lượng IAA thấp nhất (82µg/ml và 87µg/ml)

17

sau 4 ngày nuôi cấy Chủng B08 và B18 có khả năng sinh IAA tương ứng đạt 186 và 263µg/ml sau 4 ngày nuôi cấy

Bảng 9: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus

Hàm lượng IAA (µg/ml) sau thời gian nuôi cấy

TT Chủng vi khuẩn

Để xác định khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn, dự án đã tiến

hành nuôi cấy các Bacillus trên môi trường vô đạm (MT Asby) và nhận thấy

mật độ chủng vi khuẩn đều thấp hơn so với môi trường chuẩn (MT Kinh) Trên môi trường Asby, các vi khuẩn nghiên cứu không phát triển thành các khuẩn lạc điển hình Để khẳng định chắc chắn khả năng cố định nitơ của các vi kluẩn phân giải lân, chuyên đề đã tiến hành đo hoạt tính khả axetylen của chúng trên máy sắc ký khí Kết quả phân tích không phát hiện thấy hoạt tính khử axety len của tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu, điều đó cho thấy các

chủng Bacillus nghiên cứu không có khả năng cố định nitơ

Kết quả xác định khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng được trình bày trong bảng 10 cho thấy các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu ngoài hoạt tính chính là phân giải hợp chất phosphat khó tan chúng đều có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh héo xanh thực vật Số liệu nghiên cứu cũng cho thấy ngoài chủng B24 chỉ có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho cây lạc, các chủng khác đều có khả năng ức chế từ 2 đến 3 loại vi sinh vật gây bệnh trên cà chua và cây lạc

Từ kết quả nghiên cứu nêu trên dự án đã xác định hầu hết các chủng vi khuẩn phân giải lân sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại đa hoạt tính sinh học với mức độ biểu hiện khác nhau Chúng không những phân giải lân mà còn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, hạn chế vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn Đây là những ưu điểm của bộ giống vi khuẩn Bacillus phân giải lân sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng

Vi khuẩn gây bệnh héo cây dưa hấu

d) Các vi sinh vật khác đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây công nghiệp

Hoạt tính kháng nấm được xác định trong điều kiện in vitro trên môi

trường thạch Waksman Chủng nấm kiểm định và chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy hai vạch song song trên cùng một đĩa

Bảng 11 Khả năng ức chế F oxysporum của một số vi sinh vật đối kháng

Tên chủng Đường kính vòng đối kháng nấm (D-d cm)

H2 2 H3 10 H15 20 H16 19 H13 18 H6 18 TH10 21

H10 17 DC29 22 CC5.10 18

19

Kết quả bảng 11 cho thấy chủng nấm gây bệnh và vi khuẩn đều phát triển tốt trên môi trường WA Vùng ức chế được xác định sau 3-5 ngày nuôi ở 300C Sự ức chế được phân biệt rõ bằng sự phát triển hạn chế hoặc hoàn toàn không có hệ sợi nấm trong vùng ức chế gần đường phát triển của vi khuẩn

Các chủng vi sinh vật có mức độ đối kháng Fusarium oxysporum khác nhau,

trong đó 9 chủng ký hiệu H15, H16, H13, H6, H10, TH10, DC29, CC5.10,

VCM 1158 có hoạt tính ức chế F oxysporum lớn hơn 17 mm

Kết quả nghiên cứu xác định khả năng đối kháng với cả F.oxysporum và

Ralstonia solanacearum cho thấy 4 chủng TH10, DC29, CC5.10 và VCM

1158 có hoạt tính cao trong ức chế cả 2 loại vi sinh vật gây bệnh này (bảng 12)

Bảng 12 Khả năng ức chế F oxysporum và R solanacearum

của một số vi sinh vật đối kháng

Đường kính vòng đối kháng (mm) Kí hiệu chủng

1.1.2 Định tên và xác định an toàn sinh học của các vi sinh vật đa hoạt tính

Trên cơ sở kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật được lựa chọn và kết hợp với kết quả nghiên cứu của đề tài cấp Nhà nước

“Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” mã số KC 04.04, dự án đã tiến hành xác định tên các chủng vi sinh vật chưa được xác định tên bằng kỹ thuật 16S ARN riboxom, kết quả xác định được tập hợp trong bảng 13

Độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật sử dụng trong đời sống có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học “Vi khuẩn” được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các vi khuẩn ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường

- Cấp độ 1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuẩn không có thể gây bất cứ một nguy hiểm nào đối với người và động vật

- Cấp độ 2 (Risiko gruppe 2) bao gồm các vi khuẩn có thể gây bệnh đối với người, động vật ở mức độ thấp, không có khả năng lan truyền và có thể phòng, chống và loại trừ dễ dàng trong điều kiện bình thường

20

- Cấp độ 3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuẩn có nguy cơ gây bệnh nặng đối với người, động vật và có khả năng lan truyền rộng, song vẫn có thể phòng chống và loại trừ được

- Cấp độ 4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuẩn có thể gây bệnh nặng đối với người, động vật, có nguy cơ lớn về mức độ lan truyền rộng và không thể phòng, chống hoặc loại trừ

Kết quả xác định mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh lựa chọn được tập hợp trong bảng 13 Từ kết quả đánh giá độ an toàn, dự án đã xác định 10 chủng vi sinh vật kí hiệu 70,108, RA18, Ra42.2 B10, B18, B17, B16, DC29, B04 được xếp loại mức độ an toàn cấp 1 và cấp 2 có thể ứng dụng sản xuất trong điều kiện bình thường Chủng TH10 có hoạt tính sinh học cao, tuy nhiên do mức độ an toàn sinh học được xếp ở cấp độ 3 (nhóm vi sinh vật hạn chế sử dụng), do vậy dự án không sử dụng cho sản xuất phân bón VSV đa chủng, chức năng

Bảng 13 Kết quả xác định tên và mức độ an toàn của các vi sinh vật đa hoạt tính

toàn

2 108 Azotobacter beijerinckii Cấp độ 1 3 RA18 Bradyrhizobium japonicum Cấp độ 1 4 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum Cấp độ 1 5 B10 Bacillus polyfermenticus Cấp độ 1

1.1.3 Nghiên cứu khả năng tổ hợp các vi sinh vật đa hoạt tính

Trên cơ sở tính sinh học, nguồn gốc phân lập và ảnh hưởng đối với cây trồng đã được đánh giá trong khuôn khổ đề tài KC.04.04, dự án đã xác định

nghiệp ngắn ngày

Bradyrhizobium japonicum RA18, RA42.2 CĐNT

Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Cây họ đậu

Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Hồ tiêu

Pseudomonas chlororaphis DC29 ĐK nấm bệnh Cà phê và cây

công nghiệp dài ngày khác

CĐNT: Cố định nitơ, PGL: phân giải lân; ĐKVKHX: Đối kháng vi khuẩn héo xanh

Kết quả đánh giá giá mật độ, hoạt tính sinh học theo thời gian bảo quản của các vi sinh vật đa hoạt tính trong các tổ hợp được trình bày trong bảng 15 và 16 Kết quả tập hợp tại bảng 15 cho thấy, mật độ các chủng vi sinh vật lựa chọn trong điều kiện hỗn hợp và riêng lẻ không có sự sai khác về mật độ Mật độ được duy trì trong suốt thời gian là 6 tháng bảo quản và đạt >107CFU/g

RA18 Đơn chủng Hỗn hợp

4,18 x 108 4,21 x 108

5,02 x 108 3,25 x 108

4,30 x 107 3,35 x 107

Bradyrhizobium japonicum

RA42.2 Đơn chủng Hỗn hợp

4,15 x 108 3,98 x 108

6,10 x 108 5,34 x 108

5,29 x 107 4,21 x 107

Azotobacter beijerinckii

108 Đơn chủng Hỗn hợp

6,31 x 106 6,45 x 106

4,13 x 107 4,04 x 108

5,67 x 107 5,50 x 107

Azotobacter beijerinckii

70 Đơn chủng Hỗn hợp

7,12 x 106 7,85 x 106

6,85 x 107 6,87 x 108

3,14 x 107 4,00 x 107

Bacillus subtilis B16 Đơn chủng Hỗn hợp

6,55 x 108 6,37 x 108

4,45 x 108 5,74 x 108

6,73 x 107 1,95 x 108

Bacillus subtilis B18 Đơn chủng Hỗn hợp

2,35 x 108 2,30 x 108

4,76 x 108 5,67 x 108

5,10 x 107 4,40 x 107

Bacillus

polyfermenticus

B17 Đơn chủng Hỗn hợp

7,35 x 108 6,67 x 108

5,57 x 108 4,87 x 108

2,10 x 107 3,40 x 107

Bacillus subtilis B14 Đơn chủng Hỗn hợp

4,46 x 108 3,74 x 108

2,52 x 108 4,22 x 108

2,80 x 108 4,56 x 107

Bacillus

polyfermenticus

B10 Đơn chủng Hỗn hợp

4,96 x 108 2,92 x 108

4,74 x 108 4,02 x 108

3,68 x 108 6,24 x 107

Pseudomonas chlororaphis

DC29 Đơn chủng Hỗn hợp

3,85 x 108 2,90 x 108

3,63 x 108 3,42 x 108

1,50 x 108 5,75 x 107Kết quả đánhgiá hoạt tính sinh học trong bảng 16 cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn không có sự sai khác ở điều kiện riêng lẻ và hỗn hợp chủng tại thời điểm 0h, 10 ngày và 60 ngày, các chủng vi sinh vẫn giữ được hoạt tính sinh học ban đầu

23

Bảng 16 Hoạt tính của các vi sinh vật trong điều kiện tổ hợp

Hoạt tính của các vi sinh vật (CFU/g) sau thời gian bảo quản Chủng vi sinh

vật

Ký hiệu chủng

Công thức nhiễm

0 giờ 10 ngày 6 tháng Bradyrhizobium

japonicum

RA18 Đơn chủng Hỗn hợp

+ +

Bradyrhizobium

japonicum

RA42.2 Đơn chủng Hỗn hợp

Azotobacter

beijerinckii

108 Đơn chủng Hỗn hợp

Azotobacter

beijerinckii

70 Đơn chủng Hỗn hợp

Pseudomonas

chlororaphis

DC29 Đơn chủng Hỗn hợp

Ghi chú: (-): không có hoạt tính; (+): Có hoạt tính

1.4.1.Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật chức năng

1.1.4.1 Môi trường nhân sinh khối cho Azotobacter

Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ không giống nhau Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các

nguồn cacbon khác nhau đến mật độ Azotobacter trong quá trình sinh trưởng

phát triển được tập hợp trong bảng 17 cho thấy trong môi trường sử dụng rỉ

mật Azotobacter sinh trưởng phát triển tốt hơn so sử dụng đường glucoza Rỉ

đường là hỗn hợp các hợp chất đường, nitrogen, các vitamin và các hợp chất vô cơ, trong đó đường có khả năng lên men chiếm trên 50% Trong rỉ đường ngoài ra còn có nhiều vitamin đặc biệt là biotin và một số vi lượng cần thiết

24

cho sinh trưởng, phát triển của Azotobacter Kết quả cho thấy có thể sử dụng rỉ mật như một nguồn dinh dưỡng cacbon trong nhân sinh khối Azotobacter

Bảng 17 Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường chứa

các nguồn cacbon khác nhau

Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian

* Môi trường AT: sử dụng đường glucoza; Môi trường SX1: sử dụng rỉ mật

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sinh

trưởng phát triển của chủng Azotobacter trình bày trong bảng 18 cho thấy mặc dầu Azotobacter là loại vi sinh vật cố định nitơ tự do có thể tự tổng hợp nitơ cho nhu cầu của cơ thể từ không khí, song sự phát triển của Azotobacter sẽ

mạnh hơn nếu môi trường được bổ sung nitơ Sau 2 ngày nuôi cấy mật độ

Azotobacter đạt 2,55 x 108 CFU/ml môi trường

Bảng 18 Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường chứa

các nguồn nitơ khác nhau

Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian

* Môi trường AT: Vô đạm; Môi trường SX2: Bổ sung nước chiết đậu

Bột men bia là một sản phẩm phụ trong công nghệ sản xuất bia, nó chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị đối với vi sinh vật, đặc biệt là protein và vitamin Trong công nghệ lên men, bột men bia được sử dụng như một loại nguyên liệu thay thế để giảm giá thành Để xác định khả năng sử dụng bột men

bia trong sản xuất sinh khối Azotobacter bằng phương pháp lên men chìm, dự án đã tiến hành nghiên cứu khả năng nhân sinh khối chủng Azotobacter trong

môi trường có bổ sung bột men bia

25

Bảng 19 Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường có bổ

sung bột men bia

Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian

0 giờ 4,00 x 106 4,00 x 106 4,00 x 1061 ngày 8,50 x 106 1,60 x 107 3,60 x 1072 ngày 8,87 x 107 2,55 x 108 3,55 x 1083 ngày 2,35 x 108 2,35 x 108 2,85 x 1084 ngày 2,16 x 108 2,10 x 108 2,15 x 108

* Môi trường có chứa bột men bia

Bảng số liệu 19 cho thấy bột men bia với liều lượng bằng 1/10 so với

đậu trắng đã có tác dụng đến sinh trưởng, phát triển của Azotobacter tốt hơn so

với đậu trắng và cao hơn hẳn so với môi trường không bổ sung nguồn nitơ, mật độ tế bào đạt 3,55 x 108 CFU/ml sau 2 ngày nuôi cấy

Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên đề tài đã tổng hợp các thành phần

môi trường nhân sinh khối cho Azotobacter và đánh giá khả năng sử dụng môi trường này cho sản xuất sinh khối Azotobacter bằng phương pháp lên men

chìm Kết quả nghiên cứu được tập hợp trong bảng 20 cho thấy trong môi

trường có bổ sung rỉ mật và bột men bia Azotobacter phát triển tốt Mật độ

Azotobacter sau 2 ngày nuôi cấy đạt 5,30 x 108 CFU/ml môi trường

Kết quả đánh giá hoạt tính của các chủng Azotobacter nuôi cấy trong các môi trường khác nhau được tập hợp trong bảng 21 cho thấy, Azotobacter

trong các môi trường khác nhau vẫn được duy trì hoạt tính sinh học ban đầu (cố định nitơ, kích thích sinh trưởng, sinh polyshacarit, ức chế VKHX) Mức

độ hoạt tính sinh học của các chủng Azotobacter trong các môi trường khác

nhau vẫn được giữ nguyên hoặc giảm không đáng kể so với nuôi cấy trong môi trường gốc

Bảng 20 Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường có bổ sung

26

Bảng 21 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính

của các chủng Azotobacter

Hoạt tính sinh học Môi

Sinh Polyshaca

rit (g/l)

ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc (vòng vô khuẩn D-d)

Từ kết nghiên cứu về môi trường nuôi cấy nêu trên dự án xác định môi

trường SX4 phù hợp cho nhân sinh khối Azotobacter Trong môi trường SX4

Azotobacter đạt mật độ cao nhất sau 2 ngày nuôi Các hoạt tính sinh học của Azotobacter (cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp IAA và đối kháng vi

khuẩn héo xanh) trong môi trường SX4 hầu như không thay đổi so với môi trường vô đạm

1.1.4.2 Môi trường nhân sinh khối cho Rhizobium

Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của Rhizobium trong

môi trường có bổ sung các nguồn đường khác nhau được thể hiện trong bảng 22

Bảng 22 Khả năng phát triển của Bradyrhizobium trong môi trường có chứa các nguồn đường khác nhau

Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian

27

SX5: Môi trường chứa Glucosa thay thế cho Manitol

Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thay thế maniton bằng đường glucoza

chủng Rhizobium vẫn sinh trưởng phát triển bình thường Mật độ chủng

Rhizobium trong môi trường mới tại một số thời điểm kiểm tra tuy có thấp

hơn so với môi trường YMB, song đến ngày thứ 7 mật độ chủng Rhizobium ở

cả hai môi trường là tương đương nhau, đạt1,16 x 109 CFU/ml môi trường Như vậy có thể sử dụng glucoza thay thế cho maniton, một loại đường hiếm và đắt tiền

Kết quả đánh giá khả năng thay thế cao nấm men bằng bột men bia đến

khả năng sinh trưởng và phát triển của Rhizobium được trình bày trong bảng 23 đã xác định trong môi trường có bổ sung bột men bia mật độ chủng

Rhizobium hầu như không có sự sai khác so với môi trường YMB

Bảng 23 Khả năng phát triển của Rhizobium trong môi trường có chứa các

nguồn nitơ khác nhau

Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi

trưởng phát triển của Bradyrhizobium trong môi trường SX7 được tập hợp

trong bảng 24 Số liệu tập hợp trong bảng 24 cho thấy mật độ chủng

Rhizobium đạt cao nhất sau 6 ngày lên nhân sinh khối trong hệ thống lên men

chìm có sục khí ở điều kiện nhiệt độ phòng Trong môi trường SX7 chủng

Rhizobium phát triển tốt không thua kém môi trường YMB và đạt mật độ cao

nhất sau 6 ngày nuôi cấy (4,07 x 109CFU/ml môi trường) Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên đề tài rút ra kết luận có thể thay thế môi trường nhân sinh

khối chủng Rhizobium YMB bằng môi trường SX7, trong đó đường maniton

và cao nấm men được thay thế bằng đường glucoza và bột men bia với nồng độ tương đương

Kết quả đánh giá hoạt tính của các chủng Rhizobium được thể hiện trong

bảng 25 cho thấy chủng Rhizobium trong các môi trường khác nhau vẫn được

duy trì hoạt tính sinh học ban đầu (cố định nitơ) Hoạt tính sinh học của các

chủng Rhizobium trong các môi trường khác nhau không có sự sai khác so với

nuôi cấy trong môi trường gốc (YMB)

Bảng 25 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

cố định nitơ của các chủng Rhizobium

Môi trường nhân sinh khối Khả năng cố định nitơ (nmol C2H4/cây/ngày)

YMB 748,0 SX5 738,0 SX6 745,0 SX7 747,0 Từ các kết quả nêu trên dự án rút ra kết luận có thể sử dụng môi trường

SX7 cho sản xuất sinh khối Rhizobium trong hệ thống lên men chìm Với môi trường SX7 mật độ Rhizobium đạt cao, ổn định sau 6 ngày nuôi cấy Trong

29

môi trường SX7 Rhizobium vẫn giữ được hoạt tính cố định nitơ tương tự trong

môi trường YMB

1.1.4.3 Môi trường lên men cho Bacillus phân giải lân

Chủng Bacillus đại diện cho nhóm Bacillus có hoạt tính phân giải hợp

chất phosphat khó tan sử dung trong nghiên cứu có kí hiệu B18 Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng B18 trong 3 môi trường sản xuất kí hiệu SX1.1, SX1.2, SX 2 và môi trường nước chiết đậu được trình bày trong bảng 26

Bảng 26 Khả năng sinh trưởng của chủng B18 trên các loại môi trường Thời gian

nuôi cấy

Môi trường đậu SX

Môi trường SX1.1

Môi trường SX1.2

Môi trường SX2

0h 1,25x106 1,25x106 1,25x106 1,25x10612h 3,6x108 5,7x109 3,2x109 3,6x109 24h 7,6x109 1,0x1010 5,2x109 8,8x109 36h 1,3x1010 2,06x1010 6,7x109 5,9x109 48 h 5,8x109 1,76x1010 1,17x1010 9,9x109

Khi nhân sinh khối chủng B18 trên các môi trường sản xuất SX1.1, SX1.2, SX 2 cho thấy sau 12h mật độ tế bào cao hơn so với môi trường nước chiết đậu sản xuất Sau 48 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn B18 trong môi trường SX1.1 và SX1.2 đạt mật độ cao hơn so với môi trường SX2 và môi trường nước chiết đậu sản xuất Như vậy trong quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh có thể sử dụng môi trường SX1.1 và môi trường SX1.2 làm môi trường nhân sinh khối cho chủng vi khuẩn phân giải lân B18

Tiến hành xác định hoạt tính phân giải lân và hoạt tính ức chế vi khuẩn và nấm gây bệnh của chủng B18, kết quả thu được không sai khác nhiều trong các điều kiện môi trường sản xuất khác nhau Kết quả kiểm tra hoạt tính chủng B18 được trình bày trong bảng 27

Bảng 27 Hoạt tính sinh học của chủng B18

Đường kính vòng đối kháng (mm) Môi trường

nuôi cấy

Đường kính vòng

SX1.1 14,8 14,0 13,0 SX1.2 15,0 14,5 14,3

Như vậy các môi trường sản xuất SX1.1; SX1.2 không ảnh hưởng có ý nghĩa đến hoạt tính phân giải lân cũng như hoạt tính ức chế với sinh vật gây

30

bệnh của chủng B18 Thành phần chính môi trường nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân sử dụng trong sản xuất được trình bày trong bảng 28, bảng tổng hợp cho thấy các nguyên liệu sử dụng trong lên men sinh khối vi sinh vật phân giải lân đều có giá thành thấp và sẵn ở Việt Nam

Bảng 28 Thành phần chính môi trường nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân

TT Yếu tố dinh dưỡng

Môi trường SX1.1

Môi trường SX1.2

Môi trường SX2

1 Nguồn C Rỉ đường Rỉ đường Saccharosa, glucosa 2 Nguồn N Bột nấm men Bột nấm men Bột nấm men, NH4

1.1.4.4 Môi trường lên men cho Bacillus đối kháng

Kết quả kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật trên các môi trường lên men vi khuẩn đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh được tổng hợp trong bảng 29 cho thấy chủng B16, B17 đều có khả năng sinh trưởng và phát triển rất tốt trên cả 4 loại môi trường thử nghiệm, mật độ tế bào đạt cao tại thời điểm 48 giờ và sau đó tương đối ổn định Tại thời điểm 48 giờ mật độ cả 2 chủng đều đạt >4x109 CFU/ml Kết quả này cho thấy các môi trường trên đều phù hợp với quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng B16 và B17

Bảng 29 Phát triển của vi khuẩn đối kháng trong các môi trường khác nhau Mật độ tế bào (CFU/ml)

Kí hiệu chủng

31

đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên 4 loại môi trường, dự án đã lựa chọn môi trường sản xuất SX2 có giá thành rẻ, mật độ tế

bào vi sinh vật đạt cao và ổn định Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh cũng được

tiến hành song song với quá trình nhân sinh khối 2 chủng B16 và B17 trên môi trường SX2, kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học được thể hiện trong bảng 30 và 31

Bảng 30 Hoạt tính sinh học của chủng B16 sau lên men trên môi trường SX2 Hoạt tính sinh học

Thời gian lên

men (giờ)

Mật độ tế bào

(CFU/g) Đối kháng vi khuẩn héo xanh cà chua

(D-d, mm)

Sinh tổng hợp IAA

Mật độ tế bào

(CFU/g) Đối kháng vi khuẩn héo xanh cà chua

(D-d, mm)

Sinh tổng hợp IAA

trường chuẩn Như vậy đối với nhóm Bacillus đối kháng vi sinh vật gây bệnh

héo xanh thực vật, việc sử dụng môi trường SX2 không những đảm bảo về mặt chất lượng mà còn có hiệu quả kinh tế cao do sử dụng nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có

32

1.1.4.5 Môi trường lên men cho Pseudomonas chlororaphis đối kháng

Chủng Pseudomonas chlororaphis được hoạt hoá, nhân giống cấp 1

trong bình tam giác 100ml (môi trường KingB), sau đó tiến hành lên men cấp 1 với 2 loại môi trường (King B và MT1) Sau các khoảng thời gian nuôi cấy

xác định mật độ vi khuẩn Kết quả được thể hiện trong bảng 32 cho thấy P

chlororaphis phát triển tốt ở cả 2 loại môi trường nghiên cứu Môi trường

King B là môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn Pseudomonas, vì vậy mật độ của

P chlororaphis trong môi trường này cao hơn so với môi trường MT1, song

mức độ sai khác không đáng kể Do vậy môi trường MT1 được xác định cho

nhân giống P chlororaphis

Bảng 32 Mật độ P chlororaphis trong các môi trường nhân giống

Mật độ vi khuẩn(CFU/ml) Thời gian

thử nghiệm nhân giống chủng P chlororaphis được trình bày trong bảng 33

Bảng 33 Thành phần môi trường lên men

CT1

K2O: 1,0gr; P2O5: 0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10 ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr; FeSO40,001gr; Tiết động vật 1,0 ml

CT2 K2O: 1,0gr; P2O5: 0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr; FeSO40,001gr, Urea 0,5gr

33

Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật sau 25 h đến 45 h lên men trên các thiết bị lên men được thể hiện ở bảng 34 Kết quả trên bảng 34 cho thấy môi trường CT4 thích hợp hơn cả cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn nghiên cứu, sau 35 giờ mật độ tế bào đạt 2,7.108 CFU/ml Sau 40 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn trong tất cả 4 loại môi trường đều có xu hướng giảm Dựa và kết quả đạt được, dự án đã lựa chọn môi trường CT4 làm môi

trường nhân sinh khối cho chủng P chlororaphis qui mô công nghiệp

Bảng 34 Mật độ vi sinh vật sau các khoảng thời gian lên men Mật độ vi sinh vật (CFU/ml)

1.1.4.6 Sản xuất sinh khối vi sinh vật đa hoạt tính trên thiết bị lên men chìm

Trên cơ sở các thông số kỹ thuật trong lên men sinh khối các vi sinh vật đa hoạt tính đã được nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài KC.04.04, dự án đã tiến hành nghiên cứu đánh giá và xác định điều kiện tối ưu cho sản xuất sinh khối các vi sinh vật đa hoạt tính trong các nồi lên men dung tích 500lít/nồi Kết quả nghiên cứu được tổng hợp trong bảng 35

Bảng 35 Điều kiện lên men tối ưu của các vi sinh vật đa hoạt tính trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp

Chủng vi sinh vật Thông số kỹ thật

Bacillus Rhizobium Pseudomonas Azotobacter

6 giờ - 12 giờ 300 300 300 300 Tốc độ cánh

khuấy

(vòng/phút) 12h giờ - kết thúc 350 350 350 350 Lưu lượng cấp khí (m3 khí/1m3

34

Kết quả nhân sinh khối vi sinh vật đa hoạt tính bằng phương pháp lên men chìm được tổng hợp trong bảng 35 cho thấy mật độ các vi sinh vật trong dịch lên men đạt 108-109 CFU/ml sau thời gian lên men 35-48 giờ đối với Bacillus,

Pseudomonas và Azotobacter Riêng chủng Rhizobium thời gian nhân sinh

khối là 120 giờ

Bảng 36 Mật độ sinh khối các vi sinh vật sau lên men

1 70 Azotobacter beijerinckii 5,30 x 1082 108 Azotobacter beijerinckii 3,21 x 1083 RA18 Bradyrhizobium japonicum 3,6 x 1094 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum 4,07 x 109

1.1.4.7 Xử lý nâng cao mật độ vi sinh vật trong sinh khối sau lên men

Dịch vi sinh vật sau nhân sinh khối trên thiết bị lên men chìm được đưa vào máy ly tâm liên tục (separator) để tách nước tự do Vận tốc ly tâm ban đầu là 15000 vòng/ phút sau đó tăng từ từ để đạt vận tốc 20000 vòng/phút Mật độ tế bào vi sinh vật sau ly tâm được xác định thông qua phương pháp nuôi cấy pha loãng, kết quả cho thấy mật độ vi sinh vật trong sinh khối vi sinh vật đã tăng 10 đến 100 lần Kết quả nghiên cứu này đã mở ra triển vọng tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng chức năng đậm đặc với mật độ vi sinh vật hữu ích cao hơn hẳn chế phẩm truyền thống sản xuất trên cơ sở phối trộn sinh khối vi sinh vật sau lên men với chất mang đã xử lý Số liệu nghiên cứu được tập hợp trong bảng 37

35

Bảng 37 Mật độ sinh khối các vi sinh vật sau ly tâm

1 70 Azotobacter beijerinckii 6,30 x 1092 108 Azotobacter beijerinckii 7,21 x 1093 RA18 Bradyrhizobium japonicum 1,16 x 10104 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum 2,07 x 10105 B10 Bacillus polyfermenticus 6,58 x 1010

1.1.4.8 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật chức năng đậm đặc

Từ các kết quả nghiên cứu hoàn thiện ở trên kết hợp với các kết quả nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài KC04.04 về chất mang cho sản xuất phân vi sinh vật đa chủng chức năng (VSVĐCCN), dự án đã tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm được tập hợp trong bảng 38 đã xác định chế phẩm có chất lượng cao hơn yêu cầu về chế phẩm phân bón vi sinh vật được qui định trong TCVN

Với qui trình đã hoàn thiện, dự án tổ chức sản xuất chế VSVĐCCN đậm đặc và phối hợp với 3 công ty sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng (HCVSVĐCCN) với số lượng khoảng 8000 tấn, trong đó chế phẩm được sử dụng với liều lượng 1kg/1tấn nguyên liệu hữu cơ Sản phẩm phân HCVSVĐCCN được sử dụng tại nhiều địa phương trong cả nước và được người nông dân đánh giá cao Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của phân HCVSVĐCCN sản xuất trên nền hữu cơ đã xử lý và chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng đậm đặc được trình bày chi tiết trong mục 1.2.3 Kết quả đánh giá hiệu quả phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng đối với cây trồng

36

Bảng 38 Mật độ các nhóm vi sinh vật chính chứa trong chế phẩm

1 Chế phẩm sử dụng cho cây bộ đậu

Vi sinh vật phân giải lân CFU/g 5,23 x 109Vi sinh vật đối kháng vi khuẩn héo xanh CFU/g 3,96 x 109

2.Chế phẩm sử dụng cho khoai tây, dưa

Vi sinh vật phân giải lân CFU/g 5,71 x 109

Vi sinh vật đối kháng vi khuẩn héo xanh CFU/g 4,21 x 109

3 Chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho cây lâu năm

Vi sinh vật phân giải lân CFU/g 5,33 x 109

Vi sinh vật đối kháng F.Oxysporum CFU/g 3,78 x 109

1.1.4.9 Tổng hợp quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp

Trên cơ sở kết quả hoàn thiện công nghệ về đánh giá tuyển chọn bộ giống vi sinh vật đa hoạt tính sinh học, nghiên cứu môi trường lên men phù hợp, nghiên cứu bổ sung điều kiện lên men tối ưu trên thiết bị lên men chìm, kỹ thuật xử lý sinh khối sau lên men nhằm tạo chế phẩm VSVĐCCN (có mật độ vi sinh vật hữu ích cao) và kế thừa các kết quả đã được của đề tài KHCN cấp Nhà nước KC.04.04 giai đoạn 2001-2005, dự án đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc Quy trình công nghệ được tóm tắt trong sơ đồ 1 và chi tiết hoá trong: Sản phẩm của Khoa học công nghệ của Dự án – Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng đậm đặc

37

Sơ đồ 1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp

Chất mang

Kiểm tra hoạt tính Kiểm tra hoạt tính Kiểm tra hoạt tính

Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I

Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II

Xử lý sinh khối Xử lý sinh khối Xử lý sinh khối

Phối trộn Xử lý chất mang

Kiểm tra chất lượng

bệnh