Luận văn góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 168 27​

NGUYỄN THỊ KIM VUI GÓP PHẦN STREPTOMYCES 168.27 - 2013 BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ KIM VUI GÓP PHẦN STREPTOMYCES 168.27 : ThS Nguyễn Liên Hương : - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành môn Vi sinh & Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội , động viên giúp đỡ bước tơi q trình nghiên cứu thực khóa luận ! năm 2013 Sinh viên NGUYỄN THỊ KIM VUI MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng sinh 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 Định nghĩa kháng sinh Cơ chế tác dụng kháng sinh Tiêu chuẩn kháng sinh Các ứng dụng kháng sinh 1.2 Đại cƣơng xạ khuẩn(Actinomycetes) 1.2.1 Đại cương xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn 1.3.1 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 1.3.2 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 1.3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.4 Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 Mục đích Sàng lọc ngẫu nhiên Đột biến cải tạo giống Bảo quản giống xạ khuẩn 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men 1.5.2 Các phương pháp lên men 10 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 10 1.6 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11 1.6.1 Chiết xuất 11 1.6.2 Tách, tinh chế sản phẩm: 11 1.7 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.7.1 Phổ tử ngoại 12 1.7.2 Phổ hồng ngoại 13 1.7.3 Khối phổ (MS) 13 1.8 Các nghiên cứu liên quan: 13 1.8.1 Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi dự tính kiểm sốt phiên mã 13 1.8.2 Sự xuất sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus S.parvulus sinh actinomycin 14 1.8.3 Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào actinomycete phân lập từ chất lắng biển 15 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 18 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 18 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 18 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 20 2.3.4 Đột biến 20 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.6 Xác định độ bền kháng sinh dịch lên men 22 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 22 2.3.8 Tách thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng 23 2.3.9 Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay 24 2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột 24 2.3.11 Sơ xác định kháng sinh tinh khiết thu 24 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 25 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 25 Kết đột biến cải tạo giống lần 26 Kết đột biến cải tạo giống lần 27 Kết đột biến hóa học 28 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 Kết thử độ bền pH độ bền nhiệt kháng sinh dịch lọc 31 Kết chọn dung môi pH chiết 32 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 33 Kết sắc ký cột 34 3.9.1 Chạy cột sắc ký lần 34 3.9.2 Chạy cột sắc ký lần 36 3.9.3 Chạy cột sắc ký lần 39 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ADN Acid 2’- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên CKS Chất kháng sinh DMHC Dung môi hữu D (mm) Đường kính vịng vơ khuẩn ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại- Infrared KH Khoa học KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TĐC Trao đổi chất V Thể tích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại- Ultraviolet Danh mục bảng Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng Bảng 3.4: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng Bảng 3.5: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 3.6: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng3 7: Kết thử HTKS đột biến hóa học Bảng 3.8: Kết chọn mơi trường lên men Bảng 3.9: Kết chọn biến chủng lên men chìm tốt Bảng 3.10: Kết thử độ bền dịch lọc pH khác Bảng 3.11: Kết thử độ bền nhiệt kháng sinh Bảng 3.12: Kết chọn dung môi pH chiết (P.mirabilis) Bảng 3.13: Kết chọn hệ dung môi chạy sắc ký Bảng 3.14: Kết chạy sắc ký cột lần Bảng 3.15: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột (P.mirabilis) Bảng 3.16: Kết chạy sắc ký cột lần 2- nhóm (2-8) Bảng 3.17: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 1.1 (P.mirabilis) Bảng 3.18: Kết chạy sắc ký cột lần 2- nhóm (15-18) Bảng 3.19: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 3.2 (P.mirabilis) Bảng 3.20: Kết SKLM sau chạy cột lần (P.mirabilis) Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Các khuẩn ty xạ khuẩn Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hình 3.4: Pic sắc ký cột lần Hình 3.5: Pic sắc ký cột lần (nhóm 1) Hình 3.6: Pic sắc ký cột lần (nhóm 3) ĐẶT VẤN ĐỀ Cách 70 năm, Penicillin – kháng sinh đời có khả tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ mở tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân nhiễm khuẩn Nhưng đến chiến kháng sinh vi khuẩn tiếp diễn, nhiều loại vi khuẩn tưởng bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị diện đề kháng với nhiều loại kháng sinh Điều đáng sợ năm vừa qua song song với việc phát thêm chủng vi khuẩn siêu kháng thuốc tốc độ tìm loại kháng sinh lại khơng theo kịp tốc độ phát triển loại vi khuẩn Với gia tăng số lượng ca tử vong vi khuẩn kháng thuốc mối đe dọa loại “siêu vi khuẩn” có khả kháng lại loại kháng sinh vấn đề gây lo ngại trở thành mối quan tâm nghiên cứu nhà khoa học Phương pháp chủ yếu để tìm kháng sinh phương pháp sinh học- kháng sinh tổng hợp phong phú từ vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên đa dạng điều kiện thuận lợi cho sinh sôi phát triển hệ vi sinh đáng ý xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh, chi xạ khuẩn Streptomyces với khả tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc điểm Chính chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 168.27 - Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc, dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết - Sơ xác định số đặc tính kháng sinh thu CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh tất hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật nhiễm sinh (cũng với tế bào ung thư) nồng độ thấp mà khơng có tác dụng tác dụng yếu lên người, động vật thực vật đường cung cấp chung [6, 18] 1.1.2 Cơ chế tác dụng kháng sinh Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên đích khác Có kiểu chủ yếu [3, 18] : • Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt Một số kháng sinh như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo chế • Tác động lên trình tổng hợp protein VK: – Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol, tetracyclin, macrolid lincosamid – Gắn vào tiểu đơn vị 30S ribosom làm tiêu diệt VK: Các aminoglycosid, spectinomycin • Ức chế tổng hợp acid nucleic từ trình chép phiên mã: Actinomycin, antracyclin, rifampicin • Thay đổi tính thấm màng: Polymycin, amphotericin • Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol trimethoprim) 1.1.3 Tiêu chuẩn kháng sinh Những yêu cầu y học kháng sinh [6]: • Kháng sinh phải khơng độc độc thể • Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh mạnh VSV gây bệnh • Dễ hịa tan nước bền vững bảo quản lâu dài 39 D(mm) 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Phân đoạn Hình 3.6: Pic sắc ký cột lần – Nhóm Nhận xét: Dựa vào hình 3.6: nhóm (15-18) tùy vào HTKS chia thành phân nhóm: Phân nhóm 3.1: phân đoạn đến 13; phân nhóm 3.2: phân đoạn 14 đến 28 Trong phân nhóm 3.1 có hoạt tính mạnh, tiến hành sắc kí lớp mỏng phân đoạn nằm phân nhóm Bảng 3.19: Kết SKLM sau chạy cột phân nhóm 3.2 (P mirabilis) PĐ Rf vết1 Rf vết2 10 11 12 13 14 15 0,91 0,91 0,90 0,91 0,92 0,91 0,92 0,91 0,91 - - - - - - - 0,62 0,61 0,62 0,63 - - Phân đoạn 3-9 dịch màu vàng nhạt đem cô, cất quay chân không, sau kết tinh thu bột kháng sinh màu vàng cam có khối lượng 0,0136 g 3.9.3 Chạy cột sắc ký lần Nhận thấy phân đoạn 10-13 phân nhóm 3.2 cịn vết kháng sinh 2, tiếp tục gộp dịch 0,0094g KS cô chân không đến kết tinh, chạy cột sắc ký lần với hệ dung môi ethylacetat : methanol (9:1) Lấy 15 phân đoạn, phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch, tiến hành sắc kí lớp mỏng phân đoạn 40 Bảng 3.20: Kết SKLM sau chạy cột lần (P mirabilis) PĐ Rf vết1 Rf vết2 0,91 0,91 0,90 0,91 0,91 0,61 0,62 0,61 - - - - - - - - 11 13 15 0,60 0,61 0,63 - - - Phân đoạn 1-5 dịch màu vàng cô 0,0027g KS Lượng KS2 = 0,0027 + 0,0136 = 0,0163g Hiệu suất trình tinh chế 42,67% Vậy HKS2 = 42,67% 36,87% = 15,73% Bột kháng sinh tiếp tục dùng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy phổ khối 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết • Nhiệt độ nóng chảy (KS1): 186,4ºC • Phổ tử ngoại (KS1): cho đỉnh hấp thụ ở: 207nm, 341nm, 443nm Từ đó, dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, kết hợp đặc điểm • Phổ khối MS (KS1): phân tử lượng KS thu dự đoán 1268 đvC • Phổ hồng ngoại IR (KS1): Dựa vào đỉnh hấp thụ phổ IR (hình P15) dự đoán cấu trúc phân tử kháng sinh có nhóm chức : + 3432 cm-1 đặc trưng cho liên kết N - H (amid, amin bậc bậc 2) + 2928; 2962 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – H (alkan) + 2582 cm-1 đặc trưng cho liên kết O – H (acid) + 1743 cm-1 đặc trưng cho liên kết C = O (ester, ceton, aldehyd) + 1650 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức amid (R-CO-NR’R”) imin (C = N) + 1473 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức C=C(aromatics) + 1298 cm-1 đặc trưng cho liên kết S = O liên kết C = F + 1263 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- O- C( alcol) + 1191; 1097; 1022 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – N C – O 41 + 870; 798 cm-1 đặc trưng cho liên kết C = C (alken) + 723 cm-1 đặc trưng cho CH2 (alkan) + 705 cm-1 đặc trưng cho nhóm alkyl clorid + 634 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – Br 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, hoàn thành mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệp kết thu sau:  Chủng Streptomyces 168.27 chọn lọc ngẫu nhiên gây đột biến lần ánh sáng UV, đột biến hóa học Biến chủng sau đột biến hóa học có hoạt tính kháng sinh tăng lên nhiều, đặc biệt vi khuẩn Gram(-) so với chủng gốc  Lựa chọn môi trường nuôi cấy, lên men tối thích MT2, MT2dt Kháng sinh Streptomyces 168.27 sinh tổng hợp chiết từ dịch lên men Ethylacetat pH 5, tinh chế phương pháp sắc ký rửa giải cột  Kháng sinh Streptomyces 168.27 sinh tổng hợp có số đặc điểm sau:  Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn Gram(+) vi khuẩn Gram(-)  Kém bền với nhiệt độ  Bền với pH acid, vùng trung tính, khơng bền với pH base mạnh  Có thành phần hoạt động kháng sinh thô thu  Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng KS1: 21,23%; KS2: 15,73%  Kháng sinh sau tinh chế có nhiệt độ nóng chảy 186,40C, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại, với khối lượng phân tử dự đoán 1268 đvC Cấu trúc phân tử kháng sinh dự đốn chứa nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố Các nhóm chức có kháng sinh là: Alkan, Alken, Sulfon, Alkyl clorid , Imin, Nitro, Amid, Ester, Amin 43 KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo hướng sau:  Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống nhiều phương pháp khác (đột biến bậc thang, đột biến hóa chất ), khảo sát điều kiện lên men tối ưu để tạo biến chủng có khả siêu tổng hợp kháng sinh với sản lượng hoạt tính cao  Giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học Streptomyces 168.27  Nghiên cứu phương pháp chiết, tách để tạo kháng sinh với độ tinh khiết hiệu suất cao Chiết tách để thu lấy kháng sinh phụ nghiên cứu sâu  Tiếp tục đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học kháng sinh, tiến hành nghiên cứu thêm tính chất vật lý, hóa học, dược lý…của kháng sinh thu để tiến tới sản xuất công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2 Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Bộ Y tế (2007), Dược lý học 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 2, tr 130-142 Bộ Y tế (2006), Hóa dược, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập Bộ Y tế (2008), Hóa phân tích, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 2, tr.26-40, 81-93 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 22-87 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng(1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXBKHKT Hà Nội, Tập 1, tr 328 - 345 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, tr 38-40 11 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu-Phân loại xạ khuẩn 12 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, luận văn thạc sỹ sinh học 13 Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp 14 Hồ Viết Quý (2002), Chiết, tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu I, Nhà xuất ản Khoa học kỹ thuât, tr 9-52 15 Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 35-57 16 Nguyễn Văn Thanh (2007), Sinh học phân tử, NXB Y Học, tr 165-183 17 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr 40-52 18 Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội, Việt Nam Tiếng Anh 19 Crnovčić I, Vater J, Keller U, Occurrence and biosynthesis of Cdemethylactinomycins in actinomycin-producing Streptomyces chrysomallus and Streptomyces parvulus, Institut fuer Chemie, Arbeitsgruppe Biochemie und Molekulare Biologie, Technische Universitaet Berlin, Berlin-Charlottenburg, Germany 20 Makoto Takagi (2006), Basic analytical chemistry, the Kagakudojin publisher, Japan 21 Sudha, S, Masilamani, Selvam M, Characterization of cytotoxic compound from marine sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4, Asian Pacific journal of tropical biomedicine (Asian Pac J Trop Biomed) ), vol (10): 770-3, 2012 22 Vasanthakumar A, Kattusamy K, Prasad R, biosynthesis in Streptomyces peucetius - Regulation of daunorubicin feed forward and feedback transcriptional control, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 1G, Royal Parade, Parkville, Melbourne, Victoria, Australia PHỤ LỤC Hình P7: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến Hình P8: Thử hoạt tính KS biến chủng sau ĐB1 phương pháp khối thạch (P mirabilis) Hình P9: Thử HTKS MT lên men Hình P10: Sắc kí lớp mỏng phân nhóm 1.1 (3-10) Hình P11: Kết sắc kí lớp mỏng hình VSV Hình P12: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột phương pháp khoanh giấy lọc (P.mirabilis) Hình P13: Sắc ký cột Hình P14: Bột kháng sinh sau cất quay, kết tinh Hình P15: Kết đo phổ tử ngoại Hình p16: Kết đo phổ hồng ngoại Hình P17: Kết qủa đo khối phổ (negative) Hình P18: Kết đo khối phổ (positive) ... khả sinh tổng hợp kháng sinh, chi xạ khuẩn Streptomyces với khả tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc điểm Chính chúng tơi lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces. .. 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.6 Xác định độ bền kháng sinh dịch lên men 22 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 22 2.3.8 Tách thành phần kháng. .. Streptomyces 168. 27” làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 168. 27 - Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết,