Luận văn góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 21​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HUY TRÌNH GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội, 05/2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HUY TRÌNH GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực : Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học Trường Đại Học Dược Hà Nội Hà Nội, 05/2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS -TS Cao Văn Thu - người đã tận tình hướng dẫn từ những bước đầu tiên cho đến hoàn thiện khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nợi , Bộ mơn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp này cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ suốt thời gian thực hiện khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm cũng kiến thức của bản thâ n có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16, tháng 5, năm 2013 Sinh viên NGUYỄN HUY TRÌNH MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh 1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 1.2.3 Phân loại xạ khuẩn 1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh .6 1.4 Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao nhờ sàng lọc ngẫu nhiên 1.4.2 Đột biến cải tạo giống .7 1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.6 Chiết tách và tinh chế sản phẩm .9 1.7 Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 10 1.7.1 Phổ hồng ngoại (IR) 10 1.7.2 Phổ tử ngoại (UV) 10 1.7.3 Khối phổ (MS) 11 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 11 1.8.1 Tối ưu hóa thống kê q trình lên men để tăng cường hoạt tính kháng sinh Streptomyces sp.CS392 11 1.8.2 Một chủng Streptomyces sp với nhiều đặc điểm hứa hẹn thúc đẩy phát triển cúa nông nghiệp dịch bệnh .12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp thực nghiệm 16 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống .16 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 16 2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 17 2.3.4 Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 17 2.3.5 Phương pháp đột biến .18 2.3.6 Phương pháp lên men mẻ 19 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh dịch lên men 20 2.3.8 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu .20 2.3.9 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký .20 2.3.10 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 22 2.3.11 Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1 Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên 23 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 24 3.3 Kết đột biến cải tạo giống lần 25 3.4.Kết cải tạo giống lần tác nhân hóa học 27 3.5 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 28 3.6 Kết đánh giá ảnh hưởng pH nhiệt độ đến độ bền kháng sinh dịch lọc 30 3.7 Kết chọn dung môi chiết xuất kháng sinh 31 3.8 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 32 3.9 Kết sắc ký cột .33 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy sơ xác định nhóm chức đặc trưng kháng sinh thu 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên CW Thành tế bào - Cell wall DMHC Dung môi hữu ĐB Đột biến Gr Gram IR Hồng ngoại - Infrared KH Khoa học KS Kháng sinh L-DAP L - diaminopimelat MTdt Môi trường dịch thể MTth Mơi trường thích hợp TB Tế bào TĐC Trao đổi chất VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại – Ultraviolet B subtilis Bacillus subtilis P mirabilis Proteus mirabilis G(+) Gram dương G(-) Gram âm SK Sắc ký DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3: Các môi trường kiểm định Bảng 4: Các dung môi sử dụng Bảng 5: Kết chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 155.21 Bảng 6: Kết hoạt tính KS sau đột biến UV lần Bảng 7: Kết hoạt tính KS sau đột biến UV lần Bảng 8:Kết hoạt tính KS sau đột biến hóa học Bảng 9: Kết chọn môi trường lên men Bảng 10: Kết lên men dạng chủng, biến chủng MT2dt Bảng 11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền kháng sinh dịch lọc Bảng 12: Ảnh hưởng pH đến độ bền KS sau ngày sau ngày Bảng 13: Kết chiết kháng sinh DMHC pH khác Bảng 14: Kết SK lớp mỏng chọn hệ dung mơi (hiện hình VSV P mirabilis) Bảng 15: Kết thử hoạt tính KS phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 16: Kết SK lớp mỏng phân đoạn 1-15 (hiện hình P mirabilis) Bảng 17: Kết thử hoạt tính KS phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 18: Kết SK lớp mỏng phân đoạn 1-15 (hiện hình P mirabilis) Bảng 19: Kết thử hoạt tính KS phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 20: Kết SK lớp mỏng phân đoạn 1-10 (hiện hình P mirabilis) Bảng 21: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau chạy cột lần Bảng 22: Kết SK lớp mỏng phân đoạn từ 1-4 ( hình P.mirabilis) Hình 1: Sơ đờ tởng quát sinh tổng hợp kháng sinh PHỤ LỤC Phụ lục 1: Biến chủng Streptomyces 155.21 cấy zizag ống thạch nghiêng vào đĩa Petri cho vào tủ ấm đĩa Petri chứa biến chủng Streptomyces 155.21 sau ngày nuôi cấy tủ ấm Phụ lục 2: Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khối thạch phương pháp giếng thạch Phụ lục 3: Bình lên men đặt máy lắc bắt đầu trình nhân giống cấp 1, bình nhân giống cấp bình chứa sản phẩm lên men kết thúc trình lên men Phụ lục 4: Cột sắc ký trình chạy cột lần kết thử hoạt tính kháng sinh sau q trình chạy cột Phụ lục 5: Phổ MS chất kháng sinh KS1 phân lập Phụ lục 6: Phổ UV chất kháng sinh KS1 phân lập Phụ lục 7: Phổ IR chất kháng sinh KS1 phân lập ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng kháng sinh phát vào tháng 10/1928 Penicillin sử dụng vào năm 1943, mở kỷ nguyên y học lâm sàng ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh Ngồi sử dụng dự phịng điều trị bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm, bệnh ung thư cho người, kháng sinh cịn dùng chăn ni, trồng trọt công nghiệp thực phẩm Do sử dụng tràn lan khơng cách nên tình trạng kháng kháng sinh ngày trở nên nghiêm trọng Kháng sinh lớp hoạt chất hữu ích có tác dụng sinh học mạnh, tổng hợp từ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm từ số thực vật bậc cao Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ sinh học đại hỗ trợ nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm ứng dụng kháng sinh đạt thành tựu rực rỡ Con người khơng tìm kiếm chủng vi sinh vật sinh kháng sinh từ tự nhiên mà cải tạo chúng nhiều phương pháp dùng kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp Trong số 15000 kháng sinh biết đến giới khoảng 60% xạ khuẩn tạo ra, khoảng 55% chi Streptomyces sản xuất Đây chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có khả sinh tổng hợp kháng sinh, số lồi có khả sinh tổng hợp chất chữa ung thư, điều trị HIV Do đó, chi xạ khuẩn nước giới tập trung nghiên cứu Tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường ĐH Dược Hà Nội, chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.21” với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh lựa chọn mơi trường lên men thích hợp chủng Streptomyces 155.21 - Nghiên cứu vài đặc tính kháng sinh sinh tổng hợp 40 24,46 0,56 20,35 0,42 14,32 0,56 Bảng 22: Kết SKLM phân đoạn từ 1-4 hình VSV( P.mirabilis) Các phân đoạn Rf Vết Vết 0,45 - 0,45 - 0,46 - 0,46 - Nhận xét: Các phần sau có vết mờ mỏng khơng hình thử hoạt tính P mirabilis Các phân đoạn từ 1-4 chạy cột lần góp chung với phân đoạn chứa KS1 lần chạy cột trước (phân đoạn từ 1-4 chạy cột lần phân đoạn 1-5 chạy cột lần 2) Kết tinh lại nhiều lần thu 0,031 g chất kháng sinh tinh KS1, hiệu suất tách 14,72% so với lượng kháng sinh thô chạy cột ban đầu 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy sơ xác định nhóm chức đặc trưng kháng sinh thu  Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh đo là: 217,30C  Phổ IR (KBr) νmax cm-1 (Phụ lục ): 3455 (-OH; =NH); 3045,93 (-C=C-; Ar); 2925,79 2826,18 (-COOH có liên kết cầu hydroxyl); 1659,7(-C=N; C=C); 1582 (C=O); 1268,83 1100,38 ( R-OH; -C-O-C-; -COOH; RCOOR1)  Phổ UV (MeOH) λmax (Phụ lục ): Phổ UV có đỉnh hấp thụ bước sóng 443nm 226,5 nm chứng tỏ cấu trúc kháng sinh có nhân thơm, có liên kết bội liên hợp có dị tố O, N, Halogen…  Phổ khối (ESI-MS) (Phụ lục ): m/z = 1267 [M-Na]-, 1291 [M+H]+ Từ suy khối lượng phân tử dự kiến 1268đvC 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau trình nghiên cứu, chúng tơi hồn thành mục tiêu khóa luận tốt nghiệp, kết thu sau:  Chủng Streptomyces 155.21 sàng lọc ngẫu nhiên gây đột biến 02 lần ánh sáng UV (lần 1, 2) 01 lần tác nhân acid nitrơ HNO2 (lần 3), biến chủng sau đột biến lần có hoạt tính kháng sinh tăng lên rõ rệt tăng 140% so với chủng xuất phát  Lựa chọn mơi trường lên men tối thích MT2dt (hoạt tính kháng sinh chủng lên men cao 123,89% MT1dt, 138,74% MT5dt thử hoạt tính VSV kiểm định B.subitilis)  Kháng sinh Streptomyces 155.21 sinh tổng hợp chiết kiệt từ dịch lên men Ethylacetat pH  Kháng sinh sau tinh chế có nhiệt độ nóng chảy 217,30C, từ phổ IR UV sơ dự đốn cấu trúc kháng sinh có nhân thơm, có liên kết bội liên hợp số nhóm chức -OH, =NH-, -C=C-, -COOH, C=O, Ar-, RCOOR1  Khối lượng phân tử dự kiến 1268 đvC  Hiệu suất tách tinh chế KS1: 14,72% 42 Kiến nghị  Giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học Streptomyces 155.21 để dễ dàng nghiên cứu  Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống nhiều phương pháp khác để tạo biến chủng siêu tổng hợp kháng sinh  Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men (Bằng cách thay đổi điều kiện lên men, thành phần mơi trường, tốc độ lắc…)  Tìm quy trình chiết tách kháng sinh để nâng cao hiệu suất tinh chế tạo kháng sinh tinh khiết  Tiếp tục đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học kháng sinh sinh tổng hợp  Thử tác dụng sinh học invivo, in vitro để có ứng dụng thực tế TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ mơn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 23-69, 125-147, 215-219, 318 Bộ môn Vi sinh- Sinh học (2005), Thực tập vi sinh- ký sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 37-54 Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 2, tr 130-142 Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 1, tr.105-119 Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 68-82, 115-133 Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 2, tr.26-40, 81-93 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 22-87 Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm độc chất, Trung tâm Thông tin- Thư viện ĐH Dược, Hà Nội, tr 40-41, 49-59 Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 167-172 10 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 11-16 11 Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1516, 50-56 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, tr 38-40 13 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu-Phân loại xạ khuẩn http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm 14 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên Luận văn thạc sỹ Sinh học, trường Đại học Sư Phạm, Thái Nguyên, tr.3-16 15 Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.42-54 16 Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (2000), Cơ sở di truyền học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 40-49 17 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr.9-27 18 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 185-191 19 Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 14-57 20 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 9-49 21 Trịnh Thị Thịnh (2009), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 80.259 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh 22 Alan M, Phamis, Abdul-Khaliq, Srivastavask, Samad A, Gupta MK (2012), A promising strain of streptomyces sp with agricultural traits for growth promotion and diesea management, Department of Plant Phathology, CSIRcentral institute of Medicinal &Aromatic, Plants (CIMAP), Lucknown 226015, India 23 Mander P, Choi YH, Seong JH, Na BH, Choss, Lee Hyun Joong, Yoo JC (2013), Statistical optimization of a multivariate fermention process for enhacing antibiotic activity of Streptomyces sp.CS 392, Department of Pharmacy, Chosun University, Gwagju, South Korea 24 Tomoniko Tanura, Yuumi Ishida, Misaotoguro, Kazunori Hatano and KenIchiro Suzuki (2008), Classification of Streptomyces tenebrarius, Higgins and kaster as Steptoalloterichus tenebarius nom, rev, comb and emended description of the genus Streptoalloteichus, Biological Resource center (NBRC), National Insitute of Techology and Evaluation, 2-5-8 Kazusaka Matari, Kisarazu, Chiba, Japan [ International journal of Systematic and Evolution Microbiology] 25 Poulsen M, Oh DC, Clardy J, Currie CR (2011), Chemical analyses of waspassociated streptomyces bacteria reveal a prolific potential for natural products discovery, Department of Bacteriology, University of WisconsinMadison, Madison, Wisconsin, United States of America Phụ lục : Biến chủng Streptomyces 155.21 cấy zizag ống thạch nghiêng đĩa Petri cho vào tủ ấm đĩa Petri chứa biến chủng Streptomyces 155.21 sau ngày nuôi cấy tủ ấm Tủ ấm Memmert ,Binder Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 155.21 Phụ lục 2: Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khối thạch phương pháp giếng thạch Thử hoạt tính KS biến chủng sau ĐB2 phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P.mirabilis.) pH pH pH 11 pH pH Thử ảnh hưởng pH đến độ bền KS phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Phụ lục 3: Bình lên men đặt máy lắc bắt đầu trình nhân giống cấp 1, bình nhân giống cấp bình chứa sản phẩm lên men kết thúc trình lên men Bình lên men đặt vào máy lắc bắt đầu trình tạo giống cấp Bình nhân giống cấp Bình chứa sản phẩm lên men sau kết thúc trình lên men Phụ lục 4: Cột sắc kí q trình chạy lần kết thử hoạt tính kháng sinh sau q trình chạy cột Hình dạng cột sắc kí chạy cột lần Thử hoạt tính phân đoạn chạy cột lần phương pháp khoanh giấy lọc (VSV kiểm định P.mirabilis) Hiện hình VSV sắc ký lớp mỏng vết kháng sinh tách (VSV kiểm định P.mirabilis) Phụ lục 5: Phổ MS chất kháng sinh KS1 phân lập Phụ lục 6: Phổ UV chất kháng sinh KS1 phân lập Phụ lục 7: Phổ IR chất kháng sinh KS1 phân lập ... trình nghiên cứu 3.5 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh  Chọn môi trường lên men tốt nhất:  Mục đích: Chọn mơi trường lên men để Streptomyces 155. 21 sinh kháng sinh tốt  Tiến hành lên men Streptomyces. .. cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155. 21” với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh lựa chọn mơi trường lên men thích hợp chủng Streptomyces. .. HUY TRÌNH GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155. 21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực : Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học Trường