Nghiên cứu xác định các đoạn DNA barcode cho dòng bạch đàn lai UP35 (eucalypus urophylla x eucalyptus camadulensis) phục vụ giám định loài (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐOẠN DNA BARCODE CHO DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UP35 (Eucalypus urophylla x Eucalyptus camadulensis) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LỒI NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Hà Văn Huân TS Bùi Thị Mai Hương Sinh viên thực : Hoàng Trường Sơn Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Trường Đại học Lâm Nghiệp, để vượt qua khó khăn, thử thách đạt kết mong muốn học tập sống, ngồi cố gắng thân, tơi nhận quan tâm, giúp đỡ từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy tơisuốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Trường Đại học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân, TS.Bùi Thị Mai Hương tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình hồn thành khóa luận Với kiến thức kỹ thầy, cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản quý báu theo giúp sau Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho tơi có mơi trường tốt để học tập, nghiên cứu rèn luyện Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầ y cơ, gia đình, bạn bè, người động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách hồn chỉnh nhất, song khơng thể tránh khỏi thiếu sót Do vậy, tơi mong góp ý thầy bạn để kiến thức tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực Hoàng Trường Sơn ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn gọi khuynh diệp, có tên khoa họclà :Eucalyptus globules Labill Đây lồi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae) Các thành viên chi có xuất xứ từ Úc Có 700 lồi bạch đàn, hầu hết có địa Australia, số nhỏ tìm thấy New Guinea Indonesia vùng viễn bắc Philippines Đài Loan Các loài bạch đàn trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ, Việt Nam Đối với bạch đàn trồng thích hợp vừa nhóm đất chua phèn, thích hợp cát, vùng bán khơ hạn.Kém thích hợp nhóm đất mặn, cát di động, đất phèn, mùn núi, xói mịn trơ đá Công dụng đáng để ý khuynh diệp cung cấp dược liệu cho người Trên khuynh diệp có nhiều lỗ khổng chứa tinh dầu có mùi hăng hăng, thơm thơm Cơng dụng dầu khuynh diệp tuyệt vời, bị nghẹt mũi mà hít dầu khuynh diệp vơ đỡ Dầu khuynh diệp dùng để chế loại thuốc dùng khoa nội Nó có tác dụng thận, đồng thời làm cho thần kinh bớt căng thẳng nhờ thở khơng bị dồn dập.Dầu khuynh diệp có tác dụng khử trùng phẫu thuật Gỗ bạch đàn dể xử lý bền dẻo dùng để đóng đồ đạc dùng nhà, vừa dễ xử lý mà lại nhẵn bóng Trước đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa thị hình thái đặc tính sinh lý sinh hóa bên nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống nhiều trường hợp cịn gặp nhiều khó khăn hạn chế như: nhiều sinh vật có hình thái giống thực tế lại khác hệ thống phân loại (hệ gen khác nhau), ngược lại nhiều sinh vật có hình thái khác lại gần hệ thống phân loại (hệ gen giống nhau) Mặt khác, phương pháp phân loa ̣i này dựa đặc điểm hình thái khó phân biệt khác biệt biến dị loài Đặc biệt, mẫu vật có nguồn gốc sinh vật bị biến đổi hình thái như: mẫu sinh vật chết, bị chôn vùi đất, công trình xây dựng, qua chế biến khơng thể xác định thị hình thái Do đó, địi hỏi cần có phương pháp định danh phân loại đại khắc phục hạn chế Việc ứng dụng gen mã vạch, xác định đoạn DNA barcode phương pháp định danh, sử dụng đoạn DNA chuẩn ngắn nằm genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phương pháp xác định đoạn DNA barcode áp dụng phổ biến cho lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Từ những lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho Dòng Bạch đàn lai UP35 (Eucalypus urophylla x Eucalyptus camaldulensis) phục vụ giám định loài” để phân loại, lựa chọn xây dựng liệu gen quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý quốc gia MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Tổng quan Bạch đàn lai: 11 1.1.1 Phân loại khoa học: .11 1.1.2 Phân bố: 11 1.1.3 Đặc điểm sinh học: 12 1.1.4 Giá trị sử dụng: 12 1.2 Tổng quan DNA barcode ( DNA mã vạch): 13 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA barcode: 13 1.2.2 Một số DNA barcode sử dụng 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 26 2.1.1 Mục tiêu chung: 26 2.1.2 Mục tiêu cụ thể: 26 2.2 Nội dung nghiên cứu: 26 2.3 Dụng cụ, vật liệu ,hóa chất sử dụng nghiên cứu: .26 2.4 Phương pháp nghiên cứu: 29 2.4.1 Tách chiết ADN tổng số: .29 2.4.2 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu: 32 2.4.3 Tinh sản phẩm PCR: 35 2.4.4.Phương pháp đọc trình tự .35 2.4.5 Xử lý số liệu 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 37 3.1 Kế t quả tách chiế t DNA tổ ng số 37 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR .37 3.3 Phân tić h kế t quả 38 3.3.1 Xác định phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu .38 3.4 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS, trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK 57 3.5 Thảo luận 58 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .58 4.1 Kết luận: 58 4.2 Kiến nghị: 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 tách dòng DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Các chữ Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt viết tắt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data bp Base pair Cặp base 5 CBOL Consortium for the Barcode Consortium for the of Life Barcode of Life Convention on International CITES Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora cpDNA CTAB Cytb 10 DNA Cơng ước bn bán quốc tế lồi nguy cấp gen lục lạp Chloroplast DNA Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Cytochrome b Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate (ADN) 11 dNTP 12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic axit ethylenediamine acid tetraacetic 15 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi 16 IGS Intergenic Spacer vùng liên gen 17 ITS Internal Transcribed Spacer vùng DNA nằm gen 18 kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 20 NAD(P)H Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate NCBI 21 National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học 22 ORF Open Reading Frame Khung đọc mở 23 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase 24 PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone 25 RFLP Restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự polymorphism DNA 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate 29 R-Primer Reverse primer Mồi ngược 30 TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA 31 trnA Transfer RNA ARN vận chuyển 31 UV Untraviolet Tia cực tím DANH MỤC HÌNH lên Hình 1.1 Hình thái Bạch đàn 12 Hình 3.1 Kết mẫu Bạch đàn lai tách chiết DNA tổng số 37 Hình 3.2 Kế t quả nhân gen ITS, trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK 38 Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS tạo Mega X 40 Hình 3.4 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS dịng Bạch đàn lai UP35laivàEucalyptus camaldulensis ( vị trí sai khác bơi đỏ) 43 Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo mega x 45 Hình 3.6 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA dòng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis ( vị trí sai khác bơi đỏ) 46 Hình 3.7 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạnrbcLtạo NCBI 48 Hình 3.8 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcLgiữa dịng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis .49 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với lồi Bạch đàn ngân hàng gen NCBI 50 Hình 3.9 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạnITS2tạo NCBI 51 Hình 3.10 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 dịng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis ( vị trí sai khác bơi đỏ) 52 Hình 3.11 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 54 Hình 3.12 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK dịng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis .57 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học Bạch Đàn lai .11 Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu Bạch đàn lai sử dụng cho nghiên cứu 26 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách A (100µl) .27 Bảng 2.3 Thành phần đệm tách B (100µl) .27 Bảng 2.4 Thành phần đệm TE (100µl) 27 Bảng 2.5 Thành phầ n phản ứng PCR 32 Bảng 2.6 Chu kì nhiê ̣t cho phản ứng PCR 33 Bảng 2.7 Trình tự thơng tin cặp mồi 33 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoạn gen ITS tương đồng với dòng Bạch đàn lai UP35lai ngân hàng gen NCBI 39 Bảng 3.2 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP35 lai với loài khác đoạn ITS 40 Bảng 3.3 Một số loài có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với dịng Bạch đàn lai UP35 ngân hàng gen NCBI 44 Bảng 3.4 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP35 với loài khác đoạn trnH-psbA 45 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng với dòng Bạch đàn lai UP35 ngân hàng gen NCBI 47 Bảng 3.6 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dịng Bạch đàn lai UP35 với lồi khác đoạn rbcL .48 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Bạch đàn ngân hàng gen NCBI 50 Bảng 3.8 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dịng Bạch đàn lai UP35 với lồi khác đoạn ITS2 51 Bảng 3.9 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với loài Bạch đàn ngân hàng gen NCBI 54 lai UP35 (E urophylla x E Camaldunensis)chúng nghiên cứu có quan hệ gần gũi với lồi E Camaldunensisvới khoảng cách di truyền 0.0000 xa với loài Plinia aureanavới khoảng cách di truyền 0.0122 Sau so sánh cấp độ lồi theo đoạn gen rbcLcủa loài Bạch đàn (loài E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen lồi Eucalyptus camaldulensis ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KC180791.1, nhận sai khác đoạn gen thể hình 3.7 sau: hình 3.7? Hình 3.8 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL dòng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis Nhận xét : Từ kết thu hình 3.9 nhận thấy tỷ lê ̣ tương đờ ng trình tự gen rbcLlồi Bạch đàn (lồi E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen lồi Eucalyptus camaldulensistrên NCBIlà 100% 3.3.1.4 Trình tự ADN đoạn gen ITS2 loài Bạch đàn lai Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen ITS2 nhân có kích thước 214bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Bạch đàn lai sau: CACATGGCGTTGCCCCTAATCCCCTCCGTCCTCTAAACGGGGCGAGCGG GACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCCGGTTGG CCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTG ATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCGCGTGCCGCTCATCGCGCGCTCCG CGAATCTGCTCCTTACCAAC Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen ITS2 dòng Bạch đàn lai UP35 cách sử dụng công cụ BLASTn 49 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng dùng so sánh với dòng Bạch đàn lai UP35 trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với lồi Bạch đàn ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tương đồng Eucalyptus mooreana KT631216.1 99.07% Eucalyptus pellita KT631261.1 98.60% Eucalyptus urophylla HM596068.1 99.07% Eucalyptus vernicosa KT631386.1 98,13% Sau đó, số lồi có trình tự gen tương đồng với Bạch đàn lai bảng 3.7 sử dụng xây dựng phân loại tìm mối quan hệ lồi phần mềm mega x khoảng cách di truyền lồi sau: 50 Hình 3.9 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo NCBI Bằng phần mềm mega 10 nhận khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP35với loài khác sau: Bảng 3.8 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP35 với loài khác đoạn ITS2 E.urophylla x E E vernicosa urophylla E pellita E E.camaldunensis mooreana UP35 E vernicosa E urophylla 0.0190 E pellita 0.0336 0.0142 E mooreana 0.0287 0.0094 0.0047 0.0190 0.0000 0.0142 E.urophylla x E.camaldunensis UP35 0.0094 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS2 bảng so sánh khoảng cách di truyền Bạch đàn lai với loài khác cho thấy: Dòng Bạch đàn lai UP35(E urophylla x E Camaldunensis)chúng tơi nghiên cứu có quan hệ gần gũi 51 với loài E urophylla với khoảng cách di truyền 0.0000 xa với loài E vernicosa với khoảng cách di truyền 0.0190 Sau so sánh cấp độ loài theo đoạn gen ITS2 loài Bạch đàn (loài E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen lồi Eucalyptus camaldulensis ngân hàng gen quốc tế NCBI, nhận sai khác đoạn gen thể hình 3.10 sau: Hình 3.10 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 dòng Bạch đàn lai UP35vàEucalyptus camaldulensis ( vị trí sai khác bơi đỏ) 52 Nhận xét : Từ kết thu hình 3.11 nhận thấy tỷ lê ̣ tương đờ ng trình tự gen ITS2 lồiBạch đàn lai (lồi E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen loài Eucalyptus camaldulensistrên NCBI là 98,09% và có điể m sai khác : 3.3.1.5 Trình tự ADN đoạn gen matK dòng Bạch đàn lai UP35 Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen matKđược nhân có kích thước 643bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu Kết giải trình tự đoạn gen matK mẫu Bạch đàn lai sau: TTGATAGAAGTAATATCCAAATACCAAATCCGCCCTCTATATAACCTTC GTGAAGTAGAATAAGTTCTTGGGAAGATCAAAGAAAGAACAACTTCTT CCTCCGTAAGGAATTCTTCCAAAAATTCCGAACCTAATCTTTTTAAAAA AGTACGTACAGTCTTTTTGTGTTTACGAGCCAAAGTTTTAACACAAGAA AGTCGAAGTATATATTTTACTCGATATAAACTCTTTTTTTTTGAGGATCC GCTGTGATAATGAGAAAGATTTCTGGATATACGCAAAAAACGGTCGAT AATATCAGAATCTGATGAATCAGCCCGGGTCGGTTTACTAATGGGATG CCCTAATGTGTCACAAAAATTCGCTTTAGACAATGATCCAATCAGAGG AATAATTGGAACTATTGTCTCGAACTTCTTCATAGCATTATTTATTAGA AATGAATTTTCTAGCATTTGACTTCGTACCACTGAAGAATTTAGTCGCA CGCTTGAACGATAGCCCAAAAAGTAAAGAGAATACTTGCATAATTGGT TTATATCGATCCTTCCTGGTTGAAACCAGGCGTAAAAATGATATTGCCA TAAATTAACAAGGTAATATTTCCATTTCTTCATCAGAAGAGGCGTATCT TTTGAAGCCA Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen matKở loài Bạch đàn cách sử dụng cơng cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng dùng so sánh với dịng Bạch đàn lai UP35 trình bày bảng 3.9 53 Bảng 3.9 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với loài Bạch đàn ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tương đồng Eucalyptus camaldulensis KC180791.1 100% Eucalyptus diversicolor KC180795.1 99.38% Eucalyptus elata KC180776.1 99.22% Syzygium australe AF368221.1 97,51% Sau đó, số lồi có trình tự gen tương đồng với Bạch đàn lai bảng 3.9 sử dụng xây dựng phân loại tìm mối quan hệ loài phần mềm mega x khoảng cách di truyền loài sau: Hình 3.11 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 54 Bằng phần mềm mega 10 nhận khoảng cách di truyền dịng Bạch đàn lai UP35với lồi khác sau: Bảng 3.10 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dịng Bạch đàn lai UP35 với lồi khác đoạn matK E.urophylla x S E E australe elata E E.camaldunensis diversicolor camaldulensis UP35 Syzygium australe Eucalyptus elata 5.3541 Eucalyptus diversicolor 5.4609 0.0110 Eucalyptus camaldulensis 5.4170 0.0078 0.0063 5.4170 0.0078 0.0063 E.urophylla x E.camaldunensis UP35 0.0000 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS2 bảng so sánh khoảng cách di truyền Bạch đàn lai với lồi khác cho thấy: Dịng Bạch đàn lai UP35(E urophylla x E Camaldunensis)chúng nghiên cứu có quan hệ gần gũi với lồi E Camaldunensis với khoảng cách di truyền 0.0000 xa với loài S australe với khoảng cách di truyền 5.4170 Sau so sánh cấp độ lồi theo đoạn gen matKcủa loài Bạch đàn (loài E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen lồi Eucalyptus camaldulensis ngân hàng gen quốc tế NCBI , nhận sai khác đoạn gen thể hình 3.11 sau: 55 56 Hình 3.12 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK dòng Bạch đàn lai UP35 Eucalyptus camaldulensis Nhận xét : Từ kết thu hình 3.13 nhận thấy tỷ lê ̣ tương đồ ng trình tự gen matK dịng Bạch đàn lai UP35 (lồi E urophylla x E camaldunensis _UP35) với trình tự gen loài Eucalyptus camaldulensistrên NCBIlà 100% 3.4 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS, trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen ITS , trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK loài Bạch đàn (loài E urophylla x E camaldunensis _UP35) , ta lập bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS , trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK bảng 3.11 Bảng 3.11 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình ITS , trnH-psbA , rbcL , ITS2, matK Tên đoạn gen ITS rbcL ITS2 trnH-psbA matK Số điểm sai khác 5 12 Kích thước trình tự 563 743 296 626 643 Tỷ lệ sai khác 0.88% 0% 1.6% 1.91% 0% Nhâ ̣n xét:Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự ITS, ITS2 ,matK, rbcL trnH-psbA dòng bạch đàn lai : trình tự đoạn gen matK rbcL có khơng có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA có 12 điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự trnH-psbA cao (1,91%) khả phân biệt loài gen trnH-psbA tốt tỉ lệ sai khác trình tự rbcL matK thấp (0,%) đồng nghĩa với khả phân biệt loài đoạn gen thị Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự ITS, ITS2 ,matK, rbcL trnH-psbA để xác định xác loài cần định danh 57 3.5 Thảo luận Từ kết khoảng cách di chuyển phát sinh chủng loại, bước đầu kết luận bạch đàn lai ( UP35 ) có tương đồng gần với hai loài Eucalypus urophylla Eucalyptus camaldulensis Kết phù hợp Bạch đàn lai UP35 kết lai loài Eucalypus urophylla Eucalyptus camaldulensis Kết hợp với so sánh hình thái cho thấy lồi đem so sánh có đặc điểm đặc trưng : Vỏ dày, nứt dọc sâu, nhiều sơ Cành non màu đỏ tím Lá đơn mọc cách Phiến hình trứng đến giáo rộng nhọn dài phía đầu, gốc gần trịn hình nêm Hoa màu trắng vàng , có nang hình trụ hay hình trứng ngược.Như kết nghiên cứu Sein, C.C Mitlưhner, R 2011đã so sánh lồi Eucalyptus urophylla Phú Thọ, Việt Nam có đặc điểm hình thái tương đồng với loài đem so sánh Cũng Roger James Arnold ( 2020 ), nghiên cưu đặc điểm hình thái lồi Eucalyptus camaldulensis Úc cho thấy có đặc điểm vềlá, hoa tương đồng với loài đem so sánh nhiên khác hình dạng thân;lồi Eucalyptus camaldulensiscó thân mọc không thẳng , nhiều nhánh lớn Đặc biệt thị đoạn gen matK Dòng Bạch đàn lai UP35(E urophylla x E Camaldunensis)chúng tơi nghiên cứu có quan hệ gần gũi với loài E Camaldunensis với khoảng cách di truyền 0.0000 xa với loài họ Đào kim nương (S austral) với khoảng cách di truyền 5.4170 trang riêng CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Đã tách chiết DNA tổng số 03/03 mẫu Bạch đàn lai 58 Đã nhân thành công gen matK, rbcL , trnH-psbA, ITS, ITS2 kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu Đã xác định trình tự đoạn gen matK, rbcL , trnH-psbA, ITS, ITS2 Bạch đàn lai Đã xây dựng phát sinh chủng loại dòng Bạch đàn lai UP35 Đoạn trnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK, rbcL, ITS, ITS2 so sánh dòng Bạch đàn lai UP35 với lồi E Camaldunensis Kết phân tích đoạn gen trnH-psbA phù hợp với kết hình thái cho thấy dịng Bạch đàn lai UP 35 có tương đồng gần với hai loài Eucalypus urophylla Eucalyptus camaldulensis Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh 4.2 Kiến nghị: Đưa trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau Nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng đoạn gen matK, rbcL , trnH-psbA, ITS, ITS2 vào việc giám định lồi Dịng Bạch đàn lai Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với thị khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể trang riêng TÀ I LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 59 Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008) Cơng nghệ sinh học, tập 2, ‘ Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA’ NXB khoa học tự nhiên công nghệ Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), “ Sinh học phân tử” , NXB Giáo Dục – Hà Nội Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004),”Kỹ thuật di truyền ứng dụng”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2002), “Công nghệ gen” NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (2004), “ Từ điển thực vật thông dụng”, tập NXB Khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 Hollings worth Pm, G.S Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PloS ONE, 65 10 Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 11 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 60 12 Miwa H, O.I Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et, Al (2009),”Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441, pp 169 – 175 13 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 14 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 15 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbAtrnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 16 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 17 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from noninvasive relatives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 18 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 19 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 20 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 61 21 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Trang wed tham khảo 22 Mã vạch ADN (DNA barcode) Nguyên lý ứng dụng https:/dnabank.vn/publication?id=27 62 63 ... trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu x? ?c định đoạn DNA barcode cho Dòng Bạch đàn lai UP35 (Eucalypus urophylla x Eucalyptus camaldulensis) phục vụ giám định loài? ?? để phân loại, lựa chọn x? ?y dựng liệu gen... hiệu mẫu Bạch đàn lai sử dụng cho nghiên cứu Kí hiê ̣u Chú thić h UP35. 1 Bạch đàn lai mẫu số 26 UP35. 2 Bạch đàn lai mẫu số UP35. 3 Bạch đàn lai mẫu sớ 2.3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu: 2.3.2.1... truyền dòng Bạch đàn lai UP35 với loài khác sau: Bảng 3.2 Bảng so sánh khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP3 5lai với loài khác đoạn ITS E .urophylla x E yilgarnensis E E E E.camaldunensis urophylla