Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo spirulina platensis

Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Trong năm cuối kỉ 20, nhà sinh học phát nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh Vi tảo (Microalgae) sinh vật bậc thấp có ý chúng khơng có chế đặc thù mà cịn sinh trưởng phát triển nhanh Hàng năm có 200 tỉ chất hữu tạo thành tồn giới, số 170- 180 tỉ tảo tạo thành Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối thực vật trái đất Cho đến hàng loạt công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối vi tảo, loại công nghệ khơng ngừng hồn thiện, hạ giá thành nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo mở rộng lĩnh vực dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người thức ăn cho động vật, đặc biệt ngành ni trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học, lượng sạch, hóa chất cơng nghiệp dược phẩm, xử lý môi trường Tuy nước ta có nhiều nghiên cứu loại tảo quy mơ ứng dụng cịn chưa rộng Hiện Đà Nẵng chưa có sở sản xuất sinh khối để phục vụ cho ngành thực phẩm y học, thành phần mơi trường ni cấy cịn sử dụng q nhiều hóa chất nên mơi trường ni cấy đắt, kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, điều kiện để nuôi cấy chưa tốt phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa triệt để, hiệu chưa cao Ngoài ra, chưa có phương pháp bảo quản giống tốt thời gian dài để chủ động nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho đợt sau Trước lý chọn đề tài: “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu sinh khối phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis” Nhằm mục đích tìm mơi trường thành phần hóa chất, rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt phương pháp bảo quản giống thòi gian dài để chủ động q trình ni cấy mang lại tính kinh tế SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung đối tượng thí nghiệm 1.1.1 Vai trị, vị trí tảo Spirulina cơng nghệ sinh học (CNSH) Công nghệ sinh học lĩnh vực công nghệ cao dựa tảng khoa học sống, kết hợp với quy trình thiết bị kỹ thuật nhằm tạo công nghệ khai thác hoạt động sống vi sinh vật, tế bào thực vật động vật để sản xuất quy mô công nghiệp sản phẩm sinh học có chất lượng cao phục vụ cho lợi ích, nhu cầu người đồng thời phát triển kinh tế- xã hội bảo vệ mơi trường [30] Trong tự nhiên vai trị giới tảo (Algae) nói chung, tảo biển với vai trò quang hợp gắn giữ cacbonic tạo khoảng 500 tỷ chất hữu sử dụng (trong có nhiều hoạt chất sinh học quý) thải 90% lượng oxy bầu khí cần cho hô hấp người động vật Chính điều kích thích nghề ni tảo biển đời đặc biệt xuất Công nghệ sinh học vi tảo với tiếng Chlorella, Scenedesmus Spirulina, chúng có nhiều giá trị công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm Trong nhóm tảo Spirulina chọn để phát triển sản xuất loại ưu sau: - Hiệu kinh tế cao góp phần bảo vệ, cải thiện mơi trường: Spirulina đơn giản nhu cầu dưỡng chất mà hiệu sử dụng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ, nước mặn, )…, tạo 16,8 oxy/năm Điều giúp bảo vệ mơi trường khí quyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house) - Giá trị sử dụng vượt khỏi ranh giới truyền thống dùng làm thực phẩm Theo Thạc sĩ- Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y Dược TpHCM, Spirulina nguồn dinh dưỡng quý tự nhiên Nó có đủ thành phần thiết yếu: protein- lipid- glucid khoảng 30 vi lượng hầu hết vitamin cần thiết cho thể, đáp ứng hồn hảo cơng thức chuẩn chế phẩm SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng- vi lượng khống- vitamin FAO/WHO cơng bố sản phẩm cải thiện suy dinh dưỡng tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật Mặt khác, với hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) vitamin cần thiết, tảo Spirulina cịn có giá trị dược liệu, giúp thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ điều trị bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song song đó, tảo Spirulina có tác dụng phịng chống số bệnh ung thư hoạt chất tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen Năm 1996- 1997, nhóm nhà khoa học người Nhật phân lập xác định cấu trúc hoạt chất Spirulina đặt tên Spirulan (Ca-Sp) Các thử nghiệm chứng tỏ Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type virus Herpes simplex type [31] - Tham gia vào việc xử lý mơi trường: ngồi việc cung cấp dưỡng khí oxy, Spirulina cịn có khả gắn giữ mạnh cation độc chì, thuỷ ngân, cadimi, nên chúng dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29] - Spirulina đối tượng chuyển tải tiến khoa học kỹ thuật đại công nghệ sinh học: + Ni định hướng thu chất có lợi cho dinh dưỡng trị bệnh cho người động vật Đã có tiến ni cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá, phịng chống ung thư )v.v Hoặc ni với tiền chất định hướng cho sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten Sự thành công tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina tìm tịi cơng nghệ phù hợp, cho lơ/mẻ sinh khối Spirulina có giá trị y dược + Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen kỹ thuật phân lập gen từ thể cho (donor) cấy ghép vào máy di truyền thể nhận (receiver) nhằm tạo tính trạng cần thiết từ thể Kỹ thuật tân tiến nghiên cứu với Spirulina hướng sau:  Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí Spirulina giúp vi sinh vật mặt nước dễ dàng Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh giun phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus Một cách hiệu cắt đứt vector truyền bệnh diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng ) chúng Hiện số nghiên cứu cho thấy có vi sinh vật, vi nấm thực điều Tuy vậy, việc phải sống trôi mặt nước (môi trường ấu trùng loại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi lại điểm khơng có yếu vi sinh vật Do tách gen di truyền tạo phao khí mặt nước Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo đặc điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh [1]  Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: ghép vào Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen có vi khuẩn Aleutroplus, để tạo giống Spirulina có đặc tính phát triển sinh khối nhanh, đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp Trích ly chất P.H.B để sản xuất nhựa thay nhựa dẻo (như polystyrene) chất dẻo dễ bị phân huỷ không làm ô nhiễm môi trường v.v [22] - Spirulina tương đối thích nghi với quy mơ sản xuất: thu hoạch từ tự nhiên nuôi quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), điều kiện bán tự nhiên với kỹ thuật đơn giản nuôi trồng thuỷ sản, nuôi quy mô công nghiệp [11] 1.1.2 Phân loại học Mang nhiều tên gọi khác Spirulina, Arthrospira chủ đề thảo luận nhiều từ trước đến nay, tên “tảo” nhắc đến lần Năm 1852, việc phân loại học viết Stizenberger Ông đưa tên loài Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào, dạng xoắn Gomont khẳng định nghiên cứu Stizenberger vào năm 1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm lồi khơng có vách ngăn Spirulina lồi có vách ngăn Arthrospira Như vậy, tên công nhận Arthrospira, hoạt động khảo sát nghiên cứu Arthrospira gọi Spirulina, tên Spirulina sử dụng phổ biến thay cho tên Arthrospira SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 1.1.3 Đặc điểm sinh học Spirulina Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]: Chi : Spirulina (Arthrospira) Họ : Oscillatoriceae Bộ : Oscillatoriales Lớp : Cyanophyceae Ngành : Cyanophyta 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” “spiral” biểu hình dạng xoắn Spirulina tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, tế bào phân biệt vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lị xo khơng phân nhánh, số vịng xoắn lớn 6- vịng Đường kính xoắn khoảng 35- 50m, bước xoắn 60m, chiều dài sợi tảo đạt 250m Nhiều trường hợp Spirulina có kích thước lớn Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều tế bào riêng rẽ liên kết với cầu liên bào Sợi tảo Spirulina có khả chuyển động tự vận động theo kiểu trượt quanh trục sợi [13] 1.1.3.2 Đặc điểm cấu tạo Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu hạt liên kết với màng Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp bao bọc màng polysaccharide nhầy Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa người khơng phân cắt Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng 10% so với 3% thực vật sống cạn đậu nành Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân vùng giàu axit nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố nguyên sinh chất Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme, pectin loại polysacharid khác Màng tế bào nằm sát thành tế bào nối với màng quang hợp thylakoid vài điểm Spirulina khơng có lục lạp mà chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác nguyên sinh chất Màng thylakoid bao quanh hạt polyphosphat có đường kính 0,5- 1μ thường nằm trung tâm tế bào Sắc tố quang hợp phycocyanin, bên cạnh cịn SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp có chlorophyll a Ngồi ra, tế bào Spirulina khơng có khơng bào thực, có khơng bào chứa khí làm chức điều chỉnh tỉ trọng tế bào Khơng bào khí có vai trò quan trọng việc làm cho Spirulina lên mặt nước [10] Spirullina chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina khơng có ty thể mạng lưới nội chất, nhiên tế bào có ribosome với hệ số lắng 70S số thể vùi hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, cacboxysome hạt mesosome [10] Thành tế bào kính hiển vi điện tử lên gồm lớp: từ lớp L đến lớp L4 (L1, L2, L3, L4) L1 L3 chứa vật liệu dạng sợi L2 peptidoglycan giống tế bào vi khuẩn L xếp chạy theo chiều dọc trục sợi Spirulina [4] L1 L2 L3 L4 Hình 1.2 Lát cắt tế bào Spirulina platensis Hình 1.2 cho thấy vách ngăn hình thành, vách ngăn gồm ba lớp: L2 kẹp hai L1, hình dung hình 1.3 L4 L3 L2 L1 Màng sinh chất L1 L2 L1 Hình 1.3 Mơ hình xếp vách tế bào Spirulina platensis SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp Lớp L1 L3 có chức vận chuyển điện tử, hai lớp L L4 tập trung điện tử Độ dày lớp từ 10-15nm, nên độ dày toàn thành tế bào khoảng 40- 60nm Các lớp L 1, L3, L4 có độ dày nhau, lớp L1 lớn [2] 1.1.3.3 Đặc điểm sinh thái Spirulina chi tảo lam phân bố rộng đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn suối nước nóng Đây khoảng 2500 lồi cyanophyta cổ nhất, tự dưỡng đơn giản, có khả tổng hợp chất cần thiết cho thể, kể đại phân tử phức tạp để xây dựng tế bào có khả cố định đạm cao, chúng khơng thể sống hồn tồn tối… Trong trình sinh trưởng phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng yếu tố môi trường Những yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, pH thành phần dinh dưỡng không ảnh hưởng đến quang hợp sản xuất sinh khối tế bào mà ảnh hưởng tới hoạt động chuyển hóa tế bào a) Ảnh hưởng ánh sáng Ánh sáng nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến quang hợp sinh vật Do chất tiền nhân Spirulina nên ánh sáng khơng ảnh hưởng nhiều tới q trình phát triển Tuy nhiên, Spirulina giống nhiều loài tảo khác có khả quang tự dưỡng phụ thuộc vào ánh sáng nguồn lượng [28] Hầu hết, nghiên cứu phịng thí nghiệm đáp ứng Spirulina ánh sáng thực điều kiện phát triển quang tự dưỡng việc sử dụng mơi trường khống bicarbonate nguồn carbon Từ nghiên cứu cho thấy phát triển Spirulina trở nên bão hịa cường độ ánh sáng 1µmol m-2 s-1 khoảng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời bước sóng 400- 700nm, giá trị tùy thuộc vào điều kiện phát triển mối tương quang chlorophyll sinh khối [28] Ngồi ra, cường độ chiếu sáng cịn ảnh hưởng đến hàm lượng chất bên tế bào tảo Một số nghiên cứu nhận định cường độ chiếu sáng tăng hàm lượng acid béo (PUFA) giảm [26] SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp Theo Seshadri & Thomas (1979), tác động ánh sáng tới Spirulina hai yếu tố thời gian cường độ chiếu sáng Quá trình ni cấy ngồi trời cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina khoảng 20- 30klux Về thực hành ni cấy Spirulina cường độ ánh sáng tối ưu 25- 30klux, khoảng hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt khoảng cường độ chiếu sáng ni cấy [11] Ngồi ra, cường độ ánh sáng phụ thuộc vào mật độ ni cấy tảo, cường độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn sợi tảo nhận cường độ ánh sáng nhỏ Nhiều loại vi tảo có cường độ quang hợp bão hồ khoảng 33% tổng lượng cường độ ánh sáng Vì điều kiện ánh sáng có cường độ cao thời gian chiếu sáng dài, người ta thấy xuất hiện tượng quang ức chế làm tảo chết làm giảm đáng kể suất nuôi trồng [1] Theo Charenkova C.A (1977) thời gian chiếu sáng dài suất tảo Spirulina cao Năng suất tảo đạt cao chiếu sáng liên tục Như tảo Spirulina khơng có chu kỳ quang [1] b) Ảnh hưởng nhiệt độ Trong ánh sáng xem nhân tố môi trường quan trọng cho quang hợp vi sinh vật nhiệt độ nhân tố cho sống sinh vật Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất hoạt động sống vi sinh vật trình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng đặc tính sinh lý khác Nhiệt độ môi trường yếu tố nhạy cảm ảnh hưởng đến sinh vật Nhiệt độ môi trường nuôi yếu tố cần đáp ứng liên tục, dễ bị chi phối tác động điều kiện xung quanh, mức độ thời gian chiếu sáng Do nhiệt độ yếu tố thường xuyên theo dõi công nghệ nuôi trồng vi tảo [28] Spirulina phát triển nhiệt độ cao, chúng có khả phát triển mạnh khoảng nhiệt độ 32- 400C Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina 35- 380C Ở nhiệt độ 250C Spirulina phát triển chậm, nhiệt độ 38 0C tảo chết nhanh [21] Tuy vậy, tự nhiên người ta phát Spirulina suối nước nóng đến 690C SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, nhiệt độ cịn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa tảo Theo nghiên cứu cho thấy rằng: nhiệt độ 350C không ảnh hưởng xấu lên sản xuất sinh khối lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid phenolic Nhiều chủng khác phát triển khoảng nhiệt độ khác [28] Có mối liên hệ nhiệt độ ánh sáng q trình ni cấy tảo Giống hai mặt đối lập trình thống nhất, chúng đóng vai trị quan trọng định đến suất sinh khối Spirulina Sinh trưởng tảo đạt cao với cường độ thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo chế độ nhiệt tương đối ổn định c) Ảnh hưởng pH pH môi trường nhân tố quan trọng nuôi cấy Spirulina pH tối ưu cho phát triển chi kiềm kiềm cao Đây ưu lớn giúp Spirulina bị lây nhiễm tảo khác [14] Tuy nhiên, pH yếu tố nội luôn thay đổi, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng chất dinh dưỡng tạo nên mà tác động ngược lại trạng thái sinh trưởng quần thể tảo Khi tảo phát triển mạnh, pH môi trường bị thay đổi trở thành yếu tố kìm hãm cho sinh trưởng phát triển Do đó, pH mơi trường q cao hay q thấp làm chậm trình sinh trưởng tảo [20] Theo Trần Văn Tựa Nguyễn Hữu Thước (1993) pH môi trường từ 8,5- pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng phát triển Ở pH này, nguồn cacbon vơ tảo đồng hóa nhiều Tuy nhiên pH= 10- 11 Spirulina có khả phát triển chậm Một nghiên cứu Spirulina loài tảo sống môi trường kiềm giá trị pH > 10,3 có hại cho mơi trường ni cấy [6] Vì pH coi yếu tố thị, phản ánh thành phần nuôi dưỡng cung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu nguồn bicarbonat khí CO2 hồ tan [11] d) Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 10 Spirulina sống mơi trường tự nhiên đến môi trường nhân tạo nửa nhân tạo bổ sung chất khoáng cần thiết vào nguồn nước tự nhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan Thành phần dinh dưỡng bao gồm nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg, Na, Cl, Ca Fe) nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W) Tất điều ảnh hưởng đến sinh trưởng tảo Trong đó, nguyên tố vi lượng thành phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động nhiều hệ enzyme, có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll làm giảm phân hủy chlorophyll nhờ làm tăng độ bền vững phức hệ liên kết chlorophyll protein Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng làm tăng khả tổng hợp carotenoid [14] Các nguyên tố vi lượng thật cần thiết cho trình sinh trưởng tảo, nhiên hàm lượng chúng nước tự nhiên thấp, khơng cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng tảo việc bổ sung vi lượng vào môi trường nuôi cấy cần thiết Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thường bổ sung với lượng nhỏ hàm lượng vượt ngưỡng chịu đựng vi tảo, chúng có khả gây độc cho tế bào [20] 1.1.4 Đặc điểm sinh sản Spirulina có hai hình thức sinh sản sinh sản sinh dưỡng sinh sản vơ tính Hình thức sinh sản sinh dưỡng thực cách gãy khúc sợi tảo, khúc gãy gọi khúc tản Từ sợi tảo mẹ, hình thành nên đoạn Necridia (gồm tế bào chuyên biệt cho sinh sản) Trong Necridia hình thành đĩa lõm hai mặt tách rời tạo hormogonia chia cắt vị trí đĩa Trong phát triển, phần đầu gắn tiêu giảm, đầu hormogonia trở nên trịn vách tế bào có chiều dày không đổi Các hormogonia phát triển, trưởng thành chu kì sinh sản lập lập lại cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời tảo Kiểu sinh sản thường gặp sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina nhạt màu sắc tố xanh bình thường [5, 13] SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 52 Trong mơi trường Zarrouk hàm lượng phycocyanin cao đạt 56,75 mg/g, cịn mơi trường rỉ đường mẫu sau siêu âm ngày nồng độ phycocyanin 53,3 mg/g 47,83 mg/g Qua ta thấy mẫu tảo sau siêu âm để thu hoạch phục hồi sau ngày hàm lượng phycocyanin có mẫu khơng khác so với mẫu nuôi môi trường khác, ta thu hoạch tảo phương pháp siêu âm mà chất lượng thành phần chất có tảo đảm bảo Kết thu cho thấy chủng tảo nuôi cấy cho kết khác với nghiên cứu Hoàng Nghĩa Sơn công bố (2000) Theo nghiên cứu Phan Văn Dân (2009) hàm lượng phycocyanin mẫu ni ánh nắng có sục khí với tốc độ 0,1m/s đạt 50,26mg/g, mẫu ni điều kiện có mái che sục khí với vận tốc 0,1m/s đạt hàm lượng cao 121,25mg/g Nhìn chung mẫu nuôi môi trường khác cho hàm lượng phycocyanin tương đối so với nghiên cứu khác Sở dĩ có khác biệt chủng giống khác nhau, nuôi môi trường khác nhau, điều kiện nuôi cấy khác nhau, thời gian thu hoạch mẫu, thời gian phân tích khác nhau, phương pháp phân tích khác nên hàm lượng phycocyanin thu mẫu khác 3.7.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford Protein thành phần quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng tảo Để đánh giá chất lượng tảo nuôi điều kiện khác có giá trị dinh dưỡng ta tiến hành định lượng protein có mẫu theo phương pháp Bradford Hàm lượng protein Spirulina dao động từ 50-70% trọng lượng khô Hàm lượng protein thấp từ 5-10% tùy vào thời gian thu hoạch môi trường sống Giá trị cao thường đạt thu hoạch vào buổi sáng sớm ngày nắng Spirulina có hàm lượng protein cao loại thực phẩm khác, nhiều thịt động vật cá tươi (15 – 25% trọng lượng tươi), đậu nành (35% trọng lượng khô), sữa bột (35% trọng lượng khô), trứng (12% trọng lượng tươi), đậu phộng (25% trọng lượng khô), lúa gạo (8 – 14% trọng lượng khô), sữa (3% trọng lượng tươi) SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 53 Sau thực nghiệm ta kết đo OD để xây dựng đường chuẩn bảng 8.1 phụ lục Nên ta có đồ thị đường chuẩn hình 3.18 Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định hàm lượng protein có mẫu Dựa vào đồ thị đường chuẩn hình 3.18 ta có phương trình đường chuẩn y = 0.0053x có hệ số tương đối R2 = 0.9965, với giá trị R2 chấp nhận để tính tốn kết hàm lượng protein tạo thành Từ đường chuẩn dựng tiến hành đo mẫu tảo OD 595nm xác định hàm lượng protein chủng tảo nuôi cấy Thay giá trị ∆OD 595nm chủng tảo (bảng 8.1 phụ lục 8) vào đồ thị đường chuẩn ta có bảng 3.10 Bảng 3.10 Hàm lượng protein chủng tảo nuôi cấy Mẫu nuôi cấy Nồng độ protein( mg/ml) SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hàm lượng protein (% trọng lượng tươi) GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 54 AZ 0,609 60,9 AR 0,593 59,3 AS3 0,537 53,7 Với số liệu bảng 3.10 ta thấy rằng: Hàm lượng protein chủng Spirulina platensis nuôi cấy dao động khoảng 53,7 – 60,9% Trong đó, chủng AZ có hàm lượng protein cao đạt 60,9% chủng AR đạt 59,3% chủng AS3 đạt 53,7% Nhìn chung có chênh lệch hàm lượng protein có mẫu khác Qua ta thấy chất lượng tảo nuôi môi trường Zarrouk cho lượng protein cao nuôi môi trường rỉ đường hàm lượng protein có mẫu sau phục hồi sau ngày (sau tiến hành siêu âm) đạt cao Theo PGS-TS Đặng Đình Kim nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein chủng tảo Spirulina platensis cao từ 66– 67 % [10] Ở thí nghiệm Goksan nghiên cứu phát triển Spirulina platensis hệ thống nuôi cấy khác điều kiện nhà kính, hàm lượng protein hệ thống bình suốt (transparent jars) 33% (so với trọng lượng khô), túi polyethylene (54,5%), hệ thống ao hồ tạo dòng chảy (raceway ponds) (58,3%) [13] Theo Harriet, nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên hàm lượng protein môi trường nước mặn hóa (salinated water) hàm lượng protein đạt 48,59% (so với trọng lượng khô) hàm lượng protein môi trường nước thải loại muối (desalonator wastewater) đạt 56,17% [11] Như tóm lại, mẫu khác có hàm lượng protein khác nguyên nhân sau: Các giống tảo khác cho hàm lượng protein khác nhau, mẫu nuôi điều kiện mơi trường khác có hàm lượng protein khác Ngồi hàm lượng protein cịn phụ thuộc vào thời gian thu hoạch, mẫu đến thời gian thu hoạch mẫu khác chưa tới giai đoạn thu hoạch 3.8 Kết chủng giống tảo 3.8.1 Phương pháp chiếu tia UV SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 55 Tia cực tím có khả diệt khuẩn, điều có nghĩa Spirulina platensis đối tượng chịu ảnh hưởng, khả dễ xảy Spirulina platensis phơi trực tiếp tia cực tím Thực nghiệm cho thấy chiếu tia UV 30 phút Spirulina platensis bị phá hủy thành đoạn ngắn, chiếu 60 phút tế bào bị phả hủy chất tế bào giải phóng mơi trường Hiệu chủng mẫu cách chiếu trực tiếp tia UV vào dịch nuôi cấy không khả thi mà bên cạnh cịn có tác động xấu đến Spirulina platensis Hình 3.19 Mẫu tảo bị nhiễm sau cấy lên môi trường thạch từ dịch chiếu tia UV Ở hình 3.19 ta thấy mẫu tảo sau chiếu tia UV cấy môi trường thạch bị nhiễm Các ngun nhân độ vô trùng tủ cấy không đảm bảo, khoảng cách đèn UV mẫu cần chủng xa nên cường độ không đủ để tiêu diệt vi sinh vật Do Spirulina platensis có kích thước lớn nhiều lần vi khuẩn lượng tia UV mà chúng nhận nhiều Ngoài ra, mật độ tế bào mẫu cao nên tế bào nhận tia UV nên khơng có khả diệt khuẩn Spirulina platensis có cấu trúc xoắn lị xo nên ln tồn vị trí bị che khuất theo chiều dài sợi chỗ mà UV khơng thể tiếp cận để phát huy tính sát khuẩn nơi mà vi khuẩn ẩn nấp để tránh tác động tia UV SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 56 3.8.2 Phương pháp cấy chuyền môi trường thạch Zarrouk vô trùng Trên môi trường thạch Zarrouk, Spirulina platensis với khả phát triển nhanh vi khuẩn tạp nhiễm nuôi cấy nhờ nên ta tận dụng đặc điểm để làm chủng giống Khi sợi tảo mọc tiến hành rửa 5- lần cấy chuyền lên môi trường Zarrouk vô trùng khác Như thế, vi khuẩn nhiễm chưa kịp phát triển nhiều bị rửa trơi phần lớn lần rửa, chưa kịp tăng số lượng trở lại thao tác cấy lên mơi trường thạch Zarrouk vơ trùng với thành phần hồn tồn khống, hạn chế phát triển vi sinh vật dị dưỡng Khuẩn nhiễm vi sinh vật dị dưỡng, cần nguồn carbon hữu để phát triển, chúng sống môi trường nuôi Spirulina platensis chất dinh dưỡng tế bào khuẩn lam bị phân hủy Môi trường Zarrouk vô trùng không chứa nguồn carbon hữu Trong đó, Spirulina platensis với khả tự dưỡng phát triển sinh khối tạo sợi thời gian ngắn từ 6- đồng hồ, sợi lại chuyển sang môi trường Zarrouk mới, vô trùng Những sợi Spirulina platensis phát triển sợi khỏe mạnh, tiếp tục tăng sinh khối khoảng thời gian 12- 14 đồng hồ sau cấy môi trường Zarrouk Do nguồn dinh dưỡng bị hạn chế tới mức cạn kiệt nên vi khuẩn nhiễm tạp bị hạn chế tới mức tối thiểu thời gian Tế bào khuẩn nhiễm cịn lại bị loại bỏ dần qua bước rửa cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng Như vậy, phương pháp đơn giản bao gồm bước “Môi trường thạch- Môi trường dịch thể, rửa- Mơi trường thạch” thu giống Spirulina platensis b a sau lần lặp lại tương tự c d SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Hình 3.20 Mẫu tảo phát triển sau lần cấy chuyền a Lần b Lần c Lần d Lần Đồ án tốt nghiệp 57 3.9 Khảo sát phương pháp bảo quản giống 3.9.1 Bảo quản giống môi trường lỏng điều kiện bình thường phịng thí nghiệm Giống phân bố chai nhựa giữ điều kiện phịng thí nghiệm Sau thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả sống sót tảo sau bảo quản Sau bảo quản gần tháng (từ 18/03/201210/06/2012) điều kiện phịng thí nghiệm ta tiến hành đem giống nhân môi trường vô trùng kết tảo phát triển tốt Do thời gian tiến hành đề tài có tháng nên kiểm chứng kết bảo quản sau tháng Nhưng sau tháng ta thấy tảo xanh, nên điều kiện bình thường giữ giống thời gian lâu SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Hình 3.21 Mẫu tảo sau tháng bảo quản điều kiện bình thường phịng thí nghiệm Đồ án tốt nghiệp 58 2.3.9.2 Bảo quản giống môi trường lỏng tủ lạnh 40C Giống phân bố bình serum loại 500ml, bình tam giác loại 250ml giữ tủ lạnh 40C Sau thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả sống sót tảo sau bảo quản Hình 3.22 Mẫu tảo sau bảo quản hai tháng 40C (Từ 10/04/2012 – 09/06/2012) Sau bảo quản hai tháng 0C ta thấy mẫu tảo xanh tiến hành nhân giống giống phát triển tốt Với điều kiện giữ giống tảo thời gian lâu 2.3.9.3 Bảo quản giống cấy chuyền môi trường thạch Chuẩn bị môi trường thạch Zarrouk đổ đĩa petri Mẫu tảo sau thời gian nuôi cấy thu sinh khối pha log ly tâm lọc thu sinh khối Cấy sinh khối tảo SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 59 vào đĩa petri (cấy trải) Các thao tác tiến hành tủ cấy vô trùng Sau cấy xong đem ni điều kiện bình thường Hình 3.23 Mẫu tảo cấy chuyền môi trường thạch sau thời gian bảo quản tháng ( 11/04/2012- 11/06/2012) Sau hai tháng cấy chuyền mơi trường thạch (hình 3.23) ta thấy tảo phát triển tốt môi trường thạch quan sát ta thấy mơi trường bị khơ nên dùng phương pháp bảo quản trì hai tháng sau phải cấy chuyền 2.3.9.4 Bảo quản giống glycerol điều kiện lạnh sâu Giống tảo Spirulina platensis sau thu hoạch, tiến hành phân bố vào ống eppendoff vô trùng Tiến hành bổ sung Glycerol vô trùng vào nồng độ 10%, 20%, 30% vào ống eppendoff Đem bảo quản nhiệt độ -210C tủ lạnh sâu Sau thời gian bảo quản tháng (từ 28/04/2012 đến 10/06/2012) ta tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả sống sót mẫu tảo sau bảo quản Sau tháng bảo quản, đánh giá cảm quan ta thấy mẫu tảo bổ sung glycerol bảo quản tủ lạnh sâu -210C xanh SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Hình 3.24 Mẫu tảo bổ sung Glycerol vô trùng nồng độ 10- 30% sau tháng bảo quản tủ đông sâu -210C Đồ án tốt nghiệp 60 2.3.9.5 Bảo quản giống phương pháp sấy đông khô Cho giống sau thu hoạch vào bình penicillin, bổ sung Glycerol trùng theo tỉ lệ 10%, 20%, 30% vào bình penicillin, sau tiến hành sấy đông khô từ từ nhiệt độ 40 0C 6- 12 Sau mẫu khơ hồn tồn tiến hành bảo quản tủ lạnh đơng -210C Sau thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa giống để theo dõi sức sống chủng tảo bảo quản Hình 3.25 Mẫu tảo sấy đơng khơ sau tháng bảo quản - 210C Sau hai tháng bảo quản, theo đánh giá cảm quan tảo giữ màu xanh hoạt hóa mẫu tảo bị chết, khơng thấy có phát triển giống bảo quản phương pháp khác A B C D E Hình 3.26 Mẫu tảo hoạt hóa để kiểm tra tỉ lệ, sức sống sau bảo quản thời gian (tỉ lệ giống 30%) A Giống bảo quản môi trường lỏng điều kiện bình thường phịng thí nghiệm sau gần tháng B Giống bảo quản môi trường lỏng tủ lạnh 40C sau tháng C Giống bảo quản cấy chuyền môi trường thạch sau tháng D Giống bảo quản glycerol điều kiện lạnh sâu sau tháng SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long E Giống bảo quản phương pháp sấy đông khô (bổ sung 20% glycerol) sau tháng Đồ án tốt nghiệp 61 A Từ hình 3.26 theo đánh giá cảm quan ta thấy mẫu bảo quản theo cách khác sau khoảng thời gian bảo quản khác đem nhân giống lại cho kết tốt Các mẫu tảo xanh, phát triển tương đối tốt Từ cho thấy kết bảo quản môi trường lỏng cho hiệu cao nhất, môi trường thạch tốt dễ nhiễm thời gian bảo quản ngắn hơn, phương pháp sấy đơng khơ không khả thi SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian tiến hành thí nghiệm chúng tơi rút số kết luận sau: Để giảm lượng hóa chất, đặc biệt giảm chi phí đầu tư để ni tảo mơi trường rỉ đường + NaHCO đáp ứng u cầu Mơi trường ni cấy tốt qua tiến hành thực nghiệm 0,75ml rỉ đường+ 16,8g NaHCO Nhân tố ánh sáng ảnh hưởng nhiều đến khả quang hợp, sinh trưởng, phát triển tảo ánh sáng đèn huỳnh quang đáp ứng yêu cầu Thử nghiệm với ánh sáng đèn Led hiệu không khả thi: - Cùng môi trường rỉ đường nuôi ánh sáng huỳnh quang OD đạt 0,291 ni đèn Led xanh đạt 0,156 - Cùng môi trường Zarrouk nuôi ánh sáng huỳnh quang OD đạt 0,524 ni đèn Led xanh đạt 0,191 Các phương pháp thu hoạch - Lọc thủ công: hiệu thấp, tốn thời gian - Lọc có bơm chân khơng: nhanh dễ thực hiệu cao - Phương pháp siêu âm: hiệu cao, tỉ lệ tế bào lắng 100% thời gian 900 giây Các phương pháp bảo quản Qua tiến hành thực nghiệm ta thấy giống bảo quản môi trường lỏng cho hiệu cao nhất, kéo dài tháng mà chất lượng tảo không thay đổi đáng kể Bảo quản cách bổ sung Glycerol bảo quản tủ lạnh đông sâu -210C cho hiệu tương đối tốt, mẫu tảo bổ sung glycerol nồng độ khác đem sấy đơng khơ hiệu bảo quản khơng khả thi, q trình sấy tế bào tảo bị phá hủy điều kiện sấy nên kết sau bảo quản không tốt Kiến nghị Do thời gian thực đề tài ngắn nên số vấn đề chưa thể tiến hành nên chúng tơi có số kiến nghị: SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 63 - Sau thu hoạch sinh khối mẫu nước cịn lại có mùi nên cần tìm phương pháp xử lý mùi - Tìm phương pháp giữ giống lâu mà chất lượng tảo sau bảo quản sinh trưởng, phát triển tốt - Tảo Spirulina platensis có khả xử lý nước thải, hấp thụ kim loại nặng nên tạo chủng tảo đột biến có khả xử lý nước thải tốt - Nuôi thu nhiều sinh khối chiết thu hợp chất có giá trị y dược để điều trị số bệnh nguy hiểm ung thư, HIV… SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Bùi Thị Ngọc Bích (2006), Khảo nghiệm số phương pháp tăng sinh khối giống tảo Spirulina platensis, Luận văn kỹ sư Đại Học Nông Lâm HCM [2] Phan Văn Dân (2009), Nghiên cứu thu sinh khối Spirulina platensis quy trình ni hệ kín, Luận văn thạc sĩ sinh học Đại học Khoa Học Tự Nhiên HCM [3] Nguyễn Thị Đệ (1994), Một số tính chất phycobiliprotein tảo lam Việt Nam, Tạp chí sinh học 3: 77-79 [4] Nguyễn Thị Hoa (2009), Nghiên cứu chế biến bánh mì có bổ sung tảo lam Spirulina, Luận văn tốt nghiệp Đại học Bình Dương [5] Thân Trọng Huy (2006), Nguyên lý máy rửa siêu âm, Luận văn thạc sĩ, khoa vật lý, trường đại học Khoa học- Đại học Huế [6] Đặng Đình Kim (1993), Một số chất có hoạt tính sinh học tảo Spirulina ứng dụng chúng, Tạp chí sinh học 15 (4): 20-21 [7] Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền, Nguyễn Tiến Cư (1994), “Một số vấn đề công nghệ sản xuất tảo Spirulina Việt Nam”, Tạp chí sinh học 16 (3), tr 7- 11 [8] Đặng Đình Kim, Nguyễn Tiến Cư, Nguyễn Thị Ninh, Đặng Diễm Hồng, Trần Văn Tựa, Phan Phương Lan, Nguyễn Văn Hòa (1994), “Thực nghiệm ni trồng Spirulina nước khống Đắc Min”, Tạp chí sinh học 16 (3), trang 9598 [9] Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền (1994), Tách chiết Phycobiliprotein từ tảo lam Spirulina platensis bước đầu tìm hiểu khả ứng dụng chế phẩm y học, Tạp chí sinh học 16 (3), tr 93 – 94 [10] Đặng Đình Kim (1999), Cơng nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp Hà Nội [11] Lê Văn Lăng (1999), Spirulina- Nuôi trồng sử dụng y dược dinh dưỡng, NXB Y học SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 65 [12] Vũ Thành Lâm (2006), Nuôi trồng Tảo Spirulina, Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội [13] Hoàng Thị Thanh Loan (2010), Nghiên cứu phân lập, bảo quản nhân giống tảo Spirulina platensis, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [14] Nguyễn Bá Lộc (1997), Quang hợp, NXB Giáo dục Hà Nội [15] Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, Vi sinh vật học công nghiệp, Tập 2, NXB ĐHQGTPHCM, tr 119- 133 [16] TS Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật tập 1, Nhà xuất nông nghiệp [17] Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Văn Hòa (1994), “Kết bước đầu nghiên cứu tảo lam cố định nitơ”, Tạp chí sinh học 16 (3), tr 50 – 54 [18] GS Nguyễn Hữu Thước (1988), Tảo Spirulina- nguồn dinh dưỡng dược liệu quý, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [19] AOAC official method (1998), 942.04 [20] Grobbellar J.U (2004), Algal Nutrion In: Handbook of Microalgal culture (Richmon A.): 97-115] [21] Jean Paul Jourdan (2001), Grow your own Spirulina, page: [22] Kawata, Y (2006), Studies on recombinant DNA techniques for cyanobacterium Spirulina platensis, Doctoral Thesis, Kyoto University, 46 pages (short contents in English [23] Ma B, Chen Y, Hao H, Zang G (2005), Influence of ultrasonic field on Microcystins produced by bloom- forming algae, Department of Mechanical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, PR China] [24] Morist, A., Montesinos, J., L., Cusido, J., Godia, A., F (2001), “Recovery and treatment of Spirulina platensis cells cultured in a continuous photobioreactor to be used as food”, Journal of Process Biochemistry, 37, p 535547 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 66 [25] Niramol Catawatcharakul B.Sc.(1994), Development of a Tubular Photobioreactor for Mass Cultivation of Spirulina platensis, Biotechnology Program, Thailand [26] Qiang Hu (2004), Environmetal effects on cell composition In: Handbook of Microalgal culture (Richmon A.): 83-95] [27] Venkataraman, L., V (1998), Spirulina: Global Reach of a Health Care Product , 4th International Food Conference [28] Vonshak A (1997), Spirulina: growth physiology and biochemistry in: Spirulina plantesis: Physiology, cell-biology and bioteachnology (Vonshak A.): 43-67 [29] Rangsayatorn, N., Upatham, S., E., Kruatrachue, M., Pokethitiyook, P., Lanza, G., P (2002), “Phytoremediation potential of Spirulina (Arthrospira) platenssis: biosorption and toxicity studies of cadmium”, Journal of Environmental Pollution, 119, p 45 – 53 Tài liệu Internet [30].http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%B4ng_ngh%E1%BB%87_sinh_h %E1%BB%8Dc [31] http://muare.vn/an-uong/4205937 [32] http://Spirulina-program org [33] http://vietsciences.org/timhieu/khoahoc/biologie/spirulina.htm [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%A3o_xo%E1%BA%AFn [35].http://www.ntu.edu.vn/canbo/longdb/default.aspx? file=privateres/canbo/longdb/file/thuy%20thien%20truc/tao%20spirulina%20va%20van %20de%20phong%20benh.htm.aspx [36] http://tietkiemnangluong.com.vn/home/tu-van/tai-sao-den-led-duoc-xemla-loai-den-tiet-kiem-nang-luong-29-12197.html [37] http://www.webluanvan.com/f31/thanh-phan-hoa-hoc-trong-ri-duong-34235/ [38] http://svdanang.com/@pbkok/showthread.php?t=17285 SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long ... nuôi cấy thu sinh khối pha log ly tâm lọc thu sinh khối Cấy sinh khối tảo vào đĩa petri (cấy trải) Các thao tác tiến hành tủ cấy vô trùng Sau cấy xong đem nuôi điều kiện bình thường 2.3.9.4 Bảo quản. .. nghiệm ta thu kết bảng 3.2 Bảng 3.2: Khối lượng sinh khối tươi mẫu nuôi cấy thu hoạch phương pháp lọc có sử dụng bơm chân khơng Khối lượng sinh khối tươi mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH... theo tảo lắng xuống Bảng 3.4: Khối lượng sinh khối tươi mẫu nuôi cấy thu hoạch phương pháp tự kết tủa Đợt thí nghiệm Đợt Đợt Đợt Khối lượng sinh khối tươi mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi