Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang virus gây bệnh đốm trắng ở tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh miền bắc việt nam tt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRƯƠNG THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH Đ NG VẬT THỦY SINH CHỦ YẾU MANG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM NUÔI NƯ C LỢ TẠI M T SỐ TỈNH MIỀN BẮC CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC THÚ Y Mà SỐ: 64 01 08 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà N i, 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Phan Thị Vân Người hướng dẫn khoa học 2: PSG.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ Phản biện 1: TS Bùi Quang Tề Phản biện 2: TS Phan Quang Minh Phản biện 3: TS Thái Thanh Bình Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi … … ngày… tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: -Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PH N M Đ U 1.1 TÍNH C P THI T C AăĐ TÀI Trong năm gần nuôi tôm nước lợ tr thành ngàng kinh tế quan trọng, có giá trị kim ngạch xu t cao Chỉ tính riêng 2016, s n lượng đạt kho ng 657 nghìn t n (trong s n lượng ni tơm chân trắng chiếm kho ng 60%) mang lại kim ngạch xu t kho ng 3,1 tỷ USD Tuy nhiên, nghề ni tơm cịn gặp nhiều thách thức, đặc biệt dịch bệnh virus đ m trắng (WSSV) gây WSSV lưu hành x y Việt Nam từ năm 1993, đến bệnh hộ nuôi, vùng ni hầu hết tỉnh thành có thực hành nuôi tôm Việt Nam WSSV lan truyền cho tôm theo c chiều ngang chiều dọc Việt Nam kiểm sốt t t WSSV lan truyền theo chiều dọc thơng qua thực hiên t t công tác kiểm dịch tôm b mẹ trước sinh s n Tuy nhiên, kiểm sốt WSSV lan theo chiều ngang cịn nhiều hạn chế WSSV lan theo chiều ngang thông qua môi trư ng nuôi, sinh vật mang virus Trên giới, nghiên cứu sinh vật mang WSSV quan tâm đến xác định 150 loài sinh vật mang WSSV, Việt Nam cơng b lồi bao gồm tơm he (Penaeus indicus), tơm r o (Etapenaeus ensis), tôm bạc (Metapenaeus lysianassa), tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) giun nhiều tơ (Perinereis sp) (Hao et al., 1999, Võ Văn Tu n cs., 2010; Phan Thị Vân cs., 2017) loài c mượn hồn, mực tơm tít, cơng b nội hình thức báo cáo (Cao Chí Thuận, 2009) Nghiên cứu bổ sung thêm loài sinh vật mang WSSV r t quan trọng đặc biệt cần thiết Việt Nam Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang virus gây bệnh đ m trắng tôm nuôi nước lợ s tỉnh miền Bắc” Kết qu nghiên cứu giúp ngư i ni có thơng tin nhận dạng loài sinh vật mang lan truyền WSSV cho tôm nuôi, s khoa học đưa biện pháp kiểm soát lan truyền bệnh theo phương thức lan truyền ngang, từ nâng cao su t s n lượng tôm 1.2.ăM CăTIểUăNGHIểNăC UăC AăĐ ăTÀI 1.2.1 M c tiêu chung Xác định s lồi động vật thủy sinh chủ yếu có kh mang lan truyền virus đ m trắng gây bệnh cho tôm nuôi nước lợ s tỉnh miền Bắc 1.2.2 M c tiêu c th : Xác định yếu t nguy gây bệnh đ m trắng virus cho tôm nuôi nước lợ vùng nghiên cứu Xác định loài động vật thủy sinh chủ yếu mang virus đ m trắng có kh lan truyền bệnh cho tôm theo phương thức lây truyền ngang 1.3.ăPH MăVIăNGHIểNăC U Động vật thủy sinh chủ yếu ao nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh, ao lắng quanh khu vực nguồn c p nước H i Hòa - Qu ng Ninh, Giao Thủy - Nam Định Quỳnh Liên - Nghệ An Th i gian thực từ tháng 6/2015 đến tháng 10/2017 1.4 NH NGăĐịNGăGịPăM I C AăĐ TÀI Luận án góp phần cung c p thông tin vùng nuôi tôm nước lợ Nghệ An, Qu ng Ninh Nam Định, đặc biệt yếu t nguy có liên quan đến ngun nhân tơm nhiễm bệnh đ m trắng vùng nuôi Kết qu nghiên cứu luận án th ng kê, xác định 23 loài động vật thủy sinh có 16 lồi xu t nhiều với s lượng lớn xác định loài động vật thủy sinh chủ yếu, chúng bao gồm tôm r o, tôm càng, tôm gai, cáy đ , nòng nọc ếch, c đinh, cá b ng loài động vật phù du (Branchionus angularis, B budapestinensis, B calyciflorus, B plicatilis, B ucreus, Polyarthra, Microsetella norvegica, Neocalanus gracilis Oithona nana) Kết qu nghiên cứu luận án ghi nhận loài động vật thủy sinh mang virus có kh truyền bệnh đ m trắng cho tơm ni Trong lồi tơm (Macrobranchium nipponense) mang virus đ m trắng thu tự nhiên hai lồi cịn lại cáy đ (Uca arcuata) tôm gai (Exopalaemon carinicauda) mang virus đ m trắng điều kiện thí nghiệm Luận án bổ sung vào thành phần sinh vật mang mầm bệnh đ m trắng Việt Nam c giới, lồi lần công b Việt Nam bổ sung thêm loài (Uca arcuata) vào danh sách sinh vật mang WSSV cho giới Kết qu s khoa học góp phần đề xu t gi i pháp hạn chế rủi ro bệnh dịch, nâng cao hiệu qu cho nghề ni tơm nước lợ nghiên cứu nói riêng vùng Việt Nam nói chung 1.5.ăụăNGHĨAăKHOAăH CăVÀăTHỰCăTI NăC AăĐ ăTÀI Luận án phân tích, đánh giá thực trạng vùng ni, từ rõ s yếu t nguy cơ, nguyên nhân gây tượng tôm nhiễm bệnh đ m trắng Xác định s lồi động vật thủy sinh chủ yếu có kh mang lan truyền WSSV gây bệnh cho tôm nuôi Nghệ An, Qu ng Ninh Nam Định, xác định nguồn mang mầm bệnh WSSV tiềm ẩn, m i nguy sinh học vùng nuôi Kết qu đạt luận án giúp cho hộ nuôi thuộc vùng nghiên cứu biết rõ yếu t nguy gây bệnh đ m trắng (white spot disease-WSD) tôm nuôi, từ nghiêm túc thực kỹ thuật q trình triển khai vụ ni nhằm gi m thiểu yếu t nguy Đồng th i kết qu giúp ngư i nuôi nhận diện s động vật có kh mang lan truyền WSSV cho tơm ni, từ có biện pháp ngăn chặn xu t chúng khu vực nuôi tôm, đặc biệt ao nuôi Kết qu nghiên cứu luận án tiền đề cho nghiên cứu nhằm đưa đề xu t gi i pháp sinh học mang tính ch t thân thiện với mơi trư ng có hiệu qu ngăn ngừa/loại b có mặt sinh vật mang mầm bệnh WSSV q trình ni tơm nước lợ, loại b mắt xích lan truyền WSD Từ góp phần kh ng chế hiệu qu WSD cho nghề nuôi tôm công nghiệp, nâng cao đ i s ng cho ngư i nuôi, nâng cao kim ngạch xu t thủy s n nói chung s n phẩm tơm ni nói riêng PH N T NG QUAN TÀI LI U 2.1 NGH NUỌIăTỌMăN CL VI T NAM 2.1.1 M t s đặcăđi m chung c a ngh nuôi tôm c n Hiện loại hình ni tơm nước lợ c Việt Nam r t đa dạng từ nuôi qu ng canh, sinh thái, xen vụ, nuôi ghép đến thâm canh, siêu thâm canh Trong mơ hình thâm canh, siêu thâm canh sử dụng tôm thẻ chân trắng ni chính, mơ hình cịn lại với chủ yếu tôm sú S n lượng tôm xu t hàng năm tôm thẻ chân trắng chiếm chủ yếu (60% tổng s n lượng) Kim ngạch xu t tôm hàng năm cao nh t so với mặt hàng thủy s n khác Tuy nhiên dịch bệnh xu t tôm rào c n lớn nh hư ng s n lượng tôm, đặc biệt bệnh WSSV 2.1.2 Hi n tr ng nuôi tôm t i Qu ngăNinh,ăNamăĐ nh Ngh An Qu ng Ninh, Nam Định Nghệ An s tỉnh có s n lượng tơm lớn nh t miền Bắc, tập trung chủ yếu H i Hịa (Qu ng Ninh), Giao Thủy (Nam Định) Quỳnh Lưu (Nghệ An) (Th o Linh., 2014) 2.2 B NHăĐ M TR NG TỌMăNUỌIăN WSD bệnh virus truyền nhiễm CL tôm nuôi nước lợ, tác nhân gây bệnh WSSV Nguồn g c bệnh bắt nguồn từ Đông Nam Á, sau lan rộng nhiều nước giới Bệnh WSSV lưu hành Việt Nam từ 1993, đến bệnh diễn vùng nuôi tôm 2.2.1 Tác nhân gây b nh Hiện nay, WSSV xếp vào họ có tên Nirmaviridae, gi ng Whispovirus (Yi et al., 2004) 2.2.1.1 Cấu trúc WSSV WSSV tạo thành b i nh t 58 protein, có v bao bọc, nhìn ngồi gi ng hình trụ/elip Thể virus hồn chỉnh có kích thước 275335nm x 116-138nm 2.2.1.2 Hệ gen WSSV Gen WSSV sợi đơi ADN, dạng vịng có kích thước kho ng 300kb 2.2.2 D u hi u b nh lý Tôm b ăn, xu t đ m trắng tròn lớp v kitin, đặc biệt tập trung giáp đầu ngực đ t bụng cu i cùng, tôm gần chết, chúng chuyển sang màu hồng đ 2.2.3 Ph ngăth c lan truy n b nhăđ m tr ng WSSV có kh truyền lây phức tạp theo c hai chiều ngang dọc 2.2.4 Y u t nguyăc ăd năđ n tôm nhi m b nh WSSV Tôm nuôi nhiễm WSSV không ph i b i yếu t b t kỳ mà đồng th i s yếu t tương tác Yếu t nguy dẫn đến tôm nhiễm bệnh WSSV phụ thuộc vào vùng nuôi cụ thể 2.3 SINH V T MANG VIRUS Đ M TR NG GÂY B NH TÔM NUÔI 2.3.1 Nghiên c u sinh v t mang WSSV gây b nh cho tôm th gi i Năm 1997 s loài sinh vật mang WSSV công b 31 (Sangamaheswaran and Jeyaseelan, 2001), tăng lên 46 lồi năm 2006 (Flegel, 2006), sau 94 lồi năm 2008 (Escobedo-Bonilla et al., 2008; Sánchez-Paz, 2010), tiếp đến 119 loài năm 2014 đến 153 loài 2.3.1.1 Giáp xác mang virus gây bệnh đốm trắng cho tôm Xác định 123 lồi giáp xác có kh mang virus đ m trắng (Trương Thị Mỹ Hạnh cs., 2016) 2.3.1.2 Các loài sinh v t phù du mang virus gây b nhăđ m tr ng cho tôm Một s lồi sinh vật phù du có kh mang virus gây bệnh đ m trắng cho tôm muôi: a Thực vật phù du mang virus gây bệnh đốm trắng cho tơm: Có 10 lồi thực vật phù du mang WSSV công b , t t c mang WSSV hình thức gây nhiễm (Jiang, 2012; Liu et al., 2007) b Động vật phù du: Có 09 loài động vật phù du mang WSSV công b thuộc qu c gia bao gồm Mexico, Thái Lan, n Độ, Đài Loan Trung Qu c (Lo et al., 1995, 1999; Li et al., 2003; Sahul Hameed et al., 2003; Ramirez-Douriet et al., 2005) 2.3.1.3 Các loài sinh vật khác mang virus gây bệnh đốm trắng a Nhuyễn thể: xác định hàu (Crassostrea gigas) nhiễm WSSV mang tuyến tiêu hóa (Vazquez-Boucard et al., 2012) b Giun nhiều tơ: Xác định có lồi giun có tên Marphysa gravelyi Dendronereis spp mang WSSV (Haryadi et al., 2015) c Cơn trùng: Có năm lồi trùng có kết qu dương tính với WSSV, t t c nhiễm WSSV điều kiện tự nhiên (Lo et al., 1996; Mohan, 2008) d Chim gà: chim mòng biển gà ni lồi động vật có kh mang WSSV (Vanpatten et al., 2004) 2.3.2 Nghiên c u sinh v t mang WSSV gây b nh cho tôm VN Đến nay, Việt Nam xác định lồi động vật có kh mang lan truyền virus đ m trắng gây bệnh cho tơm, lồi Penaeus indicus, Etapenaeus ensis, Metapenaeus lysianassa, M rosenbergii Perinereis sp công b tạp chí (Hao et al., 1999, Võ Văn Tu n cs., 2010, Phan Thị Vân cs., 2017) lồi ( c mượn hồn, mực tơm tít) cơng b nội thơng qua báo cáo (Cao Chí Thuận, 2009) PH N PH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.1ăĐ AăĐI M NGHIÊN C U S hộ điều tra vùng nghiên cứu 50 hộ Quỳnh Liên-Nghệ An, 45 hộ Giao Thủy-Nam Định 49 hộ H i HịaQu ng Ninh Phân tích 1432 mẫu động vật thủy sinh Trung tâm Quan trắc Môi trư ng Bệnh thủy s n miền Bắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy s n I 3.2.ăTH IăGIANăNGHIểNăC U Nghiên cứu thực từ tháng 6/2015 đến tháng 10/2017 3.3.ăĐ IăT 3.3.1.ăĐ iăt NG VÀ V T LI U NGHIÊN C U ng nghiên c u Động vật thủy sinh xu t ao nuôi tôm thâm canh quanh khu vực nguồn c p nước hộ nuôi tôm vùng nghiên cứu 3.3.2 V t li u nghiên c u Nguyên liệu: Mẫu WSSV thu Qu ng Ninh h i Phòng sử dụng gây nhiễm xác định động vật thủy sinh nhiễm WSSV Tôm thẻ có kích thước 4-5g/con sử dụng thí nghiệm lan truyền bệnh WSSV Động vật thủy sinh chủ yếu (tơm càng, tơm gai, c đinh, nịng nọc ếch, cá b ng cáy đ ) Hệ th ng bể thí nghiệm 20 loại (300 lít 20 lít) Bộ câu h i điều tra nơng hộ Hóa ch t: Kít QIAquick PCR PurificationKit để tinh ADN Kít tách chiết ADN (QiaGen) Kít tách chiết ARN (IQ2000) Kít RevertAid First Strand cDNA (tổng hợp cDNA) Cặp mồi WSSV366 COI 3.3 N I DUNG NGHIÊN C U - Điều tra trạng vùng nuôi, đánh giá m i nguy liên quan đến tôm nuôi bị bệnh đ m trắng Qu ng Ninh, Nghệ An Nam Định thông qua câu h i - Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang WSSV vùng nuôi tôm nước lợ Nghệ An, Nam Định Qu ng Ninh - Nghiên cứu xác định kh lan truyền WSSV từ động vật thủy sinh sang tôm thẻ chân trắng môi trư ng nuôi 3.4.ăPH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.4.1 Ph ngăphápăđi u tra l y thông tin: Dùng câu h i điều tra chuẩn bị sẵn 3.4.2 Ph ơngăphápăthuăm u, b o qu năvàăđnhădanhăloàiăđ ng v t th y sinh Sử dụng vật dụng chuyên dụng thu loại mẫu, mẫu c định cồn với tỷ lệ mẫu: cồn = 1:10, s lưu giữ âm sâu phục vụ định danh lồi 3.4.3 Ph ngăphápăphơnătíchăbằng sinh h c phân t Các nội dung nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích 1) WSSV mẫu động vật thủy sinh thu tự nhiên vùng nghiên cứu; 2) Xác định WSSV nhân lên tế bào vật chủ điều kiện thí nghiệm gây nhiễm; 3) Tinh mẫu ADN trước gi i trình tự gen WSSV thu mẫu nhiễm điều kiện tự nhiên giám định lồi động vật mang lan truyền WSSV cho tơm thẻ chân trắng 3.4.4 Ph ngăphápătáchăchi t ADN Thực theo quy trình kít tách chiết ADN (Qiagen-DNA) 3.4.5 Ph ngăphápătáchăchi t ARN Thực theo quy trình Kít tách chiết ARN (IQ2000) 3.4.6 T ng h p cDNA Thực theo kít RevertAid First Strand cDNA 3.4.7 Khuy chăđ i ADN Sau có ADN mẫu, tiếp tục cho hóa ch t chạy với chu trình nhiệt tương ứng với cặp mồi WSSV366 COI, nhằm khuyếch đại ADN mẫu 3.4.8 Chu trình nhi t c a PCR Chu trình nhiệt cho cặp mồi bao gồm WSSV366 (phát WSSV) cặp mồi COI (giám định loài) 3.4.9 Tinh s ch ADN (s n phẩmăqătrìnhăđi n di) Thực theo kít QIAquick PCR Purification Kit 3.4.10 Đ nhăl ng n ngăđ WSSV kỹ thu t Real time PCR Kỹ thuật Real time PCR với ch t huỳnh quang SYBR Green I sử dụng để đánh giá nồng độ virus 3.5 GÂY NHI M XÁC Đ NH KH NĔNGăMANGăWSSV C A Đ NG V T TH Y SINH 3.5.1 Gây nhi m WSSV lênăđ ng v t th y sinh hình th c tiêm Phương pháp c m nhiễm áp dụng theo (Wu et al., 2005; Kim et al., 2014; Chen et al., 2004) 3.5.2 Gây nhi m WSSV lênăđ ng v t th y sinh hình th c ngâm Áp dụng phương pháp c m nhiễm hình thức ngâm Chen et al., (2004) 3.6 GÂY NHI M XỄCă Đ NH KH NĔNGă LANă TRUY N WSSV T Đ NG V T TH Y SINH SANG TÔM TH TRONGăCỐNGăMỌIăTR NG NUÔI Sử dụng tôm chân trắng bệnh SPF L vannamei nuôi chung với động vật mang mầm bệnh đ m trắng gây nhiễm nhân tạo 3.7 PHÂN TÍCH VÀ X LÝ S LI U S liệu xử lý nh hỗ trợ phần mềm SPSS 17.0 th ng kê mơ t Excel 2007 Cơng thức tính OR-tỷ s chênh PH N K T QU VÀ TH O LU N 4.1 ĐI U TRA HI N TR NG VÙNG NUÔI,ăĐỄNHăGIỄăM I NGUYăLIểNăQUANăĐ N TÔM NUÔI B B NHăĐ M TR NG T I QU NGăNINH,ăNAMăĐ NH VÀ NGH AN 4.1.1 Thông tin chung v hi n tr ng qu n lý b nhăđ m tr ng tôm nuôi t i vùng nghiên c u 4.1.1.1 Thực trạng nuôi tôm vùng nghiên cứu theo không gian Diện tích ao ni tơm Nam Định nh nh t (0,05ha/ao) Qu ng Ninh 0,2ha/ao Nghệ an 0,3ha/ao Mỗi hộ nuôi thuộc tỉnh s hữu s ao nuôi khác nhau, dao động từ 1-8 ao/hộ (Nam Định) 1-9 ao/hộ (Qu ng Ninh) 1-11 ao/hộ (Nghệ An) Qu ng Ninh có tỷ lệ s hộ th p nh t sử dụng hệ th ng ao lắng (39,5%) 16% sử dụng lưới lọc, tiếp đến Nghệ an có 88% s hộ sử hệ th ng ao lắng 24% hộ sử dụng lưới lọc cao nh t Nam Định với 100% hộ l y nước vào ao qua ao lắng 33,3% sử dụng lưới lọc Trong q trình ni, Nam Định s lần bổ sung nước vào ao nuôi nh t (0-4 lần/vụ), Nghệ An Qu ng Ninh có hộ ni c p nước vào ao nuôi tương ứng 0-8 lần/vụ nuôi 0-15 lần/vụ nuôi Đặc biệt, Nam Định nguồn nước bổ sung vào ao vụ nuôi phần lớn ngư i nuôi l y từ giếng máy khoan 10 4.1.1.2 Thực tr ng v nuôi tôm t i vùng nghiên c u theo th i gian Nhìn chung hộ nuôi tôm Nghệ An Qu ng Ninh bắt đầu th tôm vào tháng kết thúc vào tháng hàng năm, ngoại trừ s hộ Nam Định th nuôi muộn (tháng đến tháng 10) vụ nuôi thứ nh t, tỷ lệ % trung bình s hộ có tơm bệnh đ m trắng cao nh t tháng nuôi thứ nh t (21,9%) có sai khác ý nghĩa đ i với tháng thứ (p0,05) vụ ni thứ 2, tỷ lệ trung bình hộ ni có tơm nhiễm bệnh WSSV gây xu t tháng nuôi thứ ba cao nh t (25,4%), tiếp đến tháng nuôi thứ nh t (14,9%) cu i tháng nuôi thứ hai (11,5%), tỷ lệ xu t bệnh tháng vụ nuôi có khác biệt ý nghĩa với p 10 (p=0,002) Bên cạnh đó, vai trị hoạt động gi m s c cho tơm gi ng th nuôi rõ, ao nuôi không áp dụng kỹ thuật gi m s c cho tơm gi ng tơm ni có nguy nhiễm bệnh WSSV gây cao g p 4,8 lần so với ao có áp dụng kỹ thuật (p=0,001) Ngoài ra, xu t sinh vật khác ngồi tơm ni ao ni tơm d u hiệu báo nguy tôm nuôi nhiễm bệnh WSSV cao g p 3,9 lần so với ao nuôi không xu t giáp xác (p=0,006) Xét yếu t nguy sinh vật khác ngồi tơm chân trắng, kết qu nghiên cứu cho th y có 11 loài động vật “hoang dã”ghi nhận xu t vùng ni tơm, có lồi thuộc giáp xác (cáy đ , tôm r o, tôm gai, tôm cịng lơng) Trong s 11 lồi ra, có đến 10, 11 lồi có mặt vùng nuôi Nghệ An Qu ng Ninh, Nam Định với lồi phát có mặt vùng ni (B ng 4.1) 13 B ng 1: Thành ph n loài sinh v t xu t hi n vùng nuôi tôm TT LoƠiăsinhăv t Cá b ng, n(%) Gobius sp Cáy đ , n(%) Tôm gai, n(%) Tơm càng, n(%) Cịng lơng, n(%) c đinh, n(%) Uca arcuata Exopalaemon carinicauda Macrobrachium nipponense Macrophthalmus convexus Cerithium cingulata Corbula erythrodon Mytilus sp Dắt, n(%) Vẹm, n(%) Nòng nọc, n(%) 10 11 Tênăkhoaăh c Vùngănghiênăc u Nam Qu ngă Ngh ăAn Đ nh Ninh (n=50) (n=45) (n=49) 27(54,0) (4,1) 17(34,0) 8(17,8) 13(27,9) 30(60,0) 7(15,6) 10(20,4) 17(34,0) 11(24,4) 5(11,6) 1(2,0) - 4(8,2) 20(40,0) 39(86,7) 17(34,9) 2(4,0) - - 3(6,0) (11,1) 1(2,3) - 5(11,6) (13,3) 1(2,3) - 1(2,3) Tylototriton sp 15(30,0) Metapenaeus Tôm r o, n(%) (8) ensis Giun nhiều tơ, Nephthys 1(2,0) n(%) polybranchia Ghi chú: (-) không xuất hộ nuô 4.2 NGHIÊN C UăXÁCăĐ NHăĐ NG V T TH Y SINH CH Y U MANG WSSV T I NGH AN,ăNAMăĐ NH VÀ QU NG NINH 4.2.1 Đ ng v t thuỷ sinh nhi m WSSV thuăđ ợcătrongăđi u ki n tự nhiên Nghiên cứu xác định lồi thuộc giáp xác (tơm – M nipponense) nhiễm WSSV với tỷ lệ nhiễm 7,14% 4.2.2 Đ ng v t th y sinh ch y u mang virus đ m tr ng u ki n thí nghi m 4.2.2.1 Nồng độ WSSV sử dụng thí nghiệm gây nhiễm Thí nghiệm gây nhiễm hình thức ngâm sử dụng WSSV nồng độ 1,31x107copy/mL Thí nghiệm gây nhiễm hình thức tiêm sử dụng WSSV nồng độ 1,02x106copy/mL 14 4.2.2.2 Động vật thủy sinh nhiễm WSSV điều kiện thí nghiệm phương pháp tiêm Sau 107h (4,5 ngày) gây nhiễm, WSSV chép nhân lên cáy đ U arcuata (Hình 4.1), nhiên cáy đ nhiễm virus đ m trắng khơng có d u hiệu bệnh lý b t thư ng Hình 1:ăWSSVăđưăđ ợcăxácăđ nh m u sau gây nhi m theo th i gian 1,2,4 5: cáy đỏ thu sau 55, 72, 120 107h gây nhiễm, 6, 7, mẫu nước thu sau 107 175h gây nhiễm, 8,9 cạn bể thu sau 107 175h gây nhiễm, 10, 11 12 mẫu cáy đỏ, nước cặn bể đối chứng, 13 đối chứng dương, 3: Marker 100bp Kết qu nghiên cứu phù hợp với kết qu s nghiên cứu khác nhiều loài sinh vật thuộc giáp xác cua xanh, cua bùn… sinh vật chủ mang WSSV hình thức lây nhiễm tự nhiên nhân tạo, WSSV không nh hư ng đến vật chủ trình phát triển (Kanchanaphum et al., 1998) Đ i với cua, WSSV không nh hư ng đến tỷ lệ s ng đồng th i không gây biểu bệnh lý khác thư ng (Ghosh., 2014; Rajendran et al., 1999), song xác định m i nguy tiềm ẩn gây bệnh lên tơm theo hình thức lan truyền bệnh theo chiều ngang (Kanchanaphum et al., 1998) 4.2.3 Động vật thủy sinh nhiễm WSSV điều kiện thí nghiệm phương pháp ngâm Nghiên cứu sử dụng độ pha loãng 10-2 tương ứng với 1,31x107 copy/mL sử dụng gây nhiễm cho động vật thủy sinh, kết qu cho th y sau 25 ngày theo dõi tỷ lệ nhiễm WSSV tích lũy đ i tương (nòng nọc ếch, cá b ng c đinh) 0%, tỷ lệ nhiễm WSSV tôm gai 100% ngày thứ Bên cạnh việc phân tích mẫu với tiêu WSSV d u hiệu bệnh lý quan sát ghi nhận T t c lơ thí nghiệm 15 lơ đ i chứng, động vật gây nhiễm khơng có khác biệt hoạt động, màu sắc 4.3 KH NĔNGăLANăTRUY N WSSV T Đ NG V T TH Y SINH SANG TÔM TH CHÂN TR NGăTRONGăCỐNGăMÔIăTR NG NUÔI 4.3.1 Kh nĕngălâyătruy n WSSV t cáyăđ sang tôm th chân tr ng Kết qu phân tích cách phát mRNA thơng qua tổng hợp cDNA WSSV mẫu TCT cho th y: sau 175h (tức sau 68h nuôi chung) tôm chưa nhiễm WSSV, sang đến 190 gi (sau 83 gi kể từ cáy đ nhiễm WSSV) s mẫu tôm có kết qu dương tính với WSSV tỷ lệ s mẫu dương tính tăng dần theo th i gian Kết thúc thí nghiệm tỷ lệ tích lũy tơm nhiễm WSSV 81,8%, lơ đ i chứng cho kết qủa âm tính với WSSV c cáy tôm Kết qu nghiên cứu U arcuata động vật có kh mang lan truyền WSSV cho tôm nuôi kết qu bổ sung thêm vào danh sách loài mang WSSV giới, đồng th i kết qu xác nhận loài cáy Việt Nam mang lan truyền virus cho tôm nuôi Kết qu nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu nhằm đưa đề xu t gi i pháp loại b có mặt cáy đ q trình ni tơm nước lợ Chính việc giám định loài sinh học phân tử cần thiết Kết qu cho th y cáy đ có tính tương đồng cao với Uca arcuata (99%) (Hình 4.2) Vậy kết qu định danh hình thái học hồn tồn trùng khớp với định danh sinh học phân tử với cặp mồi COI Hình 2: K t qu đ nhădanhăcáyăđ sinh h c phân t (A) Sản phẩm PCR mẫu cáy đỏ chạy với cặp mồi COI: ADN cáy đỏ khuếch đại mồi COI (giếng 2), 200 bp DNA marker (giếng M) (B) Giản đồ giải trình tự gen COI mẫu cáy đỏ (C) Kết BLAST trình tự COI cáy 16 đỏ (D) So sánh trình tự gen cáy đỏ (C1) với trình tự tham chiếu; vị trí có sai khác nucleotide đóng khung 4.3.2 Kh nĕngălanătruy n WSSV t tôm sang tôm th chân tr ng WSSV từ tôm sang TCT nuôi ngày thứ sau c m nhiễm với tỷ lệ 25% mẫu nhiễm, mẫu tơm có tỷ lệ nhiễm WSSV 100% (B ng 4.2) S mẫu tôm thẻ nhiễm WSSV tăng dần tỷ lệ thuận theo th i gian thí nghiệm từ ngày thứ 5, 10, 15, đến ngày thứ 20, 25 có tỷ lệ mẫu dương tính với WSSV tương ứng từ 25; 66,7; 83,3 100% (B ng 4.2) Trong đó, lơ đ i chứng mẫu phân tích tiếp tục có kết qu âm tính đ i với WSSV c tơm thẻ tôm (B ng 4.2) B ng 4.2: K t qu phân tích WSSV tơm tơm th thí nghi măxácăđ nh kh nĕngălanătruy n WSSV Tỷ l m uăd Th i gian (ngày ) Lơ gây nhi m WSSV ngătínhăWSSV (%) Lơăđ i ch ng Tôm Tôm th Tôm Tôm th (n=33) (n=33) (n=22) (n=22) 100 25 0 10 100 66,7 0 15 100 83,3 0 20 100 100 0 25 100 100 0 100 75,0 0 Tỷ lệ nhiễm tích lũy (%) Ghi chú: thời gian thu mẫu sau cảm nhiễm Điều kiện thí nghiệm: độ mặn 8-9‰, nhiệt độ 27-290C Kết qu nghiên cứu xác định M nipponense nhiễm WSSV điều kiện tự nhiên có kh lan truyền WSSV tôm thẻ 17 nuôi nghiên cứu công b Việt Nam Đ i với tôm thuộc gi ng Macrobrachium, xác định lồi bao gồm M idella, M lamerrae, M rosenbergii có kh mang lan truyền WSSV cho tôm nuôi (Đặng Hoàng Oanh cs., 2012; Sahul Hameed et al., 2000), M rosenbergii xác định có kh đáp miễn dịch t t với WSSV (Sarathi et al., 2008) Hình 4.3: K t qu đ nh danh tôm sinh h c phân t (A) Sản phẩm PCR mẫu tôm chạy với cặp mồi COI: ADN tôm khuyếch đại mồi COI (giếng 1), 200 bp DNA marker (giếng M) (B) Giản đồ giải trình tự gen COI mẫu tơm (C) Kết BLAST trình tự COI tơm (D) So sánh trình tự gen tơm (C1) với trình tự tham chiếu; vị trí có sai khác nucleotide đóng khung Để c nh báo cho ngư i ni nhận dạng lồi tơm loại b có mặt chúng trình ni TCT tơm sú, việc giám định lại tên lồi phương pháp có độ tin cậy cao cần thiết Kết qu giám định sinh học phân tử cho th y tơm có độ tương đồng cao với M nipponense (99-100%) (Hình 4.3) Như kết qu định danh lồi hình thái học hoàn toàn trùng khớp với kết qu định dang sinh học phân tử với cặp mồi COI 4.3.3 Kh nĕngălanătruy n WSSV t tôm gai sang tôm th chân tr ng Thí nghiệm b trí nhằm xác định kh lan truyền WSSV từ tôm gai sang tôm thẻ chúng nuôi môi trư ng nước Sau ngày gây nhiễm tôm gai có kết qu dương tính với virus đ m trắng 100% tơm thẻ chân trắng đạt 41,7%, tỷ lệ tăng dần theo th i gian ngày thí nghiệm đạt 91,7% (ngày thứ 10) 100% từ ngày thứ 15 tr sau, bên cạnh lơ đ i chứng c tơm gai tơm thẻ cho kết qu âm tính với WSSV từ ngày đầu thí nghiệm đến kết thúc thí nghiệm (B ng 18 4.3) Trong su t trình thí nghiệm tơm gai khơng có biểu b t thư ng, chúng bắt mồi, hoạt động bình thư ng dù có kết qu dương tính với virus đ m trắng từ ngày thứ thí nghiệm Kết qu nghiên cứu hoàn toàn trùng hợp với nghiên cứu trước E carinicauda nhiễm WSSV c điều kiện tự nhiên thí nghiệm (Lei et al., 2002; OIE 2016) Hơn nữa, kết qu nghiên cứu Duan et al., (2015, 2014) Wang et al., (2013) WSSV không nh hư ng đến lồi tơm E carinicauda Ngun nhân xác định WSSV không nh hư ng đến tôm gai b i lồi protein có tên EcCRT cư trú mang, gan tụy, cơ, buồng trứng, ruột, dày mắt, đặc biệt với mức biểu cao nh t hemocytes buồng trứng EcCRT đóng vai trị quan trọng việc điều hòa ion Ca2+ thể, phân tử ion có vai trị việc đáp ứng miễn dịch tự nhiên với s tác nhân virus, có WSSV (Duan et al., 2014, 2015; L Wang et al., 2013) B ng 3: K t qu phân tích WSSV tơm gai tơm th thí nghi măxácăđ nh kh nĕngălanătruy n WSSV Th i gian (ngày1) Tỷ l m uăd ngătínhăWSSV (%) Lô c m nhi m WSSVV Lôăđ i ch ng Tôm gai Tôm th Tôm gai Tôm th 100 41,7 0 10 100 91,7 0 15 100 100 0 20 100 100 0 22 100 100 0 100 86,6 0 Tỷ lệ nhiễm tích lũy (%) 19 Ghi chú: thời gian thu mẫu sau cảm nhiễm Tương tự cáy đ tơm tơm gai giám định lồi phương pháp sinh học phân tử sau xác định lồi có kh mang lan truyền WSSV sang tôm thẻ nuôi môi trư ng nước Mẫu tôm gai khuyếch đại ADN với cặp mồi COI, kết qu điện di cho th y hình nh s n phẩm có độ dài tương ứng kho ng 700bp (Hình 4.4A) S n phẩm PCR đặc hiệu sau tinh gi i trình tự thu đỉnh tín hiệu rõ ràng (Hình 4.4B) Kết qu BLAST tìm kiếm trình tự tương đồng có ngân hàng Genbank cho th y mẫu tôm gai có tương đồng r t cao với lồi Exopalaemon carinicauda với độ tương đồng 99-100% (Hình 4.4C) độ tượng đồng 99% với mẫu Exopalaemon carinicauda xác định có đột biến điểm (Hình 4.4D) Như kết qu định danh theo hình thái học hồn tồn trùng khớp với kết qu định danh sinh học phân tử với cặp mồi COI Hình 4: K t qu đ nh danh tôm gai sinh h c phân t (A) Sản phẩm PCR mẫu tôm gai chạy với cặp mồi COI: ADN tôm gai khuyếch đại mồi COI (giếng 2), 500 bp DNA marker (giếng M) (B) Giản đồ giải trình tự gen COI mẫu tơm gai (C) Kết BLAST trình tự COI tơm gai (D) So sánh trình tự gen tơm gai (C1) với trình tự tham chiếu; vị trí có sai khác nucleotide đóng khung PH N K T LU N VÀ Đ XU T 5.1 K t lu n 1) Điều tra trạng vùng nuôi, đánh giá m i nguy liên quan đến tôm nuôi bị bệnh đ m trắng tỉnh Qu ng Ninh, Nghệ An Nam Định Luận án thu mẫu th ng kê xác định 23 lồi động vật thủy sinh xu t vùng ni tôm Nghệ An, Qu ng Ninh Nam Định Trong 16 lồi xu t với tần su t cao bao gồm; tôm r o, 20 tôm càng, tơm gai, cáy đ , nịng nọc ếch, c đinh, cá b ng loài động vật phù du Có yếu t xác định m i nguy liên quan đến dịch bệnh đ m trắng tôm tỉnh Nghệ An, Nam Định Qu ng Ninh bao gồm l y nước vào ao không qua hệ th ng ao lắng, không sử dụng lưới lọc l y nước, th gi ng với cỡ nh post 10, không gi m s c th tôm nuôi, bổ sung nước vào ao nuôi trình ni, ao nằm vùng ni có ao bệnh, không kiểm tra môi trư ng nước ao nuôi thư ng xuyên xu t giáp xác ao nuôi 2) Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang virus đ m trắng vùng nuôi tôm nước lợ Nghệ An, Nam Định Qu ng Ninh Xác định loài động vật thủy sinh chủ yếu s 16 loài mang virus đ m trắng, tơm (Macrobranchium nipponense) mang virus đ m trắng thu điều kiện tự nhiên, cáy đ (Uca arcuata) tôm gai (Exopalaemon carinicauda) mang virus đ m trắng điều kiện thí nghiệm 3) Nghiên cứu xác định kh lan truyền WSSV từ động vật thủy sinh sang tôm chân trắng môi trư ng nuôi Tôm càng, cáy đ tôm gai vector lây truyền gây bệnh đ m trắng cho tôm chân trắng L vannamei Nghiên cứu bổ sung lồi tơm càng, tơm gai cáy đ vào danh sách sinh vật mang lan truyền mầm bệnh đ m trắng cho tôm nuôi Việt Nam Trong đó, bổ sung lồi cáy đ vào danh sách loài sinh vật mang mầm bệnh đ m trắng cho tôm nuôi giới Kết qu giám định lồi cho th y ADN tơm càng, cáy đ tơm gai có kết qu tương đồng 99-100% với loài tương ứng ngân hàng gen Kết qu phân lập định danh lồi hình thái học hoàn toàn trùng khớp với kết qu định danh sinh học phân tử 21 5.2 Đ xu t Với kết qu đạt luận án hạn chế chưa thực nghiên cứu này, đưa s đề xu t sau: Tiếp tục nghiên cứu thu mẫu động vật thủy sinh phân tích theo phương pháp cắt dọc để xác định động vật mang virus điều kiện thu mẫu tự nhiên Nghiên cứu thí nghiệm gây nhiễm xác định kh mang WSSV nhóm động vật phù du xu t chủ yếu vùng nghiên cứu Thơng tin rộng rãi đến hộ ni lồi mang truyền virus đ m trắng cho tôm nuôi s đặc điểm b n nhận dạng Xây dựng mơ hình ni có can thiệp ngăn ngừa xâm nhập sinh vật mang lây truyền bệnh đ m trắng nhằm gi m thiểu dịch bệnh đ m trắng cho tôm nuôi nước lợ vùng nuôi Nghệ An, Qu ng Ninh Nam Định Tiếp tục nghiên cứu xác định kh mang mầm bệnh virus đ m trắng đ i với loài động vật phù du xác định diện phổ biến vùng nuôi tôm Qu ng Ninh, Nghệ An, Nam Định 22 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Đà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trương Thị Mỹ Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đặng Thị Lụa, Lê Thị Mây Phan Thị Vân (2016) Sinh vật mang vi rút gây bệnh đốm trắng tôm Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, Kỳ 2, Tháng 5: 85-97 Trương Thị Mỹ Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Phạm Thế Việt Phan Thị Vân (2017) Đánh giá khả lây nhiễm vi rút đốm trắng từ cáy đỏ (Uca sp.) sang tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tạp chí Khoa học Nơng Nghiệp Việt Nam, Tập 15, Số 2: 198-204 Trương Thị Mỹ Hạnh, Phan Trọng Bình, Phạm Thế Việt, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Phan Thị Vân (2017) Nghiên cứu nhiễm vi rút đốm trắng (WSSV) tôm (Macrobrachium nipponense) khả lan truyền bệnh sang tôm thẻ (Litopenaeus vannamei) Tạp chí Khoa học Cơng Nghệ Việt Nam Tập 19, Số 8: 33-38 ... tiêu c th : Xác định yếu t nguy gây bệnh đ m trắng virus cho tôm nuôi nước lợ vùng nghiên cứu Xác định loài động vật thủy sinh chủ yếu mang virus đ m trắng có kh lan truyền bệnh cho tôm theo phương... s yếu t nguy cơ, nguyên nhân gây tượng tôm nhiễm bệnh đ m trắng Xác định s loài động vật thủy sinh chủ yếu có kh mang lan truyền WSSV gây bệnh cho tôm nuôi Nghệ An, Qu ng Ninh Nam Định, xác định. .. virus đ m trắng vùng nuôi tôm nước lợ Nghệ An, Nam Định Qu ng Ninh Xác định loài động vật thủy sinh chủ yếu s 16 lồi mang virus đ m trắng, tôm (Macrobranchium nipponense) mang virus đ m trắng thu