Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng perkinsus olseni trên nghêu bến tre (meretrix lyrata) và trị bệnh trong điều kiện thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU BỆNH KÝ SINH TRÙNG Perkinsus olseni TRÊN NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata) VÀ TRỊ BỆNH TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã số: Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: Nuôi trồng thủy sản 60620301 1238/QĐ-ĐHNT ngày 30/12/2015 967/QĐ-ĐHNT ngày 08/11/2016 30/11/2016 PGS.TS PHẠM QUỐC HÙNG ThS NGÔ THỊ NGỌC THỦY Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS NGUYỄN ĐÌNH MÃO Khoa sau đại học: KHÁNH HỊA - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu riêng thực hướng dẫn thầy Phạm Quốc Hùng cô Ngô Thị Ngọc Thủy Các số liệu kết nêu luận văn trung thực lấy từ phần đề tài cấp “Nghiên cứu đặc điểm loài phương thức lây nhiễm ký sinh trùng Perkinsus spp ký sinh nhuyễn thể Việt Nam” TS Phạm Quốc Hùng Các thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Thị Hồng Nhung iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nuôi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang, Phân viện Nghiên cứu Thủy sản Nam sông Hậu - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi chân thành cảm ơn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Quốc Hùng ThS Ngô Thị Ngọc Thủy trực tiếp hướng dẫn, động viên định hướng nghiên cứu, thực đề tài viết luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô Viện Nuôi trồng Thủy sản động viên, khích lệ giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán nhân viên Phịng Mơi trường Bệnh thủy sản-Phân viện Nghiên cứu Thủy sản Nam sông Hậu, giúp đỡ nhiệt tình sở vật chất suốt trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp Xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc Nha Trang, tháng 10 năm 2016 Tác giả Nguyễn Thị Hồng Nhung iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH .ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi dịch bệnh động vật thân mềm hai mảnh vỏ 1.1.1 Tình hình ni động vật thân mềm hai mảnh vỏ .3 1.1.2 Tình hình dịch bệnh động vật thân mềm hai mảnh vỏ .5 1.2 Bệnh KST Perkinsus Một số đặc điểm KST Perkinsus 1.2.1 1.2.1.1 Vị trí phân loại 1.2.1.2 Vòng đời 1.2.1.3 Phân bố 11 1.2.1.4 Bệnh Perkinosis 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh KST Perkinsus Việt Nam 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Địa điểm, thời gian đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19 2.2.3.1 Nghiên cứu khả gây hại KST P olseni giai đoạn khác nhau.19 2.2.3.2 Nghiên cứu cảm nhiễm Perkinsus olseni nghêu Bến Tre (Thí nghiệm 2) 20 2.2.3.3 Thí nghiệm xác định phương thức lây truyền Perkinsus olseni .…20 2.2.3.4 Nghiên cứu biện pháp trị Perkinsus olseni điều kiện thí nghiệm……21 2.2.4 Phương pháp phân tích mẫu 21 2.2.5 Kiểm tra yếu tố môi trường .22 v 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu .22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết theo dõi yếu tố môi trường thí nghiệm .24 3.2 Khả gây hại Perkinsus olseni giai đoạn khác 24 3.3 Sự cảm nhiễm kí sinh trùng Perkinsus olseni nghêu Bến Tre .30 3.4 Xác định phương thức lây truyền Perkinsus olseni 33 3.5 Thử nghiệm trị bệnh Perkinsus olseni điều kiện thí nghiệm .35 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 PHỤ LỤC 44 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DFO: Deferoxamine FTM: Fluid Thioglycollate Medium KST: Ký sinh trùng OIE: World Organisation for Animal Health PCR: Polymerase Chain Reaction ĐC: Đối chứng vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Sự thay đổi yếu tố mơi trường thí nghiệm .24 Bảng Cường độ nhiễm Perkinsus olseni mật độ bào tử nghỉ khác 25 Bảng 3.3 Cường độ nhiễm nghêu tiêm Perkinsus olseni mật độ bào tử động khác 27 Bảng 3.4 Cường độ nhiễm nghêu cảm nhiễm phương pháp ngâm .31 Bảng 3.5 Cường độ nhiễm tỷ lệ nhiễm Perkinsus olseni thí nghiệm phương thức lây truyền .34 Bảng 3.6 Cường độ nhiễm Perkinsus olseni điều trị DFO mức liều lượng khác .35 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bào tử nghỉ KST Perkinsus olseni Hình 1.2 Vịng đời P olseni ký sinh nghêu Manila R philippinarum [26] 10 Hình 1.3 Sự phân bố loài Perkinsus giới 11 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu…………………………………………….16 Hình 2.2 Phân biệt nghêu Bến Tre khỏe mạnh thơng qua màu sắc thịt nghêu 17 Hình 2.3 Đo kích thước hàu, nghêu Bến Tre thí nghiệm .19 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm gây hại Perkinsus olseni .20 Hình 2.6 Các bước thực phương pháp mơ bệnh 22 Hình 3.1 Tỷ lệ chết cộng dồn nghêu tiêm mật độ bào tử nghỉ Perkinsus olseni khác nhau…………………………………………………………………… 25 Hình 3.2 Tỷ lệ chết cộng dồn nghêu tiêm mật độ bào tử động P olseni khác 26 Hình 3.3 P olseni màng áo nghêu Bến Tre sau 16 ngày thí nghiệm 28 Hình 3.4 P olseni ống gan nghêu Bến Tre sau 16 ngày thí nghiệm .28 Hình 3.5 Một số tượng tiến hành thí nghiệm 29 Hình 3.6 Tỷ lệ chết cộng dồn nghêu cảm nhiễm phương pháp ngâm 30 Hình 3.7 Tổn thương thể nghêu tiêm 32 Hình Tỷ lệ chết cộng dồn lồi vật chủ thí nghiệm phương thức lây truyền Perkinsus 33 Hình 3.9 Perkinsus olseni xuất biểu mô ống tiêu hóa nghêu Bến Tre sau 20 ngày thí nghiệm .34 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh nghêu, đặc biệt ký sinh trùng (KST) Perkinsus ít chưa có liệu có độ tin cậy cao để có thể so sánh với lồi KST Perkinsus cơng bố giới Các nghiên cứu giai đoạn KST Perkinsus có khả gây độc cao cho vật chủ đường lây truyền chúng chưa tiến hành Quan trọng hơn, khả lây nhiễm KST Perkinsus vật chủ bị nhiễm với vật chủ khơng bị nhiễm thuộc lồi lồi khác ni khu vực địa lý chưa đánh giá Ở Việt Nam, nghiên cứu trị bệnh KST Perkinsus Deferoxamine (DFO) chưa thực Xuất phát từ vấn đề trên, thực đề tài “Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) trị bệnh điều kiện thí nghiệm” nhằm xác định khả gây hại ký sinh trùng Perkinsus olseni lên nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata), đánh giá hiệu việc sử dụng DFO khả diệt Perkinsus olseni Nghiên cứu khả gây hại Perkinsus olseni giai đoạn khác có nghiệm thức bào tử nghỉ, 103, 102 tế bào nước biển 30 ‰ tiêm vào nghêu; lặp lại lần; để đánh giá tác hại bào tử động nghêu, đặt 102, 103 tế bào bào tử nghỉ vào ống falcon có mặt bào tử động quan sát, chúng ly tâm thu sinh khối để tiêm Nghiên cứu đường cảm nhiễm Perkinsus olseni bao gồm: phương pháp ngâm tiêm vào khép vỏ; phương pháp ngâm, lặp lại lần Xác định phương thức lây truyền Perkinsus olseni nghêu nhiễm KST nuôi chung với nhuyễn thể loài loài nhuyễn thể khác Nghiên cứu biện pháp trị Perkinsus olseni điều kiện phòng thí nghiệm: Kiểm tra ngẫu nhiên cường độ nhiễm Perkinsus olseni trước điều trị Các cá thể sau kiểm tra bố trí ngẫu nhiên vào nghiệm thức chứa 10, 15, 30 mg/L DFO, lặp lại lần, 20 cá thể nghêu/đơn vị thí nghiệm Ở tất thí nghiệm, cá thể nghêu chết thu mẫu phân tích mức độ cảm nhiễm Perkinsus phương pháp nuôi cấy FTM Sau kết thúc nghiên cứu, kết đạt sau: Khả gây hại giai đoạn khác Perkinsus olseni chưa thể xác định xác; Con đường cảm nhiễm chủ yếu nghêu thông qua đường lọc thức ăn nên phương pháp ngâm phương pháp cảm nhiễm tốt để đánh giá tác hại Perkinsus olseni lên nghêu Bến Tre; Perkinsus olseni có khả lây truyền từ cá thể loài khác x 72 Tasumi S, Vasta GR A galectin of unique domain organization from hemocytes of the eastern oyster (Crassostrea virginica) is a receptor for the protistan parasite Perkinsus marinus J Immunol 2007.179:3086-3098 73 Thao NTT, Choi KS Seasonal changes of Perkinsus and Cercaria infections in the Manila clam Ruditapes philippinarum from Jeju, Korea Aquaculture 2004.239:57-68 74 Thebault A, Cochennec N, Arzul I, Renault T, editors Establishing causal link between an infectious agent and mortalities in marine molluscan aquaculture on the example of Bonamia ostreae and Herpèsvirosis in oysters: proposal of a causal grid analysis 10th Symposium of the International Society for Veterinary Epidemiology and Economics, ; 2003; Vina del Mar, Chile, November 2003 75 Villalba A, Casas SM, Figueras A, Ordás CM , Reece KS Perkinsosis in molluscs: A review Aquatic Living Resources 2004.17:411-432 76 Volety AK, Chu FLE Comparison of infectivity andbpathogenicity of two life stages, meront (trophozoite) and prezoosporangia stages of the oyster pathogen Perkinsus marinus in Eastern oysters Crassostrea virginica (Gmelin 1971) Journal of Shellfish Research 1994.13:521-527 77 Waki Tsukasa, Yoshinaga Tomoyoshi Experimental challenges of juvenile and adult Manila clams with the protozoan Perkinsus olseni at different temperatures Fisheries Science 2013.79:779-786 78 Zhang H, Campbell DA, Sturm NR, Dungan CF, Lin S Spliced Leader RNAs, Mitochondrial Gene Frameshifts and Multi-Protein Phylogeny Expand Support for the Genus Perkinsus as a Unique Group of Alveolates PLoS ONE 2011.6(5) Tài liệu Internet 79 Bower SM Synopsis of Infectious Diseases and Parasites of Commercially Exploited Shellfish: Bonamia ostreae of Oysters 2011 Available from: http://www.dfompo.gc.ca/science/aah-saa/diseases-maladies/bonostoy-eng.html 80 Bower SM Synopsis of Infectious Diseases and Parasites of Commercially Exploited Shellfish: Marteilia refringens/maurini of Mussels 2011 Available from: http://www.dfo-mpo.gc.ca/science/aah-saa/diseases-maladies/mrmaurmu-eng.html 81 Bower SM Synopsis of Infectious Diseases and Parasites of Commercially Exploited Shellfish: Haplosporidium nelsoni (MSX) of Oysters 2014 Available from: http://www.dfo-mpo.gc.ca/science/aah-saa/diseases-maladies/hapneloy-eng.html 82 Denise P Perkinsus Infections of Bivalve Molluscs 2010 [updated 2013] Available from: http://edis.ifas.ufl.edu/fa178 83 FAO 2012 Available from: ftp://ftp.fao.org/FI/STAT/SUMM_TAB.HTM 84 FICen Một số biện pháp kỹ thuật quản lý nhằm ổn định nghề nuôi nghêu thương phẩm Việt Namư 2013 [24/06/2013] Available from: http://sonnptnt.nghean.vn/sonn_new/default/explorer/news/967?folder_id=94 85 Hà Kiều Nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam: hướng tới xuất 6.500 từ năm 2020 2016 Available from: http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi-trong-thuysan/nhuyen-the-hai-manh-vo-viet-nam-huong-toi-xuat-khau-tren-6-500-tan-tu-nam2020/ 43 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số liệu nội dung khả gây hại giai đoạn khác đường cảm nhiễm KST Perkinsus olseni nghêu Bến Tre Thí nghiệm lây truyền Thử nghiệm trị bệnh Cách pha mơi trường hóa chất Một số hình ảnh đề tài 44 Số trang 2 Phụ lục Số liệu nội dung khả gây hại giai đoạn khác đường cảm nhiễm KST Perkinsus olseni nghêu Bến Tre Nghêu thí nghiệm STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 T.B SD Chiều dài (cm) 3,8 3,5 4,0 4,0 4,5 4,0 4,0 3,8 3,8 4,0 4,4 4,0 4,0 4,2 3,8 4,0 4,3 3,6 3,8 3,8 3,6 3,8 3,6 3,8 3,8 3,9 0,2 Khối lượng (g) 12,25 12,24 13,12 14,23 15,14 13,12 13,25 13,25 12,90 13,26 14,75 12,88 13,24 14,75 12,75 14,21 14,52 13,24 13,43 13,51 13,26 13,64 13,15 13,63 13,17 13,48 0,74 Cường độ cảm nhiễm (bào tử/cá thể) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Số lượng nghêu chết theo ngày tiêm bào động Ngày Lần lặp 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tổng 10 10 Lần lặp 0 0 2 0 1 0 10 Số lượng nghêu chết (con) 103 Đối chứng Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần lặp lặp lặp lặp lặp lặp lặp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 10 10 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 Số lượng nghêu chết tiêm bào tử nghỉ Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 Tổng Lấn lặp 0 0 0 1 1 0 10 103 Lần lặp Lần lặp 0 0 0 1 0 3 1 0 0 0 0 10 10 Số lượng nghêu chết (cá thể) 102 Đối chứng Lấn lặp Lần lặp Lần lặp Lấn lặp Lần lặp Lần lặp 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 1 1 1 1 0 10 10 10 7 Số lượng nghêu chết ngâm bào tử nghỉ bào tử động Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Số lượng nghêu chết (con) Bào tử động Bào tử nghỉ Đối chứng Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần lặp lặp lặp lặp lặp lặp lặp lặp lặp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Xử lý số cường độ cảm nhiễm tiêm bào tử nghỉ Independent sample T-Test Ngày thứ sau tiêm Ngày thứ 12 sau tiêm Ngày thứ 16 sau tiêm Xử lý số cường độ cảm nhiễm tiêm bào tử độngs Independent sample T-Test Ngày thứ sau tiêm Ngày thứ 12 sau tiêm Ngày thứ 16 sau tiêm Ngày thứ 20 sau tiêm Phụ lục Thí nghiệm lây truyền Cường độ cảm nhiễm nghêu Bến Tre ban đầu Cường độ nhiễm Perkin vật chủ bị nhiễm Mật độ Thể tích Cường độ nhiễm ( bào tử/100 µl) (mL) (BT/con) 20 333,33 19 20 1266,67 23 20 1533,33 20 466,67 32 20 2133,33 20 200,00 T.B 988,89 SD 775,65 STT Cường độ cảm nhiễm nghêu Bến Tre thí nghiệm Cường độ cảm nhiễm (Bào tử/cá thể) Ngày SL 1 10 11 12 13 14 15 16 TB SD NT 1.1 CĐ nhiễm 500 700 200 400 500 600 1200 600 400 500 560 263.3 SL 1 TB SD NT 1.2 CĐ nhiễm 0 0 200 1100 200 800 300 1300 390 508.3 Phụ lục 3: Thử nghiệm trị bệnh Cường độ cảm nhiễm ban đầu nghêu nhiễm bệnh Cường độ nhiễm nghêu Cần Giờ ban đầu Số lượng (bào tử/cá thể) STT Lần Lần Lần TB 1200 1500 1300 1333,33 1700 1600 1600 1633,33 1000 1200 1300 1166,67 2100 2500 2200 2266,67 1700 1600 1800 1700 1600 1500 1600 1566,67 2300 1900 2000 2066,67 2100 2200 2100 2133,33 1800 1600 1900 1766,67 10 1500 1900 1400 1600 11 0 0 12 2000 2300 2100 2133,33 13 1700 1900 2000 1866,67 14 1200 1300 1200 1233,33 15 2400 2300 2600 2433,33 TB 1660 SD 593,777 Số lượng nghêu chết theo ngày Ngày 1(28/5) (2/6) Tổng 10 mg/L Lần lặp Lần lặp 3 4 3 20 20 Số lượng (cá thể) 15 mg/L 30 mg/L Lần lặp Lần lặp Lần lặp Lần lặp 2 4 6 3 2 3 20 20 20 20 Cường độ cảm nhiễm nghêu theo ngày Cường độ cảm nhiễm (bào tử/cá thể) Ngày STT 10 mg/L 15 mg/L 30 mg/L Lần lặp Lần lặp Lần lặp Lần lặp Lần lặp Lần lặp 1660 1660 1660 1660 1660 1660 1175 2075 2025 2000 1950 1225 1625 1950 2100 2075 2000 2225 2125 1325 1700 1850 1525 2050 2200 1550 2125 1500 1625 1800 1650 1575 2025 1375 1700 2450 1425 1875 1625 1400 1700 2075 1525 2150 1900 1175 1350 1625 1450 1600 1650 1500 1575 1550 1875 1850 2025 1725 1550 1925 2200 1700 1600 2025 2025 1775 2150 2025 1700 1825 1500 1450 2000 2175 2075 1675 1275 1150 1850 1450 1350 1175 1350 1600 1525 1625 1400 1550 1775 1500 1550 1300 1725 1425 1300 1525 1300 1325 1425 1300 1975 1225 1100 1700 1150 1825 1025 1375 1475 1425 1150 1550 1650 1225 1750 1450 1575 1225 1525 1600 1575 1425 1225 1525 1500 1425 1000 1450 Phụ lục 4: Cách pha mơi trường hóa chất Cách pha môi trường nuôi cấy Môi trường FTM: 29,7g Muối NaCl: 20g Nước cất: lít Đun hồn hợp mơi trường FTM bếp khuấy từ môi trường chuyển màu vàng nhẹ (lưu ý: môi trường chuyển màu sơi nhanh) (hình 1.1) Hấp tiệt trùng giữ mơi trường bóng tối, tránh oxi nhiệt độ phòng Dung dịch Davidson Nước biển: 1200 ml Formaline: 800 ml Ethanol 99,5 %: 1200 ml Glycerin: 400 ml Acid acetic: 400 ml NaOH 2M: NaOH: 80g Nước cất: 1000ml Một số hình ảnh đề tài Bào tử nghỉ tế bào Bào tử nghỉ tế bào Bào tử nghỉ n tế bào Bào tử chuẩn bị phóng bào tử động ... dung nghiên cứu Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) thử nghiệm trị bệnh điều kiện thí nghiệm Nghiên cứu khả gây hại Phương thức lây truyền Thử nghiệm trị. .. ? ?Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) trị bệnh điều kiện thí nghiệm? ??  Mục tiêu Xác định khả gây hại P olseni lên nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) Đánh giá... nghiên cứu trị bệnh KST Perkinsus Deferoxamine (DFO) chưa thực Xuất phát từ vấn đề trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) trị bệnh điều