1800 mẫu nghêu thương phẩm thu tại Bến Tre được sử dụng để bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các mức nhiệt độ và độ mặn khác nhau lên sự hình thành bào tử nghỉ của ký sinh trù[r]
(1)ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐỘ MẶN LÊN QUÁ TRÌNH
HÌNH THÀNH BÀO TỬ NGHỈ CỦA KÝ SINH TRÙNG PERKINSUS SP.
TRÊN NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata)
EFFECTS OF TEMPERATURE AND SALINITY ON THE IN VITRO HYPNOSPORE FORMATION OF PERKINISUS SP IN BEN TRE HARD CLAMS (Meretrix lyrata)
Hứa Thị Ngọc Dung1, Phạm Quốc Hùng1
Ngày nhận bài: 09/11/2015; Ngày phản biện thông qua: 09/3/2016; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016
TÓM TẮT
Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ độ mặn lên hình thành bảo tử nghỉ ký sinh trùng Perkinsus sp nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) thương phẩm điều kiện thí nghiệm, nghiên cứu thu 1.800 mẫu nghêu từ Bến Tre để thí nghiệm với mức nhiệt độ 20, 25, 30, 400C độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25,
30‰ ni ủ điều kiện yếm khí tối Các ống nghiệm mức thí nghiệm kiểm tra có mặt bào tử nghỉ theo phương pháp Ray (1952) điều chỉnh Choi ctv (1989) sau 1, 2, 4, 14 ngày ủ môi trường Ray fl uid thioglycollate medium (RFTM) Kết nghiên cứu cho thấy ký sinh trùng Perkinsus spp biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ khoảng nhiệt độ nước từ 20-350C Trong đó, nhiệt độ 30-350C xem khoảng nhiệt độ tối ưu cho trình biến thái từ
thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ thời gian biến thái xảy nhanh (sau ngày ủ) Còn 200C,
trình biến thái diễn chậm (sau ngày ủ) Qua thí nghiệm ảnh hưởng độ mặn lên hình thành bào tử nghỉ từ thể dinh dưỡng ký sinh trùng Perkinsus cho thấy lồi rộng muối bào tử nghỉ phát tất nghiệm thức độ mặn khác nhau, kể mức 0‰ Tuy nhiên, trình hình thành bào tử nghỉ diễn nhanh mức độ mặn >15‰ (xuất bào tử nghỉ 1, ngày đầu ủ) Trong từ độ mặn <10‰ trình biến thái diễn chậm (sau 4-7 ngày ủ).
Từ khóa: Perkinsus, nghêu Bến Tre, Meretrix lyrata, bào tử nghỉ, ký sinh trùng đơn bào
ABSTRACT
We evaluated the effects of temperature and salinity on the in vitro hypnospore formation of Perkinsus sp in commercial Ben Tre hard clams (Meretrix lyrata) A full factorial experiment with temperatures: 20, 25, 30, 400C and salinities: 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰ were conducted in dark and anaerobic condition
The presence of hypnospore of Perkinsus sp 1,800 hard clams were checked after 1, 2, 4, 7, and 14 incubating days by Ray (1952) method and adjusted by Choi et al, 1989 in Ray fl uid thioglycollate medium (RFTM) The results showed that hypnospore of Perkinsus sp could be formed from trophozoite in temperature range from 20 to 350C with optimum temperature at 30-350C as indicated by the fastest hypnospore formation after day
of incubation At 200C, hypnospore were created more slowly (after days incubation) In salinity experiment,
hypnospore of Perkinsus sp could be formed in all treatments, even at 0‰ However, hypnospore were created faster in salinity >15‰ (after 1-2 incubation days) In salinity level ≤10‰ hypnospore of Perkinsus sp were formed slower (after 4-7 incubation days).
Keywords: Perkinsus, Ben Tre hard clams (Meretrix lyrata), hypnospore, Protozoa parasite
1 Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang
(2)I ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong năm gần đây, nghề nuôi động vật thân mềm mảnh vỏ Việt Nam phát triển mạnh mẽ với đối tượng ni có giá trị kinh tế cao nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata), nghêu lụa (Paphia undulata), tu hài (Lutraria rhynchaena), ngao dầu (Meretrix meretrix Linnaeua, 1758),… Tuy nhiên, song song với việc phát triển đó, nghề ni đối tượng phải đối mặt với khó khăn tượng chết hàng loạt diện rộng nhiều địa phương nước, chưa rõ nguyên nhân Những thiệt hại kinh tế, môi trường nghiêm trọng gây lo lắng cho người dân nhà quản lý, tìm nguyên nhân giải pháp ngăn ngừa giảm thiểu thiệt hại trở nên cấp thiết Hiện nay, có nhiều nguyên nhân cho gây dịch bệnh nhiều loài động vật hai mảnh vỏ có giá trị Việt Nam, có ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Perkinsus Các báo cáo cho thấy Perkinsus gây tỷ lệ chết cao hàng loạt cho nhiều loại nhuyễn thể có giá trị tồn giới Villalba ctv (2004) cho biết, Perkinsus sp gây hoại tử mô, giảm tăng trưởng, giảm khả sinh sản, giảm tích trữ lượng mơ vật chủ gây tỷ lệ chết cao cho vật chủ [7]
Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh động vật hai mảnh vỏ, đặc biệt bệnh Perkinsus spp gây cịn Kết
của cơng trình nghiên cứu cho thấy hữu tác nhân có hình thái giống Perkinsus số lồi hai mảnh vỏ nuôi nhiều vùng nuôi trọng điểm nước ta Phần lớn nghiên cứu dừng lại mức độ xác định có mặt mức độ cảm nhiễm Perkinsus số kỹ thuật mô học nuôi môi trường FTM [1, 2, 3, 4] Thông tin tác động yếu tố môi trường nhiệt độ, độ mặn lên biến thái Perkinsus nghêu Bến Tre Việt Nam chưa nghiên cứu Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên biến thái ký sinh trùng Perkinsus nghêu giúp ích cho việc xác định thời điểm thả giống, thời điểm thu hoạch tránh thời điểm bùng phát bệnh Perkinsus gây nghêu nuôi Việt Nam
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
1800 mẫu nghêu thương phẩm thu Bến Tre sử dụng để bố trí thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiệt độ độ mặn khác lên hình thành bào tử nghỉ ký sinh trùng Perkinsus nghêu Bến Tre điều kiện thí nghiệm Nghêu sử dụng nghiên cứu có kích cỡ chiều dài, chiều rộng, chiều cao trọng lượng trung bình tương ứng sau: 3,57±0,18; 2,91±0,16; 1,83±0,12; 13,56±2,17
Hình Nghêu dùng thí nghiệm thao tác đo kích thước, cân trọng lượng nghêu
2 Phương pháp nghiên cứu
Nghêu thí nghiệm thu địa điểm Bình Đại - Bến Tre Căn vào kết thí nghiệm trước tỷ lệ cảm nhiễm cường
(3)đã lựa chọn thu để làm tiếp thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiệt độ độ mặn lên thời gian hình thành bào tử nghỉ nghêu 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên hình thành bào tử nghỉ Perkinsus
600 mẫu nghêu thương phẩm sử dụng để tiến hành thí nghiệm với bốn mức nhiệt độ (20, 30, 35, 400C) ảnh hưởng lên thời gian biến thái (1, 2, 4, 14 ngày) ký sinh trùng Perkinsus từ giai đoạn thể dinh dưỡng thành bào tử nghỉ Mỗi nghiệm thức lặp lại lần, mô mang cá thể nghêu thu, cân đặt vào ống nghiệm 15ml có chứa mơi trường FTM có bổ sung kháng sinh (mang 10 cá thể nghêu/1 ống nghiệm) Sau lắc trộn mang với môi trường, ống nghiệm chứa mẫu ủ mức nhiệt độ 20, 30, 35, 400C bóng tối mang hủy kiểm tra hình thành bào tử nghỉ sau 1, 2, 4, 14 ngày ủ Thí nghiệm tiến hành quan sát thấy bào tử nghỉ xuất dừng Kích thước nghêu thí nghiệm cân đại đo đại diện 35 nghêu với kích cỡ trung bình chiều dài, chiều rộng, chiều cao trọng lượng tương ứng sau: 3,59±0,19; 2,93±0,17; 1,82±0,14; 13,90±2,34 Do mục tiêu thí nghiệm theo dõi thời gian hình thành bào tử nhanh hay chậm mức nhiệt độ khác nên số liệu thể kích cỡ nghêu thí nghiệm khơng trình bày phần kết nghiên cứu
2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng độ mặn lên hình thành bào tử nghỉ Perkinsus
Nước cất sử dụng để pha môi trường FTM cho thêm NaCl đo độ mặn khúc xạ kế điều chỉnh đến với mức độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰, sau đem pha mơi trường FTM, hấp tiệt trùng môi trường trước bố trí nghiệm 1200 mẫu nghêu thương phẩm sử dụng để tiến hành thí nghiệm với mức độ mặn từ
0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰ ảnh hưởng lên thời gian biến thái (1, 2, 4, 14 ngày) ký sinh trùng Perkinsus từ giai đoạn thể dinh dưỡng thành bào tử nghỉ (tương tự bố trí thí nghiệm nhiệt độ mục 2.1.) ủ nhiệt độ 250C Thí nghiệm tiến hành cho tới quan sát thấy bào tử nghỉ xuất ngừng Kích thước nghêu thí nghiệm cân đại đo đại diện 35 nghêu với kích cỡ trung bình chiều dài, chiều rộng, chiều cao trọng lượng tương ứng sau: 3,55±0,17; 2,90±0,15; 1,85±0,11; 13,21±1,95 Do mục tiêu thí nghiệm theo dõi thời gian hình thành bào tử nhanh hay chậm mức độ mặn khác nên số liệu thể kích cỡ nghêu thí nghiệm khơng trình bày phần kết nghiên cứu
2.3 Phân lập Perkinsus
(4)III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hình thành bào tử nghỉ Perkinsus
Kết thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiệt độ 20, 30, 35, 400C lên thời gian
biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ kí sinh trùng Perkinsus sp nghêu Bến Tre trình bày Bảng Bào tử nghỉ xuất thời điểm khác lô thí nghiệm 20, 30 350C khơng xuất 400C.
Hình Các thao tác q trình thí nghiệm
A Tách vỏ lấy mang; B Cho mang vào ống nghiệm chứa môi trường FTM; C Lắc trộn đều; D Xếp vào Khay đựng;
E Đem nuôi ủ tủ ấm với nhiệt độ tùy thí nghiệm; F Ly tâm 3000rpm kéo dài phút; G Đổ bỏ dịch bên trên; H Thêm NaOH 2M; I Lắc trộn đều; J Đem ủ bể ổn nhiệt nhiệt độ 600C; K Giữ cặn sau ly tâm 1ml PBS
Bảng Ngày xuất bào tử nghỉ ảnh hưởng nhiệt độ
Ngày ủ Nhiệt độ(0C)
20 30 35 40
1 - + +
-2 - NK NK
-4 - NK NK
-7 + NK NK
-14 NK NK NK
(+): Phát bào tử nghỉ; (-): Không phát hiện; NK: Khi phát bào tử nghỉ (+) ngừng kiểm tra vào ngày tiếp theo
Ở nhiệt độ 30 350C trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ xảy nhanh, quan sát thấy bào tử nghỉ sau ngày ủ Trong nhiệt độ 200C trình biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ diễn chậm hơn, quan sát thấy bào tử nghỉ sau ngày ủ Như vậy, điều kiện thí nghiệm, q trình biến thái kí sinh trùng Perkinsus sp từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang giai đoạn bào tử nghỉ diễn nhanh mức nhiệt độ 30 350C
Do đó, mức nhiệt độ 30 350C xem mức nhiệt độ tối ưu cho hình thành bào tử nghỉ ký sinh trùng Perkinsus sp điều kiện thí nghiệm
(5)nghỉ quan sát thấy vào ngày thứ sau ủ, nhiệt độ 100C 40C bào tử nghỉ xuất vào ngày thứ sau ủ Như thấy rằng, biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ ủ nhiệt độ cao diễn nhanh (200C 300C), nhiệt độ thấp trình xảy chậm (40C 100C) Điều khác biệt nhiệt độ khu vực địa lý, nghiên cứu Park ctv (2009) tiến hành Hàn Quốc – khu vực ôn đới nên mức nhiệt độ thí nghiệm từ – 300C, Việt Nam nước thuộc khu vực nhiệt đới nên mức nhiệt độ thí nghiệm điều chỉnh cao Ngồi ra, đối tượng thí nghiệm hai nghiên cứu khác (nghêu Bến Tre Meretrix lyrata nghêu Ruditapes philippinarum) Theo Casas
và ctv (2002), nhiệt độ yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến trình hình thành bào tử nghỉ phát sinh bào tử động Ở nhiệt độ cao, trình hình thành bào tử nghỉ phát sinh bào tử động diễn thuận lợi Tuy nhiên, theo kết nghiên cứu Dungan Hamilton (1995) cho thấy nhiệt độ 400C nhiệt độ gây chết kí sinh trùng Perkinsus marinus Kết từ nghiên cứu mức nhiệt độ 400C, không quan sát thấy bào tử nghỉ sau 1, 2, 4, 7, 14 cho thấy trùng khớp với kết Dungan Hamilton (1995) [9] Ngoài ra, thông báo từ khảo sát Park Choi (2001), Chu ctv (1994), cho thấy nhiệt độ yếu tố định mức độ nhạy cảm sò Manila hàu Crassotrea virginica Perkinsus [8, 15].
Hình Bào tử nghỉ kí sinh trùng Perkinsus sp.
2 Ảnh hưởng độ mặn lên hình thành bào tử nghỉ Perkinsus
Kết thí nghiệm ảnh hưởng độ mặn lên q trình biến thái kí sinh trùng
(6)Ở độ mặn từ 15‰ trở lên trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ xảy nhanh, bào tử nghỉ phát sau 1, ngày ủ Trong đó, độ mặn từ đến 10‰ bào tử nghỉ hình thành chậm từ sau đến ngày ủ Như vậy, thấy độ mặn 15‰ độ mặn thích hợp cho trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ kí sinh trùng Perkinsus
Kết nghiên cứu trùng hợp với số nghiên cứu tác giả khác Leet-hochavalit ctv (2004) thơng báo độ mặn giảm nguyên nhân làm cho tỷ lệ nhiễm Perkinsus thấp vào tháng (66,6%) so sánh với tháng khác năm Theo Burreson Calvo (1996), độ mặn cao làm tăng khả gây bệnh kí sinh trùng Perkinsus giảm khả phòng bệnh tế bào vật chủ Tỷ lệ nhiễm cường độ cảm nhiễm Perkinsus marinus vịnh Chesapeak tăng độ mặn tăng cao hạn hán năm [5] Powell ctv (1992) báo cáo tỷ lệ nhiễm kí sinh trùng P marinus biến động theo mùa vịnh Mexico phần thay đổi độ mặn nguồn nước đầu vào [14] Mức độ cảm nhiễm cao P marinus hàu C virginica phía Bắc vịnh mùa hè độ mặn cao nhiệt độ nước biển mùa hạn hán, mức độ cảm nhiễm thấp mùa lũ lụt Park ctv (2006) báo cáo cường độ cảm nhiễm P olseni thấp vào mùa hè vịnh Gomso, thuộc biển phía tây Hàn Quốc,
mức độ nhiễm kí sinh trùng thấp ngun nhân độ mặn thấp mưa lớn cung cấp lượng nước lớn cho khu vực ven biển [11] Trong phía đông bắc châu Á (bao gồm Hàn Quốc, Trung Quốc Nhật Bản) từ cuối tháng sáu đến cuối tháng bảy mùa gió mùa, đó, dọc theo bờ biển bán đảo Hàn Quốc độ mặn giảm vào mùa hè Ford Smolowitz (2007) báo cáo tỷ lệ nhiễm Perkinsus spp giảm hàu C virginica mùa đông lạnh lượng mưa cao theo bờ đông bắc Mỹ Họ báo cáo tỷ lệ nhiễm Perkinsus spp cao vào mùa thu với tỷ lệ nhiễm thấp vào tháng tháng 5, kéo dài đến tháng 8, tăng cao trở lại [10] Ngoài ra, theo khảo sát Park Choi (2001) cho thấy độ mặn ảnh hưởng đến mật độ Perkinsus tỷ lệ xảy bệnh sò Manila [13] Nghiên cứu Chu ctv (1994), cho thấy độ mặn yếu tố định mức độ nhạy cảm hàu Crassotrea virginica Perkinsus [8]
IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Ký sinh trùng Perkinsus spp có thể biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ khoảng nhiệt độ nước từ 20-350C Trong đó, nhiệt độ 30-350C xem khoảng nhiệt độ tối ưu cho trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ thời gian biến thái xảy nhanh (sau ngày ủ) Còn 200C trình biến thái diễn chậm (sau ngày ủ) Qua thí nghiệm ảnh hưởng độ mặn lên hình thành bào tử nghỉ từ mức độ mặn khác Bào tử nghỉ xuất tất mức độ mặn, kể mức 0‰ (Bảng 2)
Bảng Ngày xuất bào tử nghỉ ảnh hưởng độ mặn
Ngày Độ mặn (‰)
0 3 5 10 15 20 25 30
1 - - - - + - +
-2 - - - - NK + NK +
4 + - + + NK NK NK NK
7 NK + NK NK NK NK NK NK
14 NK NK NK NK NK NK NK NK
(7)thể dinh dưỡng ký sinh trùng Perkinsus cho thấy lồi rộng muối bào tử nghỉ phát tất nghiệm thức độ mặn khác nhau, kể mức 0‰ Tuy nhiên, trình hình thành bào tử nghỉ diễn nhanh mức độ mặn >15‰ (xuất bào tử nghỉ 1, ngày đầu ủ) Trong từ độ mặn <10‰ trình biến thái diễn chậm (sau 4-7 ngày ủ)
Từ kết nghiên cứu kết luận nhiệt độ độ mặn có ảnh hưởng
tới q trình biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ kí sinh trùng Perkinsus sp Kết dùng làm sở cho việc nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ mặn tới giai đoạn biến thái kí sinh trùng Perkinsus Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường khác pH, Oxy lên biến thái ký sinh trùng Perkinsus biện pháp phòng trị bệnh điều kiện thí nghiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1 Lê Thành Cường, Trần Vĩ Hích, 2013 Bước đầu khảo sát số tác nhân sinh học mẫu tu hài Lutraria
rhynchaena, Jonas 1844 bị bệnh thối vịi ni huyện Vân Đồn tỉnh Quảng Ninh Kỷ yếu hội thảo khoa học Khoa Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang Tháng 03-2013
2 Nguyễn Văn Hảo, Ngô Thị Ngọc Thủy, Tiêu Thanh Tươi, Hoàng Thị Hiền, Phạm Lâm Chính Văn, Nguyễn Vy
Vân, 2011 Sự diện Perkinsus sp nghêu (Meretrix lyrata) vùng biển Cần Giờ - Tp Hồ Chí
Minh Kỷ yếu Hội nghị Khoa học thủy sản toàn quốc lần thứ IV, ngày 16/12/2011 Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM
3 Ngô Thị Thu Thảo, 2008 Một số đặc điểm ký sinh trùng Perkinsus sp lây nhiễm nghêu lụa (Paphia
undulate) ở Kiên Giang Bà Rịa Tạp chí Khoa học 2008 (1): 222-230 Trường Đại học Cần Thơ
4 Ngô Thị Ngọc Thủy, 2011 Điều tra, nghiên cứu bệnh số đối tường nhuyễn thể nuôi vùng ven biển Việt Nam Báo cáo tổng hợp chương trình khoa học cơng nghệ Bộ Khoa học Công nghệ
Tiếng Anh
5 Burreson E M., Ragone Calvo L M., 1996 Epizootiology of Perkinsus marinus disease of oysters in
Chesapeake Bay, with emphasis on data since 1985 J Shellfi sh Res., 15:17-34
6 Casas S M., Villalba A., Reece K S., 2002 Study of perkinsosis in the carpet shell clam Tapes decussatus in
Galicia (NW Spain) I Identifi cation of the aetiological agent and in vitro modulation of zoosporulation by temperature and salinity Dis Aquat Org., 50:51-65
7 Choi K S., Wilson E A., Lewis D H., Powell E N., Ray S M., 1989 The energetic cost of Perkinsus marinus
parasitism in oysters: quantifi cation of the thioglycollate method J Shellfi sh Res., 8:125–131
8 Chu F L E., Hale R C., 1994 Relationship between pollution and susceptibility to infectious diseases in the
eastern oyster, Crassostrea virginica Mar Environ Res., 38:243-256
9 Dungan C F., Hamilton R M., 1995 Use of a tetrazolium-based cell proliferation assay to measure effects of in
(8)10 Ford S E., Smolowitz R Infection dynamics of an oyster parasite in its newly expanded range Mar Biol 2007, 151:119–133
11 Park K I., Figueras A., Choi K S., 2006 Application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the study of reproduction of the Manila clam Ruditapes philippinarum (Mollusca: Bivalvia): II Impacts of
Perkinsus olseni on clam reproduction Aquaculture, 251:182-191
12 Kyung Il., Park H J K., Lee Y S., Choi K S., 2009 Ecological, morphological and expressed sequence tag (EST) studies of perkinsus olseni, parasitic protozoa in the manila clam Ruditapes philippinarum occurring on the coastal yellow sea of Korea in The 3rd Regional Mariculture conference Wendeng, China
13 Park K I., Choi K S., 2001 Spatial distribution of the protozoan parasite Perkinsus sp found in the Manila
clams, Ruditapes philippinarum, in Korea Aquaculture, 203:9-22
14 Powell E N., Gauthier J D., Wilson E N., Nelson A., Fay R R., Brooks J M., 1992 Oyster disease and climate change Are yearly changes in Perkinsus marinus parasitism in oysters (Crassostrea virginica) controlled by climatic cycles in the Gulf of Mexico P.S.Z.N.I Marine Ecology, 13:243-270
15 Ray S M., 1952 A culture technique for the diagnosis of infection with Dermocystidium marinum Mackin, Owen and Collier in oysters Science, 116:360-361
16 Leethochavalit S., Chalermwat K., Upatham E S., Choi K S., Sawangwong P., Kruatrachue M., 2004
Occurrence of Perkinsus sp. in Undalated surf clams Paphia undulata from the Gulf of Thailand Dis Aquat
Org 60: 165–171