Bài viết tiến hành nghiên cứu mối liên quan giữa các gen mã hóa thụ thể vitamin D với tính cảm nhiễm HBV và tiến triển bệnh ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính. Ngoài ra nghiên cứu này khảo sát mối tương quan giữa các biến thể VDR với nồng độ vitamin D huyết thanh ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.
Vol.14 - No4/2019 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Mối liên quan tính đa hình gen mã hoá thụ thể vitamin D biểu lâm sàng bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính Association of vitamin D receptor variants with clinical outcomes in chronic hepatitis B patients Nguyễn Khuyến*,****, Nghiêm Xuân Hoàn**,****, Nguyễn Đăng Mạnh**, Phạm Thị Minh Huyền**, Đỗ Tuấn Anh***, Lê Hữu Song** *Bệnh viện Đa khoa Đức Giang, **Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, ***Bệnh viện Quân y 103, ****Đồng tác giả Tóm tắt Mục tiêu: Nghiên cứu mối liên quan gen mã hóa thụ thể vitamin D với tính cảm nhiễm HBV tiến triển bệnh bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Ngồi nghiên cứu khảo sát mối tương quan biến thể VDR với nồng độ vitamin D huyết bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu bệnh chứng tiến hành 298 bệnh nhân [viêm gan mạn tính, CHB (n = 104), xơ gan, LC (n = 89), ung thư gan, HCC (n = 105) 52 người khỏe mạnh (HC) Kỹ thuật ARMS-PCR sử dụng để định kiểu gen biến thể VDR Kết quả: Tần suất kiểu gen ApaI rs7975232 GT allele T thấp có ý nghĩa thống kê so với nhóm người khoẻ mạnh [OR = 0,3 (0,1 - 0,6), p=0,006 OR = 0,7 (0,5 - 0,98), p=0,048] Kiểu gen VDR-AapI rs7975232 TT liên quan có ý nghĩa với q trình tiến triển bệnh (HCC vs CHB: OR = 3,7 (1,1 - 13,5), p=0,04) Cả hai biến thể VDR ApaI FokI có liên quan với nồng độ vitamin D huyết bệnh nhân bị nhiễm HBV Kết luận: Sự liên quan có ý nghĩa biến thể VDR ApaI (rs7975232) với tính nhạy cảm với nhiễm HBV hậu lâm sàng bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Ngồi ra, biến thể ApaI FokI yếu tố di truyền vật chủ giúp đánh giá thiếu hụt nộng độ vitamin D bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Từ khóa: VDR, thiếu hụt vitamin D, nhiễm HBV, bệnh gan mạn tính Summary Objective: This study is to investigate the association of VDR variants [TaqI (rs731236), FokI (rs10735810), ApaI (rs7975232) and BsmI (rs1544410)] with HBV susscetiblity and liver disease progression in chronic HBV infection This study also evaluates the relationship between these VDR variants and the serum vitamin D levels in HBV-infected patients Subject and method: This study is designed as a case-control study involved 298 patients [CHB (n = 104), LC (n = 89), HCC (n = 105)] and 52 healthy people (HC) VDR genotyping was performed by ARMS-PCR Result: The frequency of genotype ApaI rs7975232 GT and allele T was significantly lower in HBV infected patiens compared to HC [OR = 0.3 (0.1 - 0.6), p=0.006 and OR = 0.7 (0.5 - 0.98), Ngày nhận bài: 01/7/2019, ngày chấp nhận đăng: 10/7/2019 Người phản hồi: Nghiêm Xuân Hoàn, Email: nghiemxuanhoan@gmail.com - Bệnh viện TWQĐ 108 98 TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Tập 14 - Số 4/2019 p=0.048] VDR-AapI rs7975232 TT was significantly associated with liver disease progression [HCC vs CHB: OR = 3.7 (1.1 - 13.5), p=0.041] Both VDR variants ApaI and FokI were associated with vitamin D levels in the serum in HBV infected patients Conclusion: The significant association of VDR variant ApaI (rs7975232) with the susceptibility to HBV infection and the clinical outcomes of HBV infected patients Additionally, ApaI and FokI variant may be a genetic factor supporting the valuation of vitamin D levels in HBV infected patients Keywords: VDR, vitamin D deficiency, HBV infection, chronic liver disease Đặt vấn đề Nhiễm HBV nguyên nhân hàng đầu dẫn đến biến chứng nguy hiểm đe dọa đến sống tính mạng người bị nhiễm bao gồm viêm gan cấp bùng phát, xơ gan ung thư gan HBV vi rút không gây tổn thương trực tiếp tế bào gan Người ta cho hậu tiến triển lâm sàng bệnh nhân nhiễm HBV xác định mối tương tác đáp ứng miễn dịch vật chủ vi rút [1] Trong yếu tố di truyền vật chủ có vai trị quan trọng tiến triển viêm gan mạn tính, bao gồm biến thể di truyền gen mã hoá thụ thể vitamin D [1], [2] Vitamin D đóng vai trị quan trọng việc điều phối hệ thống chuyển hóa xương, bên cạnh cịn có ý nghĩa lớn việc điều biến đáp ứng miễn dịch bẩm sinh miễn dịch thích nghi thơng qua thụ thể vitamin D (vitamin D receptor VDR) VDR thuộc họ thụ thể nhân yếu tố phiên mã Thụ thể biểu nhiều loại tế bào khác bao gồm tế bào miễn dịch (tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào miễn dịch hình sao, tế bào T B) 36 loại nhu mô khác [3] Các nghiên cứu gần cho thấy thiếu hụt vitamin D yếu tố nguy phát sinh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh tự miễn bệnh lý truyền nhiễm bao gồm viêm gan B mạn tính [4] chức vitamin D thông qua thụ thể VDR liên quan đến nhiều trình sinh bệnh học bao gồm tăng sinh, biệt hoá tế bào có liên quan đến q trình phát sinh ung thư bao gồm ung thư gan (HCC) Nhiều nghiên cứu cho thấy tính đa hình điểm đơn nucleotid (SNP) VDR có liên quan đến nguy cảm nhiễm, tiến triển bệnh nhiều bệnh lý truyền nhiễm rối loạn chuyển hố bao gồm béo phì đái tháo đường, bệnh lý tự miễn, bệnh lao phổi viêm gan vi rút nhiễm HBV hay HCV Phần lớn nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu tính đa hình điểm đơn nucleotid biến thể: TaqI (rs731236), FokI (rs10735810), ApaI (rs7975232) BsmI (rs1544410) Trên đối tượng bệnh nhân nhiễm HBV, kết nghiên cứu biến thể VDR chưa thống chưa có nghiên cứu cơng bố đối tượng người nhiễm HBV mạn tính Việt Nam Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV cao dao động khoảng từ 10 - 20% Bệnh lý viêm gan mạn tính biến chứng nhiễm HBV dự đoán gánh nặng y tế cộng đồng đáng quan tâm chí nhiều thập kỉ Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm mục tiêu: Khảo sát mối liên quan tính đa hình gen mã hố thụ thể vitamin D biểu lâm sàng bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính, đánh giá mối liên quan tính đa hình VDR thiếu hụt vitamin D bệnh nhân nhiễm HBV bao gồm viêm gan B mạn tính (CHB), xơ gan (LC) ung thư gan (HCC) Đối tượng phương pháp 2.1 Đối tượng Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu bệnhchứng Nghiên cứu tiến hành 298 bệnh nhân bị nhiễm HBV phân loại thành nhóm dựa theo tiêu chuẩn lâm sàng bao gồm CHB (n = 104), LC (n = 89), HCC (n = 105) Ngoài ra, 52 người khỏe mạnh (HC) đưa vào nghiên cứu làm nhóm chứng 99 Vol.14 - No4/2019 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Thời gian địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ tháng 10/2013 đến tháng 10/2015 2.3 Xử lý số liệu 2.2 Phương pháp Kỹ thuật ARMS-PCR sử dụng để xác định kiểu gen biến thể VDR Nồng độ vitamin D toàn huyết định lượng phương pháp ELISA Trong nghiên cứu phân loại thiếu hụt vitamin D sau: Nồng độ vitamin D bình thường (≥ 30ng/ml), thiếu vitamin D mức độ vừa (20 - 29,9ng/ml), thiếu vitamin D mức độ nặng (10 - 19,9mg/ml), thiếu vitamin D mức độ nặng (< 10ng/ml) Số liệu xử lý phần mềm R Chisquare test sử dụng để so sánh tỷ lệ nhóm Kruskal-Wallis test Mann-WhitneyWilcoxon test sử dụng để so sánh nhóm cho biến liên tục Ngồi ra, chúng tơi sử dụng mơ hình random forest (random forest model) để xác định tính quan trọng yếu tố tiên lượng bao gồm biến thể VDR thiếu hụt vitamin D bệnh nhân viêm gan B mạn tính Tất so sánh có ý nghĩa thống kê p0,05 (6,9) (6,6) (4,3) (0,18 - 2,26) 1 (1) NA NA (1,3) 0,7 (0,4 - 0,9) 0,039 0,8 (0,5 - 1,1) 0,059 0,82 (0,14 - 4,72) >0,05 NA NA 0,7 0,048 (0,5 - 0,98) 0,7 0,5 >0,05 >0,05 (0,1 - 5,44) (0 ,16 - 1,76) NA NA NA NA Allele C T FokI (rs1073 CC 5810 C>T) TC TT 95 (95) (5) 15 (30,6) 24 (49) 10 (20,4) 193 145 184 (95,5) (95,4) (97,9) 0,85 >0,05 (4,5) (4,6) (2,1) (0,25 - 3,31) 28 (28) 53 (53) 19 (19) 0,88 (0,23 - 3,60) >0,05 0,41 >0,05 (0,08 - 1,93) >0,05 12 23 1 1 (15,6) (25) 47 53 1,06 2,07 2,18 1,31 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 (61) (57,6) (0,45 - 2,46) (0,59 - 7,22) (0,61 - 7,87) (0,58 - 2,96) 18 16 0,84 0,83 0,56 0,84 >0,05 >0,05 > 0,05 >0,05 (23,4) (17,4) (0,3 - 2,4) (0,19 - 3,65) (0,12-2,67) (0,31 - 2,29) Allele C T 54 109 71 99 (55,1) (54,5) (46,1) (53,8) 44 91 83 85 1,01 >0,05 1,20 >0,05 1,03 >0,05 1,07 >0,05 101 Vol.14 - No4/2019 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY (44,9) (45,5) (53,9) (46,2) (0,64 - 1,61) TaqI rs7312 36 T>C TT TC CC Allele T C 44 97 (93,6) (93,3) (6,4) (6,7) 0 81 (91) (9) 84 (87,5) 12 1,15 >0,05 (12,5) (0,27 - 4,95) NA NA 51 201 170 180 (94,4) (96,6) (95,5) (93,7) 12 0,61 >0,05 (5,6) (3,4) (4,5) (6,3) (0,13 - 3,76) (0,75-1,93) (0,65 - 1,64) (0,72 - 1,62) 1 2,91 (0,38 - 22,3) NA 1,79 1,41 >0,05 >0,05 (0,22 - 14,36) (0,36 - 5,69) NA NA NA NA NA >0,05 1 0,81 (0,19 - 4,90) >0,05 1,12 0,84 >0,05 >0,05 (0,29 - 6,43) (0,25 - 4,47) Nhận xét: Trong SNP khảo sát bao gồm ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), FokI (rs10735810) ApaI (rs7975232), kết phân tích cho thấy có SNP ApaIcho kết có ý nghĩa thơng kê so sánh tần suất genotype allele nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính nhóm người khoẻ mạnh Tần suất genotype GT allele T thấp có ý nghĩa nhóm bênh nhân viêm gan B mạn tính so với nhóm người khoẻ mạnh [OR = 0,3 (0,1 - 0,6), p=0,006 OR = 0,7 (0,5 - 0,98), p=0,048] Kết phân tích genotype GT allele T biến thể ApaI (rs7975232) có liên quan đến giảm tính cảm nhiễm HBV Bảng Mối tương quan biến thể VDR tiến triển lâm sàng bênh nhân viêm gan B mạn tính ApaI rs7975232 G>T GG GT TT CHB n (%) 45 (44,1) 52 (51) (4,9) LC HCC n (%) n (%) 41 39 (50,6) (44,8) 32 36 (39,5) (41,4) 12 (9,9) (13,8) 142 (69,6) 62 (30,4) 93 (92,1) (6,9) (1) 114 (70,4) 48 (29,6) 70 (92,1) (6,6) (1,3) 114 (65,5) 60 (34,5) 90 (95,7) (4,3) 193 (95,5) (4,5) 28 (28) 53 (53) 19 (19) 145 (95,4) (4,6) 12 (15,6) 47 (61) 18 (23,4) 184 (97,9) (2,1) 23 (25) 53 (57,6) 16 (17,4) LC vs CHB OR; 95% CI p 0,9 (0,5 - 1,8) 2,1 (0,6 - 8,6) HCC vs CHB OR; 95% CI p OR; 95% CI >0,05 >0,05 0,7 (0,4 - 1,5) 3,7 (1,1 - 13,5) HCC vs LC p >0,05 0,041 1,3 (0,7 - 2,4) 1,6 (0,6 - 4,8) >0,05 >0,05 Allele G T BsmI rs1544410 C>T CC TC TT 1,0 (0,6 - 1,6) >0,05 1,2 (0,7 - 1,9) >0,05 1,3 (0,8 - 2,0) >0,05 0,9 (0,3 - 3,2) >0,05 0,5 (0,1 - 1,9) >0,05 0,6 (0,2 - 2,1) >0,05 NA NA NA NA NA NA Allele C T FokI (rs10735810 C>T) CC TC TT Allele 102 1,0 (0,3 - 3,2) >0,05 1,8 (0,7 - 4,3) 2,0 (0,7 - 5,7) 0,5 (0,1 - 1,7) >0,05 >0,05 >0,05 1,4 (0,6 - 3,0) 0,8 (0,3 - 2,2) 0,4 (0,08 - 1,8) >0,05 >0,05 >0,05 0,5 (0,2, - 1,387) 0,4 (0,2 - 1,3) >0,05 >0,05 TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 C T TaqI rs731236 T>C TT TC CC Allele T C Tập 14 - Số 4/2019 109 (54,5) 91 (45,5) 97 (93,3) (6,7) 71 (46,1) 83 (53,9) 81 (91) (9) 99 (53,8) 85 (46,2) 84 (87,5) 12 (12,5) 201 (96,6) (3,4) 170 (95,5) (4,5) 180 (93,7) 12 (6,3) 1,4 (0,9 - 2,2) >0,05 1,5 (0,4 - 4,95) NA >0,05 >0,05 NA 1,4 (0,4 - 4,5) 1,0 (0,7 - 1,6) 1,3 (0,4 - 4,2) NA 1,9 (0,7 - 5,9) >0,05 >0,05 NA >0,05 0,7 (0,5 - 1,2) 1,5 (0,5 - 4,1) NA >0,05 NA >0,05 1,4 (0,5 - 4,1) >0,05 Nhận xét: Trong biến thể khảo sát bao gồm ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), FokI (rs10735810) TaqI (rs731236), kết phân tích cho thấy có SNP ApaI cho kết có ý nghĩa thống kê so sánh tần suất genotype nhóm bệnh nhân HCC nhóm bệnh nhân CHB Tần suất genotype TT cao có ý nghĩa nhóm bênh nhân HCC so với nhóm CHB [OR = 3,7 (1,1 13,5), p=0,041] Kết phân tích cho biết genotype TT biến thể ApaI (rs7975232) yếu tố nguy đóng góp vào q trình tiến triển bệnh phát sinh ung thư gan bệnh nhân viêm gan B mạn tính 3.3 Mối tương quan biến thể VDR nồng độ vitamin D bệnh nhân viêm gan B người khoẻ mạnh 103 Vol.14 - No4/2019 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY A B C D Hình Sự phân bố nồng độ vitamin D genotype biến thể VDR bệnh nhân viêm gan B người khoẻ mạnh Nhận xét: Biến thể VDR ApaI (rs7975232) (Hình 1A): Nồng độ vitamin D người mang genotype TT thấp có ý nghĩa so với người mang genotype GG hay TG tất nhóm nghiên cứu bao gồm HC, CHB, LC HCC Biến thể VDR FokI (rs10735810) (Hình 1C): Nồng độ vitamin D người mang genotype TT thấp có ý nghĩa so với người mang genotype CC TC nhóm HCC Khơng có khác biệt nhóm nghiên cứu khác Khơng có khác biệt nồng độ vitamin D genotype nhóm bệnh nhân người khoẻ mạnh biến thể lại BsmI (rs1544410) TaqI (rs731236) (Hình 1B 1D) 104 TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Tập 14 - Số 4/2019 ApaI (rs7975232 G>T) Nồng độ men gan (IU/L) 10000 * * * * 1000 100 10 TG GG GG TT TG TT ALT AST Hình Mối tương quan biến thể VDRA paI thông số cận lâm sàng Nhận xét: Biến thể VDR ApaI (rs7975232): Nồng độ men gan tăng có ý nghĩa bệnh nhân mang genotype TG so với genotype GG TT Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê phân tích cho số cận lâm sàng khác bao gồm nồng độ bilirubin, albumin, tỷ lệ prothrombin, số lượng tế bào tiểu cầu, tải lượng HBV DNA (dữ liệu không trình bày) Biến thể BsmI (rs1544410), FokI (rs10735810) TaqI (rs731236): Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê phân tích cho tất số cận lâm sàng bao gồm nồng độ men gan AST ALT, bilirubin, albumin, tỷ lệ prothrombin, số lượng tế bào tiểu cầu, tải lượng HBV DNA (dữ liệu không trình bày) A no_of_nodes age ApaI FokI TaqI gender BsmI 4000 2000 B 6000 C FokI BsmI age ApaI ApaI FokI Age TaqI TaqI gender Sex Occurrences BsmI 200 100 200 300 400 250 300 350 400 450 500 105 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.14 - No4/2019 Hình Tầm quan trọng biến tiên lượng thiếu hụt vitamin D bệnh nhân viêm gan B mạn tính random forest model Nhận xét: Random forest model đánh giá tính quan biến tiên lượng thiếu hụt nồng độ vitamin D (bình thường ≥ 30ng/ml, thiếu hụt < 30ng/ml) Trong mơ hình bao gồm biến tiên lượng: Các biến thể VDR, tuổi (age) giới (sex) Trong tuổi biến có mối liên quan có ý nghĩa với thiếu hụt vitamin D Trong biến thể VDR, mơ hình cho kết tương tự phân tích đơn biến trình bày Hình Chúng ta thấy ApaI FokI biến xuất nhiều định [thể số no-of-nodes (Hình A); no-of-trees (Hình C) chiều sâu định kết phân loại, sau nhiều lần phân nhánh (Hình B) Bàn luận Vitamin D coi loại hormone đóng vai trị quan trọng không chế trao đổi calcium chế điều hịa cân chuyển hóa hệ thống xương mà cịn có nhiều ảnh hưởng điều hịa hệ miễn dịch thể [3] Vai trò sinh lý vitamin D thể biểu thơng qua VDR VDR đóng vai trị quan trọng nhiều bệnh lý truyền nhiễm, tự miễn, ung thư Trong nghiên cứu này, nghiên cứu mối liên quan biến thể di truyền thụ thể vitamin D bệnh cảnh lâm sàng bệnh nhân viêm gan B mạn tính Hơn chúng tơi khảo sát mối liên quan biến thể VDR thiếu hụt vitamin D mối liên quan đến tiến triển lâm sàng bệnh nhân viêm gan B mạn tính Gen mã hố thụ thể VDR nằm nhiễm sắc thể số 12 bao gồm 11 exon Exon 1A, 1B 1C tạo nên vùng 5’ không mã hoá exon (Exon 2-9) mã hoá thành phần cấu trúc VDR Biến thể TaqI nằm vùng exon 9, biến thể ApaI BsmI nằm vị trí intron Tính đa hình vị trí khơng ảnh hưởng đến chức tổng hợp biểu protein gen VDR Chỉ có biến thể FokI nằm vị trí exon đầu cuối 5’ cho có ảnh hưởng đến 106 thay đổi cấu trúc hoạt động phiên mã VDR Hoạt động phiên mã VDR người mang allele T (Biến thể: FokI rs10735810) thấp so với dạng không mang allele đột biến (Allele C) [5] Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ vitamin D bệnh nhân ung thư genotype FokI rs10735810 TT thấp có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân ung thư gan mang genotype CC CT Các nghiên cứu mối tương quan biến thể VDR nguy nhiễm HBV cho kết không thống [6], [7] Gần phân tích tổng hợp (Meta analysis) phân tích 15 nghiên cứu mối tương quan biến thể di truyền VDR tính cảm nhiễm HBV bệnh cảnh lâm sàng bệnh nhân nhiễm HBV quần thể khác [7] Trong nghiên cứu này, 4218 bệnh nhân nhiễm HBV 2298 người khoẻ mạnh phân tích Kết phân tích cho thấy genotype FokI rs10735810 CC allele C cho yếu tố nguy nhiễm HBV [OR = 1,54 (1,2 - 2,0), p