Bài viết tiến hành nghiên cứu trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh góp phần nâng cao giá trị dược liệu, kinh tế từ loài nấm này. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
No.17_Aug 2020|Số 17 – Tháng năm 2020|p.20-25 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TRÍCH LY POLYSACCHARIDES TỪ NẤM LIM XANH (GANODERMA LUCIDIUM) Lưu Hồng Sơn1*, Tạ Thị Lượng1,2, Vi Đại Lâm1, Nguyễn Thị Tình1, Đinh Thị Kim Hoa1, Trịnh Thị Chung1, Huỳnh Thị Thiệp1 Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên Đại học Queensland Email: luuhongson@tuaf.edu.vn Thơng tin viết Tóm tắt Nấm Lim xanh (Ganoderma lucidium) thuộc họ nấm gỗ mọc thân Ngày nhận bài: Lim xanh (Erythrophleum fordii) chết Nấm Lim xanh khẳng định 11/5/2020 Ngày duyệt đăng: loại dược liệu có ích cho sức khỏe người dùng làm thuốc từ lâu đời Đa số sản phẩm từ nấm Lim xanh thông dụng thị trường 12/8/2020 Việt Nam chủ yếu nấm thể khô tai nấm khơ cắt lát, có sản phẩm chế biến tiện dụng Trong nghiên cứu nấm Lim xanh ni cấy Từ khóa: phịng ni cấy mơ Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, nấm Lim xanh; quy trình; Trường Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên Nghiên cứu trích xác định điều kiện để trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh nuôi cấy ly; polysaccharide; là: thời gian xử lý sóng siêu âm phút, hàm lượng polysaccharide đạt 4,26 thông số mg/g; nồng độ ethanol 80 %, hàm lượng polysaccharide đạt 4,81 mg/g; tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 (g/ml), hàm lượng polysaccharide đạt 4,98 mg/g; thời gian trích ly 90 phút, hàm lượng polysaccharide đạt 5,32 mg/g; nhiệt độ 80 oC, hàm lượng polysaccharide đạt 5,83 mg/g MỞ ĐẦU Lim xanh thuộc nhóm nấm lớn đa dạng Lim xanh Nấm Lim xanh có hàm lượng polysaccharide chủng loại Từ xác lập thành chi riêng, cao đánh giá chất lượng tốt [2, 6] Ganoderma Karst (1881), đến có 200 lồi Năm 1976 polysaccharide tách chiết Nhật ghi nhận [1, 5] Cho đến xác định sáng chế dùng để điều trị ung thư [7] 90 nguyên tố hóa học nấm Lim xanh Hai Năm 2018, Didem Sohretoglu and Shile Huang cho nhóm hợp chất hóa học quan tâm thấy polysaccharide trích ly từ nấm Linh xanh kháng polysaccharide tế bào ung thư [9] Chính việc nghiên cứu trích polysaccharide chứa hàm lượng cao nhất, chiếm từ 50 ly polysaccharide từ nấm Lim xanh góp phần nâng cao - 60 %, hợp chất định chất lượng nấm giá trị dược liệu, kinh tế từ loài nấm triterpenoide, L.H.Son et al/ No.17_Aug 2020|p.20-25 THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu Hình Nấm Lim xanh (Ganoderma lucidium) nuôi trồng Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Đối tượng nghiên cứu thể nấm Lim xanh phân lập, ni cấy sau tháng phịng nuôi cấy mô Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun 2.2 Dung mơi, hóa chất, thiết bị Thiết bị: Máy đo quang phổ, tủ sấy, cân điện tử, máy soxlet, tủ cấy, tủ ấm, bể ổn nhiệt, bể siêu âm Dung môi: C2H5OH tinh khiết - Việt Nam 2.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm tới hiệu trích ly polysaccharide nấm Lim xanh Tiến hành khảo sát mốc thời gian: 0, 2, phút Dựa sở thí nghiệm bố trí sau: Elmasonic S100/H, 9,5 lít - Đức S 100 H - Đức Cơng thức Thời gian xử lý sóng siêu âm (phút), Cường độ sóng âm: 100 dB CT1 Khối lượng mẫu: 10g CT2 Dung mơi ethanol 70 % CT3 CT4 Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô lần lọc Yếu tố cố định Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/15 (g/ml) Nhiệu độ: 70 oC Thời gian: 60 phút Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung qua giấy lọc tinh lần Mỗi công thức lặp lại lần Tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide, từ mơi trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh lựa chọn công thức tối ưu cao hiệu chiết xuất hợp chất Tiến hành khảo sát nồng độ ethanol sau: 60, 70, 80, 90 96 % sau: Công thức Việc lựa chọn nồng độ dung mơi thích hợp nâng Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định Nồng độ dung môi ethanol (%) CT1 60 Khối lượng mẫu: 10g CT2 70 Nhiệt độ: 70 oC CT3 80 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/15 (g/ml) CT4 90 Thời gian: 60 phút CT5 96 Thời gian xử lý sóng siêu âm lựa chọn thí nghiệm L.H.Son et al/ No.17_Aug 2020|p.20-25 Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô lần lọc qua giấy lọc tinh lần Mỗi công thức lặp lại lần Tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide, từ lựa chọn cơng thức tối ưu Thí nghiệm 3: Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu nấm Lim xanh với dung mơi trích ly Tiến hành khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) theo công thức: 1/10, 1/15, 1/20 1/25 Yếu tố thay đổi CT Yếu tố cố định (Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi) CT1 1/10 Khối lượng mẫu: 10g CT2 1/15 Nhiệu độ: 70 oC CT3 1/20 Thời gian xử lý sóng siêu âm lựa chọn thí nghiệm CT4 1/25 Nồng độ dung môi ethanol lựa chọn thí nghiệm Thời gian: 60 phút Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thơ lần lọc Thí nghiệm 4: Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích qua giấy lọc tinh lần Mỗi công thức lặp lại lần Tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide, từ ly polysaccharide từ nấm Lim xanh lựa chọn công thức tối ưu trình trích ly cho phí lượng dung môi Tiến hành khảo sát mức thời gian sau: 30, Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ tới 60, 90 120 phút điều kiện sau: Yếu tố thay đổi Công thức Thời gian trích ly (phút) CT1 30 Khối lượng mẫu: 10g CT2 60 Nhiệt độ: 70 oC CT3 90 Thời gian xử lý sóng siêu âm lựa chọn thí nghiệm CT4 120 Nồng độ dung mơi ethanol lựa chọn thí nghiệm Yếu tố cố định Tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi lựa chọn thí nghiệm Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô lần lọc phản ứng phát máy quang phổ bước qua giấy lọc tinh lần Mỗi công thức lặp lại lần sóng 490 nm Hàm lượng polysaccharide định Tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide, từ lượng dựa số đo OD thu mẫu thí nghiệm lựa chọn cơng thức tối ưu đối chiếu với đồ thị chuẩn glucose [4, 5, 8] 2.3 Phương pháp phân tích Phương pháp định lượng polysaccharide tổng sau trích ly Dịch chiết thu sau thí nghiệm 1, 2, 3, xác định hàm lượng polysaccharide theo phương pháp phenol - sunlfuric acid (Dubois et al., 1956) Lấy 400 µl dịch mẫu chứa polysaccharide cho tác dụng với 200 µl dung dịch phenol 5%, nhỏ thêm từ từ 1ml H2SO4 đậm đặc để 30 phút nhiệt độ phòng Màu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm tới hiệu trích ly polysaccharide nấm Lim xanh Sóng siêu âm có tác dụng bẻ gãy liên kết hóa học, phá vỡ tế bào, hỗ trợ khả trích ly chất có ngun liệu Polysaccharide chất mang hoạt tính sinh học quan trọng nấm Lim xanh xử lý sóng siêu âm nâng cao hiệu trích ly hợp chất nấm Lim xanh L.H.Son et al/ No.17_Aug 2020|p.20-25 Bảng Ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu trích ly polysaccharide nấm Lim xanh Thời gian xử lý (phút) Hàm lượng polysaccharides (mg/g) 2,90c 4,00ab 4,26a 4,21a (Chú thích: a, b, c: sai khác cơng thức xử lý thời điểm có ý nghĩa mức ý nghĩa α = 0,05) Qua bảng 1, cho thấy hàm lượng polysaccharide polysaccharide bị phá hủy đồng thời hợp chất tăng thời gian xử lý sóng siêu âm tăng Hàm lượng polysaccharide cao thời gian xử lý phút không mong muốn trích ly Chính chúng tơi định xử lý sóng siêu âm thời 4,26 mg/g, hàm lượng polysaccharide 4,00 mg/g thời gian xử lý phút, hàm lượng polysaccharide gian phút trước trích ly cho thí nghiệm thấp khơng xử lý sóng siêu âm 2,90 mg/g Ta thấy hàm lượng polysaccharide thời gian phút cao cường độ sóng âm cao tác động 3.2 Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung mơi trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh Ethanol dung mơi có khả hòa tan tốt vào nguyên liệu làm cho cấu trúc nguyên liệu bị phá vỡ, đồng thời nhiệt độ tăng theo cường độ Sử dụng ethanol nồng độ khác có hiệu q trình trích ly khác Thí nghiệm xác tăng tạo điều kiện thuận lợi cho trình trích ly diễn nhanh [10] Ở thời gian trích ly phút hàm định ảnh hưởng nồng độ dung mơi ethanol đến hiệu trích ly polysaccharide tiến hành lượng polysaccharide giảm nguyên nhân thời gian kéo dài, lượng lớn, nhiệt độ cao hoạt chất phần thí nghiệm Kết thu bảng 2: Bảng Ảnh hưởng nồng độ dung mơi ethanol đến hiệu trích ly polysaccharides nấm Lim xanh Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng polysaccharides (mg/g) 60 70 80 90 96 4,18b 4,25b 4,81a 4,82a 4,82a (Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác có khác mức ý nghĩa α = 0,05) Qua bảng ta thấy: Các nồng độ dung môi khác cho giá trị polysaccharide khác Hàm 3.3 Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu nấm Lim xanh/ dung mơi trích ly lượng polysaccharide tăng dần nồng độ tăng dần Lượng dung mơi nhiều hay ảnh hưởng đến từ 4,18 mg/g nồng độ 60% lên 4,82 mg/g nồng độ 96% Tuy nhiên hàm lượng polysaccharide từ nồng độ q trình trích ly chất nguyên liệu Nếu lượng dung môi đủ để thấm ướt nguyên ethanol 80% lên nồng độ 96% tăng khơng có sai khác Từ đó, chúng tơi lựa chọn nồng độ dung mơi liệu, hiệu suất trích ly thấp Ngược lại, lượng dung môi sử dụng nhiều gây hao phí ethanol trích ly tối ưu ethanol 80% sử dụng kết cho nghiên cứu sau dung mơi, nhiên liệu q trình lọc chi phí khác Vì việc tìm tỉ lệ ngun liệu/dung mơi cần thiết cho q trình trích ly, thu sản phẩm Bảng Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi ethanol (g/ml) đến hiệu trích ly polysaccharide nấm Lim xanh Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) Hàm lượng polysaccharides (mg/g) 1/10 1/15 1/20 1/25 3,30c 4,81b 4,98a 4,99a (Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác có khác mức ý nghĩa α = 0,05) L.H.Son et al/ No.17_Aug 2020|p.20-25 Qua bảng 3, ta thấy hàm lượng polyshaccharide Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tăng Để đảm bảo hiệu suất trích ly để tối thiểu chi phí sản trích ly chi phí lượng dung mơi Nếu thời gian trích ly ngắn, hoạt chất giải xuất chúng tơi lựa chọn tỉ lệ ngun liệu/dung mơi phóng ít, tăng thời gian trích ly làm (g/ml) 1/20 làm sở cho thí nghiệm tổn hao lượng, trình sản xuất kéo dài Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát mức thời gian kết 3.4 Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly ghi bảng 4: polysaccharides từ nấm Lim xanh Bảng Ảnh hưởng thời gian đến hiệu trích ly polysaccharides nấm Lim xanh Thời gian (phút) Hàm lượng polysaccharides (mg/g) 30 60 90 120 2,71c 4,98b 5,32a 5,29a (Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác có khác mức ý nghĩa α = 0,05) Qua bảng nhận thấy: thời gian trích ly dài trích ly kiệt hoạt chất có hủy Vì chúng tơi chọn thời gian trích ly 90 phút thời gian trích ly nấm Lim xanh nguyên liệu Tuy nhiên, đến thời gian trích ly 3.5 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ trích ly định lượng hoạt chất tăng lên chậm khơng hợp chất từ nấm Lim xanh Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng lớn tới tăng Khi trích ly thời gian 30 phút hàm lượng polysaccharide thu thấp 2,71 mg/g Hoạt trình trích ly Khi nhiệt độ trích ly cao làm cho độ xốp nguyên liệu tăng lên (do nguyên liệu chất tăng nhanh trích ly 60 phút, với hàm lượng trương nở), độ nhớt làm giảm hoạt chất hòa tan polysaccharide 4,98 mg/g, sau 90 phút trích ly, hàm dễ vào dung môi Tuy nhiên nhiệt độ yếu lượng polysaccharide thu cao 5,32 mg/g tố có giới hạn nhiệt độ q cao xảy nguyên liệu trích ly gần hết Ở thời gian lâu phản ứng không cần thiết tăng độ tan số 120 phút, hàm lượng polysaccharid thấp hàm tạp chất, khó khăn cho q trình lọc, thúc đẩy biến đổi hóa học làm chất lượng dịch chiết biến đổi khơng lượng polysaccharid trích ly polysaccharid phân có lợi làm tăng chi phí sản xuất Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly polysaccharide nấm Lim xanh Nhiệt độ (oC) 60 70 80 90 Hàm lượng 3,76c 5,32b 5,83a 5,79a polysaccharides (mg/g) (Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác có khác mức ý nghĩa α = 0,05) Theo bảng 5, nhiệt độ tăng giá trị polysaccharide tăng lên tỉ lệ với độ cao nhiệt độ Ở nhiệt độ 60 oC cho hàm lượng 3,76 mg/g, sau tăng lên 70 oC cho hàm lượng 5,32 mg/g Ở nhiệt độ 80 oC 90 oC hàm lượng 5,83 mg/g 5,79 mg/g Ở nhiệt độ 90 oC polysaccharide giảm bắt đầu bị phân hủy Vì lựa chọn nhiệt độ 80 oC nhiệt độ thích hợp cho trích ly hoạt chất nấm Lim xanh Kết luận Điều kiện trích ly thích hợp để thu hàm lượng polysaccharide xác định sau: thời gian xử lý sóng siêu âm phút, hàm lượng polysaccharide đạt 4,26 mg/g; nồng độ ethanol 80 %, hàm lượng polysaccharide đạt 4,81 mg/g, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 (g/ml), hàm lượng polysaccharide đạt 4,98 mg/g; thời gian trích ly 90 phút, hàm lượng polysaccharide đạt 5,32 mg/g; nhiệt độ 80 oC, hàm lượng polysaccharide đạt 5,83 mg/g Kết chúng tơi tìm điều kiện thích hợp để trích ly polysaccharide cho hàm lượng cao L.H.Son et al/ No.17_Aug 2020|p.20-25 Nguyen Lan Dung T echnology for growing TÀI LIỆU THAM KHẢO Le Xuan Tham Research on biological properties and mineral absorption ability in mushrooms Hanoi Agriculture, 2001 Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr) Karst, Ph.D thesis biofactory Phytochemistry 67 (18): 1985 - 2001, of Biology, Hanoi University of Science Vietnam National University, Hanoi, 1996 2006 Nguyen Duc Tien Research on technology to produce some supplements Ministry level project 1976; 6: 54-59 report, 2006 determination of sugars and related substances Anal Chem 28: 350- 356 Nguyen Thi Minh Tu Process to extract biological compounds from reishi Paterson RR, Ganoderma - a therapeutic fungal Kaibara et all, Japanese Journal of Surgery Dubois et all, Calorimetric method for mushroom Didem Sohretoglu and Shile Huang Ganoderma (Ganoderma lucidum) Journal of Science and Technology, Vol 47 (2009) 45 - 53 lucidum Polysaccharides as an anti-cancer agent, Anticancer Agents Med Chem 18(5): 2018 667-674 National Institute of Medicinal Materials, Methods to investigate effects of medicine from herbs 2006 10 Tran Huu Danh, Cleaning the super sound wave application, Journal of Science Can Tho University Episode 52, Part A (2017): 46-53 Research on the extraction of polysaccharides from mushroom ganoderma lucidum Luu Hong Son, Ta Thi Luong, Vi Dai Lam, Nguyen Thi Tinh, Dinh Thi Kim Hoa, Trinh Thi Chung, Huynh Thi Thiep Article info Recieved: 11/5/2020 Accepted: 12/8/2020 Abstract Ganoderma lucidum belongs to wood mushroom which grows on logs of died Erythrophleum fordii Reishi mushroom is useful for health and have been used for a long time In the market, reishi mushroom products are sold as fruiting bodies or drying slides These products are not handy for customers In this research, Ganoderma lucidum was cultivated in laboratory of Faculty of Biotechnology and Keywords: Ganoderma lucidum, process, extraction, polysaccharides, parameters Food Technology, Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry The factors to extract polysaccharides had been identified The polysaccharides concentration in the extraction with ultrasonic waves was 4,26 mg/g in minutes The suitable concentration of ethanol for extraction was 80% with 4,81 mg/g polysaccharides Ratio of material and solution was 1/20 (g/ml) with polysaccharides concentration as 4,98 mg/g; In extraction, polysaccharide concentration showed the result as 5,32 mg/g in 90 minutes and 5,83 mg/g at 80oC ... 3.4 Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly ghi bảng 4: polysaccharides từ nấm Lim xanh Bảng Ảnh hưởng thời gian đến hiệu trích ly polysaccharides nấm Lim xanh Thời gian (phút) Hàm lượng polysaccharides. .. thời gian trích ly dài trích ly kiệt hoạt chất có hủy Vì chúng tơi chọn thời gian trích ly 90 phút thời gian trích ly nấm Lim xanh nguyên liệu Tuy nhiên, đến thời gian trích ly 3.5 Nghiên cứu lựa... tế bào, hỗ trợ khả trích ly chất có ngun liệu Polysaccharide chất mang hoạt tính sinh học quan trọng nấm Lim xanh xử lý sóng siêu âm nâng cao hiệu trích ly hợp chất nấm Lim xanh L.H.Son et al/