Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu tối ưu hóa điều kiện thu nhận cao chiết và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm Cao dược liệu từ rễ cây mật và ứng dụng trong sản xuất trà thảo mộc. Điều kiện chiết tối ưu đã được xác định là nhiệt độ chiết là 100oC, thời gian là 199,2 phút và tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu là 22,4 : 1 (mL : g) cho hàm lượng 9,10-Dimethoxycanthin-6-one cao nhất là 14,39 mg/kg.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 10(119)/2020 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY MẬT NHÂN (Eurycoma longifolia) TRONG SẢN XUẤT TRÀ THẢO MỘC Võ Khánh Hà1, Trương hị Minh Hạnh2, Nguyễn hị Song Mơ2, Mai hị Phương Chi3, Giang hị Kim Liên4 TÓM TẮT Nghiên cứu thực với mục tiêu tối ưu hóa điều kiện thu nhận cao chiết xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm Cao dược liệu từ rễ mật ứng dụng sản xuất trà thảo mộc Điều kiện chiết tối ưu xác định nhiệt độ chiết 100oC, thời gian 199,2 phút tỷ lệ dung môi nguyên liệu 22,4 : (mL : g) cho hàm lượng 9,10-Dimethoxycanthin-6-one cao 14,39 mg/kg.Cao chiết đạt yêu cầu theo Dược điển Việt Nam tập V với có mặt có hợp chất có giá trị alkaloid, phenolic, steric Sử dụng cao dược liệu mật nhân để sản xuất trà thảo mộc, đánh giá cảm quan thị hiếu cho điểm sản phẩm với kết mức độ tương đối thích đến thích; sản phẩm có hàm lượng 9,10-Dimethoxycanthin-6-one khoảng 0,38 mg/L, sản phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định Bộ Y tế Từ khóa: Cao dược liệu, EL4 (9,10-Dimethoxycanthin-6-one), rễ mật nhân, tiêu chuẩn sở, trà thảo mộc I ĐẶT VẤN ĐỀ Cây mật nhân hay gọi bá bệnh, bách bệnh, có tên khoa học Eurycoma longifolia Jack thuộc họ hanh thất (Simaroubaceae), mọc phổ biến miền Trung Tây Ngun Cơng dụng mật nhân chữa nhiều bệnh vỏ dùng chữa bệnh tiêu hóa, đau mỏi lưng; dùng chữa lỵ; rễ chữa ngộ độc say rượu; dùng tắm ghẻ, lở ngứa (Đỗ Tất Lợi, 2006) Hợp chất có hoạt tính sinh học cao quan trọng mật nhân 9,10-Dimethoxycanthin-6-one (Nguyễn hị hanh Tâm ctv., 2014) Để ứng dụng cao chiết vào sản xuất thực phẩm, dung mơi trích ly nước thường sử dụng Tuy nhiên, vấn đề cần quan tâm làm để chiết xuất tối đa thành phần mật nhân, điều kiện chưng ninh nước, tỷ lệ nguyên liệu nước, thời gian chiết (Nguyễn Cảnh, 2016) yếu tố cần khảo sát Ngoài ra, để tăng cường cảm quan cải thiện chất lượng trà thảo mộc, bên cạnh thành phần cao mật nhân, thành phần bổ sung cần quan tâm Nụ vối có tác dụng kháng viêm (Nguyen hi Dung et al., 2009), kháng ung thư (Truong Tuyet Mai et al., 2010), tăng cường kích thích tiêu hóa (Huynh Nhu Tuan et al., 2019) Chính vậy, nghiên cứu sử dụng nụ vối làm thành phần cho sản phẩm trà thảo mộc mật nhân, bổ sung thảo dược có hậu vị cỏ ngọt, cam thảo, la hán để điều hòa vị đắng mật nhân Hơn nữa, thảo dược có tác dụng dược lý tốt cho sức khỏe chống tiểu đường, béo phì, cao huyết áp, giải nhiệt (Smitha and Umesha, 2019; Phạm hị Minh Hải ctv., 2019) II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Rễ mật nhân (khoảng từ 13 đến 15 năm tuổi) thu hái vùng đồi núi huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai Mẫu thực vật định danh Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Nụ vối, cỏ ngọt, la hán cam thảo khô mua nhà thuốc Đông y Đà Nẵng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Bố trí thí nghiệm a) Tối ưu hóa số yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận cao chiết từ trình chưng ninh nước (Nguyễn Cảnh, 2016) Mục đích: hiết lập điều kiện tối ưu thu nhận cao chiết mật nhân có hoạt tính sinh học cao sử dụng phương pháp chưng ninh nước Bố trí thí nghiệm: Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, mức với yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng: Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 Trong đó: x1: thời gian chiết (giờ); x2: tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (mL : g) Hàm mục tiêu, hàm lượng EL4 (mg/kg) phải đạt tối đa: Y → max Với yếu tố tối ưu (k = 2), số thí nghiệm phải thực N = 2k = 22 = thí nghiệm Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2; Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng; Đại học Đà Nẵng 98 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(119)/2020 quy hoạch trực giao cấp thí nghiệm tâm phương án Quy trình chiết thu nhận cao mật nhân theo sơ đồ hình Rễ mật nhân chiết với hệ thống ống sinh hàn nhiệt độ 100°C theo mức thời gian khảo sát với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thay đổi Sau chiết, tiến hành lọc cô quay chân không dịch chiết nhiệt độ 50°C đến Bx khoảng 20%, đun cách thủy đến Bx khoảng 50 % thu cao chiết Cao chiết gia nhiệt đến nhiệt độ 80°C để khí nhằm hạn chế q trình oxy hóa phát triển vi sinh vật gây bệnh Tiến hành rót nóng sản phẩm đóng nắp Sau đó, trùng nhiệt độ 80°C thời gian 10 phút để tiêu diệt vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm Hình Sơ đồ quy trình sản xuất cao mật nhân Kết quả: Điều kiện chiết cao phù hợp thu EL4 (9,10-Dimethoxy canthin-6-one) cao Cao chiết mật nhân điều kiện tối ưu xây dựng tiêu chuẩn sở b) Đánh giá chất lượng cảm quan trà thảo mộc mật nhân Mục đích: Đánh giá tiềm ứng dụng trà thảo mộc có bổ sung cao chiết mật nhân dựa hoạt tính sinh học - hàm lượng EL4, tính an tồn giá trị cảm quan sản phẩm người tiêu dùng Tiến hành thí nghiệm: ham khảo nghiên cứu trước (Nguyễn Hoài Trân, Trần Lê Trúc Hằng, 2010), trà thảo mộc mật nhân sản xuất theo sơ đồ hình Tiến hành đun nụ vối, cỏ ngọt, la hán, cam thảo nước cất nhiệt độ 80 oC 30 phút theo tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20 : (mL : g) (Truong Tuyet Mai et al., 2010) Lọc thô qua vải lọc lọc tinh qua lớp nhằm loại bỏ cặn nhỏ tạo độ cho dịch chiết Gia nhiệt đến nhiệt độ 80oC để khí Rót nóng, đóng nắp để giảm thời gian truyền nhiệt cho trình trùng nhiệt độ 100 oC 15 phút, tránh xâm nhập vi sinh vật Công thức phối chế: Nụ vối khô, 30 g; la hán khô, g; cỏ khô: 8,5 g, cam thảo, g; Nước, 1400 mL; cao mật nhân, 1000 mg Kết quả: hành phần chất lượng, tính an tồn giá trị cảm quan trà thảo mộc mật nhân 99 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 10(119)/2020 Hình Quy trình công nghệ sản xuất trà thảo mộc mật nhân 2.2.2 Phương pháp phân tích xác định tiêu khảo sát - Định lượng EL4 HPLC: dựa nguyên tắc xác định diện tích pic sắc ký đồ thời điểm thời gian lưu mẫu chuẩn EL4 trùng Từ đường chuẩn suy hàm lượng chất EL4 (Nursyazura Khari et al., 2014) Điều kiện sắc ký: Pha động: MeOH : H2O = 70% : 30%; Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút; hể tích mẫu tiêm: µL; Detector DAD, bước sóng: 254 nm; Cột C8 - 250 mm; hời gian lưu: - phút - Phương pháp đánh giá cảm quan: Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận người tiêu dùng sản phẩm thang điểm định nghĩa trước thông qua thuật ngữ mơ tả mức độ hài lịng - Phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm: xác định hàm lượng kim loại nặng (AOAC 999.11), định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TCVN 4884100 1:2015), Colifoms (TCVN 6848:2007), E coli (TCVN 7924-2:2008), tổng số bào tử nấm men nấm mốc (TCVN 8275-1:2010) 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Microsot Excel 2010 phần mềm thống kê Minitab 16 2.3 hời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2019 Phịng thí nghiệm Khoa Hóa - Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết thu nhận cao mật nhân phương pháp chưng ninh nước EL4 chất có khối lượng phân tử lớn, nhiệt độ bay cao nên nhiệt độ chiết hiệu nhiệt Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(119)/2020 độ sôi dung môi nước 100 oC Hai yếu tố ảnh hưởng với mức sở lần lượt: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 10 : - 30 : (mL : g) thời gian chiết - (giờ) điều kiện cố định thông số nhiệt độ 100 oC Ma trận thí nghiệm kết thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp - yếu tố toàn phần với yếu tố ảnh hưởng (TYT22), trình bày bảng chiết x1 nhiều yếu tố dung môi/ nguyên liệu x2 yếu tố tăng lên tỷ lệ thuận với chiều tăng hàm lượng EL4 Tối ưu hóa thực nghiệm phương pháp leo dốc mặt mục tiêu: điều kiện thí nghiệm tối ưu cho q trình chiết rễ mật nhân phương pháp chưng ninh nước {Yopt; X1opt; X2opt} = {14,39; 199,2 phút; 22,4 : mL : g} Bảng Ma trận thí nghiệm kết thí nghiệm 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm cao dược liệu mật nhân Tiêu chuẩn sở cao mật nhân đạt yêu cầu theo quy định Dược điển Việt Nam tập V So sánh với sản phẩm cao lỏng Hoắc hương khí, cao bổ phổi lưu hành thị trường kết tương thích hí nghiệm T1 T2 T3 Yếu tố thí nghiệm hệ tọa độ khơng thứ nguyên x0 x1 x2 + + + + + + + + + 0 + + 0 Yếu tố thí nghiệm X2 X1 (giờ) (mL/g) 40:1 40:1 20:1 20:1 30:1 30:1 30:1 Y (mg/ kg) 14,4 13,2 14,1 13,1 13,9 13,9 13,5 Bảng Tiêu chuẩn sở sản phẩm cao mật nhân Chỉ tiêu hông số/giá trị Cảm quan Cao lỏng, sánh, đồng nhất; màu nâu đậm; mùi nồng, đặc trưng dược liệu; vị đắng Ghi chú: T1, T2, T3 thí nghiệm tâm phương án; X1, X2 thông số tối ưu Cặn không tan nước (%) 1,18 ± 0,05 Sau tính hệ số b, kiểm tra ý nghĩa hệ số b kiểm tra tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm, có phương trình hồi quy sử dụng để tìm kiếm tối ưu: Y = 13,70 + 0,550 x1 + 0,100 x2 (3.1) Hàm lượng ẩm (%) 58,75 ± 0,04 Tro toàn phần (%) 4,18 ± 0,03 Từ phương trình hồi quy (3.1) nhận thấy: trình chiết phụ thuộc yếu tố thời gian chiết tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu với hệ số b1 = 0,550 > b2 = 0,100 > 0, cho thấy ảnh hưởng yếu tố thời gian pH 5,19 ± 0,02 Tỷ trọng d2020 1,2138 ± 0,0001 Hàm lượng chất EL4 (mg/kg) 390 ± 7,07 Kết phân tích số hợp chất thiên nhiên cao chiết rễ mật nhân thể bảng Bảng Kết định tính số hợp chất thiên nhiên cao chiết mật nhân Nhóm chất Alkaloid Wagner Phenolic Dung dịch FeCl3 1% Steroid Phản ứng Salkowski Phản ứng Lieberman-Bourchard TT huốc thử Kết bảng cho thấy diện hợp chất alkaloid, polyphenol, steroid, chất chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học Trong đó, alkaloid có hoạt tính kháng ung thư phổi (A-549) ung thư vú (MCF-7) (Ping-Chung Kuo et al., 2003), hoạt tính kháng viêm khả chống sốt rét (Leonadus et al., 1991; Pham Bich Hiện tượng Kết tủa nâu đỏ Dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm Dung dịch chuyển sang màu đỏ đậm Dung dịch chuyển sang màu cam Kết + Kết luận sơ Có + Có + + Có Ngoc et al., 2016); phenolic giảm nguy bệnh tim mạch (Alothman et al., 2009), phenolic chiếm phần lớn chất chống oxy hóa thực vật (Aliyu et al., 2009); steroid hỗ trợ để điều trị bệnh xương khớp, thiểu tuyến sinh dục, vô sinh (Phan Quốc Kinh, 2011) 101 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(119)/2020 3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 3.3.1 Hàm lượng EL4 sản phẩm trà thảo mộc mật nhân Hàm lượng EL4 tính theo cơng thức: X = Cm Vđm Vh Kpl ( mg ) L Hình Sắc ký đồ mẫu Trà thảo mộc Trong đó: Cm: nồng độ EL4 mẫu thử tính theo đường chuẩn, mg/L; Vđm: thể tích dung dịch định mức, mL; Vh: thể tích hút mẫu, mL; Kpl: hệ số pha loãng X = 0,038 100 = 0,38 ( mg ) 10 L Kết quả: Hàm lượng 9,10-Dimethoxycanthin6-one mẫu sản phẩm trà thảo mộc mật nhân là: 0,38 mg/L Sắc ký đồ mẫu chuẩn hình hình 3.3.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm Kết phân tích chất lượng sản phẩm trình bày bảng Hình Sắc ký đồ chuẩn EL4 Từ kết bảng 4, so sánh với Tiêu chuẩn chất lượng, nhận thấy sản phẩm trà thảo mộc mật nhân hoàn toàn đạt tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm Bảng Kết kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân TT Tên tiêu ĐVT Kết Mức quy định Đánh giá Tổng vi sinh vật hiếu khí CFU/mL 10 (*) Đạt Coliforms CFU/mL