Đang tải... (xem toàn văn)
Loài cây này đã được nghiên cứu nhân giống in vitro thành công với hệ số nhân rất cao; tuy nhiên, cần phải đánh giá sự tích lũy eurycomanone trong rễ cây in vitro khi trồng ở ngoài điều kiện tự nhiên. Trong bài viết này, sự tích lũy của eurycomanone trong mẫu rễ thu được từ cây nuôi cấy mô 1 năm và 1,5 năm tuổi được trồng ở hai địa điểm khác nhau đã được khảo sát.
UED Journal of Sciences, Humanities & Education – ISSN 1859 - 4603 TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC Nhận bài: 01 – 03 – 2016 Chấp nhận đăng: 28 – 06 – 2016 ĐÁNH GIÁ SỰ TÍCH LŨY HOẠT CHẤT EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NI CẤY MƠ TRỒNG NGỒI TỰ NHIÊN Võ Châu Tuấna*, Trần Quang Dầnb http://jshe.ued.udn.vn/ Tóm tắt: Eurycomanone hợp chất nhóm quassinoid, có nhiều hoạt tính sinh học quý, tích lũy với hàm lượng lớn rễ Mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) Loài nghiên cứu nhân giống in vitro thành công với hệ số nhân cao; nhiên, cần phải đánh giá tích lũy eurycomanone rễ in vitro trồng điều kiện tự nhiên Trong báo này, tích lũy eurycomanone mẫu rễ thu từ nuôi cấy mô năm 1,5 năm tuổi trồng hai địa điểm khác khảo sát Kết cho thấy, hàm lượng eurycomanone tích lũy rễ cấy mô tăng theo thời gian trồng (từ 177,367 - 178,53 mg/g năm tuổi lên 213,57 - 225,55 mg/g 1,5 năm tuổi); khơng có khác biệt hàm lượng tích lũy hợp chất cấy mô hữu tính trồng khoảng thời gian địa điểm khác Từ khóa: Mật nhân; eurycomanone; nuôi cấy mô; hợp chất thứ cấp; HPLC Giới thiệu Cây Mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dược liệu quý biết đến nhiều số quốc gia khu vực Đông Nam Á, bao gồm: Việt Nam, Malaysia, Indonesia [1, 2] Ở Việt Nam, Mật nhân biết đến với tên Bá bệnh, chúng phân bố chủ yếu vùng rừng núi số tỉnh khu vực miền Trung - Tây Nguyên [3] Trong y học cổ truyền, phận loài sử dụng vị thuốc dùng để chữa trị nhiều bệnh khác như: sốt rét, xương khớp, lở loét, dày [3] Ngày này, tác dụng thành phần dược liệu Mật nhân nghiên cứu cơng bố nhiều cơng trình khoa học [1, tr.4-6] Trong số hoạt chất quý Mật nhân, eurycomanone hoạt chất sinh học thuộc nhóm quassinoid, tích lũy với hàm lượng cao rễ, có vị đắng Năm 1982, Darise cộng lần sử dụng hỗn hợp phương pháp phân tích a Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng * Liên hệ tác giả Võ Châu Tuấn Email: vochautuan@gmail.com (NMR, MS, UV IR) để xác định đặc tính cấu trúc eurycomanone dịch chiết từ rễ [7] Từ đến nay, nhiều cơng trình nghiên cứu hoạt tính sinh học eurycomanone chiết xuất từ Mật nhân động vật công bố [5, tr.8-10] Bên cạnh đó, Hassan cộng (2014) tiến hành xây dựng quy trình nhân giống in vitro Mật nhân bước đầu đánh giá tích lũy eurycomanone rễ năm tuổi Ngoài ra, eurycomanone cịn xem thành phần dược tính chủ yếu Mật nhân thường sử dụng chất chuẩn để tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm thương mại [11] Để đáp ứng nhu cầu nguồn dược liệu Mật nhân cho mục đích khác nhau, việc ứng dụng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào tạo nguồn giống có chất lượng tốt [12,14] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy, việc tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, như: thời gian, điều kiện trồng, chăm sóc,… [15, 16] Chính vậy, trồng giống ni cấy mơ ngồi tự nhiên việc đánh giá tích lũy hoạt chất, để so sánh hiệu với giống tự nhiên quan trọng [17] Tạp chí Khoa học Xã hội, Nhân văn & Giáo dục, Tập 6, số (2016),35-40 | 35 Võ Châu Tuấn, Trần Quang Dần Trong nghiên cứu này, bước đầu tiến hành đánh giá tích lũy hoạt chất eurycomanone rễ Mật nhân ni cấy mơ giống hữu tính (gieo từ hạt) độ tuổi địa điểm trồng khác Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Cây Mật nhân nuôi cấy mô sau tháng huấn luyện vườn ươm phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN [18] trồng 02 địa điểm khảo sát: (1) xã Hòa Bắc (huyện Hòa Vang - Đà Nẵng), tọa độ điểm trồng 16°7′32″B 107°57′18″Đ; (2) xã Đại Lãnh (huyện Đại Lộc - Quảng Nam), tọa độ điểm trồng 15°52′35″B 107°56′6″Đ Điều kiện sinh thái điểm trồng phương pháp trồng mô tả tác giả Lê Thị Thùy Trâm cộng [19] Tương tự, sau nảy mầm tháng tuổi trồng điều kiện để làm mẫu đối chứng tích khả tích lũy eurycomanone 2.2.2 Xác định hàm lượng eurycomanone Hàm lượng eurycomanone mẫu dịch chiết xác định phương pháp sắc kí lỏng cao áp Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng (Quatest 2) thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn theo protocol Mohamad cộng có điều chỉnh [14] Cụ th, ct C-18 (4.6 mm ì 150 mm, àm) (hãng Aligent-Mỹ) sử dụng với vận tốc pha động 1,5 ml/phút, với hỗn hợp dung môi acetonitrile 0,05% axit orthophosphoric (tỉ lệ thể tích tương ứng 24/76) Tín hiệu xác định bước sóng 245 nm thời gian chạy mẫu 10 phút với thể tích mẫu 10 µl [20] Nồng độ mẫu thử xác định dựa vào đường chuẩn xây dựng mẫu chuẩn eurycomanone (hãng Sigma – Đức) pha theo dãy nồng độ 0,01; 0,2, 0,4; 0,6; 0,8 mg/ml (Hình 1) Nồng độ eurycomanone tính theo hàm lượng hoạt chất khối lượng chất khô (mg/g) 2.2 Đánh giá hàm lượng eurycomanone rễ Hàm lượng eurycomanone rễ Mật nhân nuôi cấy mô trồng địa điểm độ tuổi khác xác định dựa phương pháp Mohamad cộng [20] 2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết thô Ở địa điểm trồng tương ứng độ tuổi (1,0 1,5 năm tuổi), mẫu rễ từ 20 ni cấy mơ, hữu tính thu thập sấy khô 40oC đến khối lượng không đổi [21] 100 g mẫu rễ khô nghiệm thức nghiền thành dạng bột mịn, sau ngâm 250 ml dung môi methanol 70%, ủ máy lắc điều kiện 40oC, [8] Quá trình ngâm ủ tiếp tục lặp lại lần với việc thay dung môi sau lần ủ thu hồi dịch chiết ủ trước cách lọc qua giấy lọc Toàn dịch sau lần chiết trộn cô quay chân không điều kiện 40oC, áp suất 337 mbar [21] để loại bỏ hồn tồn dung mơi, sau hịa tan phần cặn 10 ml methanol tuyệt đối (Merck), lọc với màng lọc 0,45 µm bảo quản điều kiện 4oC để sử dụng cho phân tích Cách lấy mẫu quy trình tách chiết tương tự áp dụng cho mẫu rễ thu từ tự nhiên có độ tuổi > năm thu thập từ địa điểm trồng 36 Hình Kết quét phổ chất chuẩn eurycomanone sau phân tích HPLC với dung dịch mẫu tiêm có nồng độ 0.01mg/ml, thời gian lưu 4,826 phút 2.3 Xử lý thống kê Mỗi nghiệm thức đánh giá hàm lượng eurycomanone lặp lại 03 lần Các giá trị đặc trưng cho mẫu (Mean±SD) sai khác có ý nghĩa giá trị hàm lượng trung bình nghiệm thức xử lý theo phương pháp Ducan’s test (p =0,05) phần mềm SAS ver 9.1 Kết biện luận 3.1 Sự tích lũy eurycomanone rễ Mật nhân trồng xã Hòa Bắc trồng độ tuổi khác Hàm lượng hoạt chất bên sản phẩm dược liệu yếu tố quan trọng định chất lượng sản ISSN 1859 - 4603 - Tạp chí Khoa học Xã hội, Nhân văn & Giáo dục, Tập 6, số (2016),35-40 phẩm hiệu quy trình sản xuất [15, 22] Sự tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, độ tuổi trồng có ảnh hưởng lớn Sự tích lũy eurycomanone bên rễ nuôi cấy mô hữu tính trồng xã Hịa Bắc mốc thời gian năm 1,5 năm tuổi khảo sát Kết phân tích cho thấy, hàm lượng eurycomanone rễ Mật nhân 1,5 năm tuổi (213,57 mg/g) cao đáng kể so với hàm lượng tích lũy chất năm tuổi (178,53 mg/g) (Bảng 1, Hình -3) Bên cạnh đó, hàm lượng eurycomanone rễ hữu tính năm (184,03 mg/g) 1,5 năm tuổi (223,56 mg/g) cho kết tăng với giá trị tương đương (Bảng 1) Hiện nay, chưa có cơng trình thức đánh giá tích lũy eurycomanone rễ độ tuổi sinh lý khác nhau; nhiên, nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu đối tượng thực vật khác cho thấy kết tương tự [23, 24] Sự tăng giảm nhóm hoạt chất tùy thuộc nhiều vào chế chuyển hóa thay đổi đặc tính sinh lý qua giai đoạn Ngồi ra, kết cho thấy tích lũy hợp chất eurycomanone Mật nhân nuôi cấy mơ hữu tính khơng có khác biệt đáng kể Cụ thể, hữu tính hàm lượng hợp chất tích lũy 184,03 mg/g năm 223,56 mg/g 1,5 năm tuổi Trong nghiên cứu đánh giá hàm lượng eurycomanone rễ Mật nhân in vitro năm tuổi tác giả Hassan cộng cho thấy, hàm lượng chất tích lũy đạt 120,76 mg/g [25] Ở kết mà thu được, hàm lượng eurycomanone rễ nuôi cấy mô năm tuổi cao đáng kể (178,53 mg/g) (Hình 2) Điều cho thấy, khả tích lũy eurycomanone rễ trồng điều kiện tự nhiên, vùng khảo sát cao trồng chậu điều kiện vườn ươm Kết tìm thấy nhiều hợp chất loại nhiều đối tượng dược liệu ni cấy mơ khác nhau, tích lũy hợp chất chịu tác động lớn từ điều kiện mơi trường sống [15, 16] Hình Kết quét phổ dịch chiết từ rễ Mật nhân nuôi cấy mơ năm tuổi trồng xã Hịa Bắc sau phân tích HPLC với thời gian lưu 4,820 phút Hình Kết quét phổ dịch chiết từ rễ Mật nhân nuôi cấy mô 1,5 năm tuổi trồng xã Hịa Bắc sau phân tích HPLC với thời gian lưu 4,811 phút 3.2 Sự tích lũy eurycomanone rễ Mật nhân trồng xã Đại Lãnh Xã Đại Lãnh, huyện Đại Lộc - Quảng Nam địa điểm chọn để trồng Mật nhân nuôi cấy mô hữu tính nhằm đánh giá tích tũy hoạt chất rễ Kết phân tích cho thấy, hàm lượng eurycomanone rễ nuôi cấy mô hữu tính tăng đáng kể theo thời gian trồng Ở nuôi cấy mô, hàm lượng eurycomanone tăng từ 177,36 mg/g năm tuổi lên 215,53 mg/g 1,5 năm tuổi (Bảng 1, Hình 4) Trong đó, hàm lượng chất tự nhiên tăng từ 180,53 mg/g năm tuổi lên 225,55 mg/g (Bảng 1) Ngoài ra, so sánh hàm lượng eurycomanone rễ nuôi cấy mô hữu tính năm tuổi 1,5 năm tuổi cho thấy, khơng có khác biệt hàm lượng chất mẫu phân tích Kết tương tự kết đánh giá Mật nhân trồng xã Hòa Bắc 37 Võ Châu Tuấn, Trần Quang Dần kiện sinh thái hai khu vực Ngoài ra, khoảng thời gian tiến hành trồng khảo sát, chúng tơi nhận thấy điều kiện khí hậu hai vùng khác biệt (Trung tâm Khí tượng thủy văn Trung Bộ, 2012-2014) Có thể yếu tố dẫn đến tương đồng tích lũy eurycomanone Mật nhân trồng hai địa điểm Hình Kết quét phổ dịch chiết từ rễ Mật nhân nuôi cấy mô 1,5 năm tuổi trồng xã Đại Lãnh sau phân tích HPLC với thời gian lưu 4,819 phút 3.3 So sánh tích lũy eurycomanone rễ Mật nhân Các điều kiện sinh thái, canh tác trồng trọt có ảnh hưởng quan trọng đến tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật [22] Trong nghiên cứu này, tiến hành so sánh tích lũy eurycomanone hai địa điểm trồng khác nhau, xã Hòa Bắc xã Đại Lãnh, nhằm tìm điều kiện mơi trường thích hợp cho việc trồng quy mô sản xuất hợp chất rễ Mật nhân Kết thu cho thấy, hàm lượng eurycomanone tích lũy rễ Mật nhân hai địa điểm vào khoảng thời gian trồng tương ứng tương đương Mẫu rễ cấy mô thu từ trồng xã Hịa Bắc tích lũy hàm lượng từ 178,53 mg/g đến 213,57 mg/g, đó, mẫu rễ xã Đại Lãnh tích lũy từ 177,36 mg/g đến 215,53 mg/g (Bảng 1) Bên cạnh việc so sánh tích lũy hoạt chất địa điểm trồng khác nhau, tích lũy eurycomanone rễ Mật nhân từ – 1,5 năm tuổi với rễ tự nhiên > năm (đây độ tuổi khai thác làm dược liệu) so sánh, nhằm đánh giá mức độ tích lũy rễ ni cấy so với dược liệu thương phẩm Kết cho thấy, hàm lượng hoạt chất tích lũy tự nhiên đạt từ 1.833,77 mg/g (ở xã Hịa Bắc) (Hình 5) đến 1.838,08 mg/g (ở xã Đại Lãnh) Như vậy, Mật nhân nuôi cấy mô 1,5 năm tuổi trồng hai địa điểm đạt từ 11,62 - 11,69% Hàm lượng tích lũy tăng dần theo thời gian Bảng Sự tích lũy hàm lượng eurycomanone rễ Mật nhân Sự tích lũy eurycomanone (mg/g) Địa điểm Mẫu trồng 1,5 năm > năm năm CM 178,53a 213,57b Xã Hòa Bắc HT 184,03a 223,56b 1.833,77c Xã Đại Lãnh CM HT 177, 36a 180,53 a 215,53b 225,55b 1.838,08c Chú thích: Các chữ khác thể sai khác có ý nghĩa nhỏ giá trị trung bình theo Ducan’s test (p