Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần các ancaloit trong thân cây hoàng đằng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌ VÀ TÊN: ĐINH THỊ HỒNG THẢO TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC ANCALOIT CĨ TRONG THÂN CÂY HỒNG ĐẰNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC ĐÀ NẴNG - 2013 ************************ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC ANCALOIT CĨ TRONG THÂN CÂY HỒNG ĐẰNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC SINH VIÊN THỰC HIỆN LỚP : ĐINH THỊ HỒNG THẢO : 09CHD GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : TH.S ĐỖ THỊ THÚY VÂN ĐÀ NẴNG - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA HĨA Độc lập - Tự - Hạnh phúc ********** ******************* NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: ĐINH THỊ HỒNG THẢO Lớp: 09CHD Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần ancaloit thân hồng đằng” Ngun liệu, hóa chất, dụng cụ thiết bị chính: - Nguyên liệu: Thân hồng đằng thu hái từ xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum vào tháng 11 năm 2012 - Hóa chất: Các dung mơi hữu cơ: etanol 960, n-hexan, clorofom Hố chất vơ cơ: thuốc thử Wagner, dung dịch HCl, HNO3, NaOH, nước cất - Dụng cụ thiết bị chính: Bộ chiết soxhlet, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy đo sắc kí khí kết hợp với khối phổ GC-MS, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thuỷ, cốc sứ, loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc… Nội dung nghiên cứu: - Xác định số tiêu hóa lý độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng bột thân hoàng đằng - Xây dựng quy trình chiết tách ancaloit thân hồng đằng - Xác định thành phần hoá học, cấu trúc hợp chất ancaloit thân hoàng đằng thử hoạt tính kháng sinh Giáo viên hướng dẫn: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Ngày giao đề tài: 1/10/2012 Ngày hoàn thành: 30/4/2013 Giáo viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa ngày 22 tháng năm 2013 LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần ancaloit có thân hoàng đằng” thực từ tháng 11 năm 2012 đến tháng năm 2013 Trong suốt trình thực đề tài tơi nhận nhiều giúp đỡ thầy cô giáo, bạn bè nhân dân địa phương nơi thu hái mẫu Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thạc sĩ Đỗ Thị Thúy Vân, người ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Din thầy quản lí phịng thí nghiệm Hóa dược - Hóa hữu - Hóa phân tích - Hóa lí đại học Sư Phạm giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình người bạn nhân dân địa phương xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum Một lần xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Đinh Thị Hồng Thảo MỤC LỤC  MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.Các phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục đề tài CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu họ Tiết dê Menispermaceae 1.2 Giới thiệu hoàng đằng 1.2.1 Sơ lược nguồn gốc hoàng đằng giới thực vật 1.2.2 Cây hoàng đằng 1.3 Một số nghiên cứu thành phần hố học hồng đằng 1.3.1 Thành phần hóa học 1.3.2 Nghiên cứu chung ancaloit 1.3.3 Các ancaloit có hồng đằng tìm thấy 1.4 Giá trị sử dụng hoàng đằng 1.4.1 Y dược dân gian 1.4.2 Các nghiên cứu dược học hoàng đằng CHƯƠNG – NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 10 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất 10 2.1.1 Thu gom nguyên liệu 10 2.1.2 Xử lí nguyên liệu 10 2.1.3 Thiết bị- dụng cụ hóa chất 11 2.1.3.1 Thiết bị- dụng cụ 11 2.1.3.2 Hóa chất 11 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 12 2.3 Các phương pháp xác định tiêu hóa lí 12 2.3.1 Xác định độ ẩm 12 2.3.2 Xác định hàm lượng tro phương pháp tro hóa mẫu 13 2.3.3 Xác đinh hàm lượng số kim loại thân hoàng đằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 14 2.4 Khảo sát điều kiện chiết ancaloit từ thân hoàng đằng 14 2.4.1 Khảo sát chọn dung môi chiết 14 2.4.1.1 Bằng cảm quan 15 2.4.1.2 Bằng thực nghiệm 15 2.4.2 Phương pháp chiết 15 2.4.2.1 Phương pháp ngấm kiệt 15 2.4.2.2 Phương pháp chiết soxhlet 16 2.4.3 Khảo sát điều kiện chiết 16 2.4.3.1 Khảo sát thời gian chiết 16 2.4.3.2 Khảo sát tỉ lệ rắn-lỏng 16 2.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết từ thân hoàng đằng 17 2.6 Nhận biết định tính ancaloit 17 2.7 Xác định thành phần hợp chất từ thân hoàng đằng phương pháp GC-MS 17 2.8 Thử hoạt tính kháng sinh 18 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1.Kết xác định số tiêu hóa lí hoàng đằng 19 3.1.1 Độ ẩm 19 3.1.2 Hàm lượng tro 19 3.1.3 Hàm lượng số kim loại nặng 20 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết tối ưu 20 3.2.1 Khảo sát chọn dung môi chiết 20 3.2.1.1 Bằng cảm quan 20 3.2.1.2 Bằng thực nghiệm 21 3.2.2 Phương pháp chiết 22 3.2.2.1 Phương pháp ngấm kiệt 22 3.2.2.2 Phương pháp chiết soxhlet 22 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết 23 3.2.4 Khảo sát tỉ lệ rắn-lỏng 24 3.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết từ thân hoàng đằng 25 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 25 3.3.2 Ảnh hưởng môi trường 25 3.4 Nhận biết định tính ancaloit 26 3.5 Kết xác định thành phần hóa học hợp chất dịch chiết hoàng đằng 26 3.6 Thử hoạt tính kháng sinh 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân biệt khoa học họ Tiết dê Menispermaceae Bảng 3.1 Kết khảo sát độ ẩm 19 Bảng 3.2 Kết khảo sát hàm lượng tro 19 Bảng 3.3 Bảng hàm lượng số kim loại nặng hoàng đằng 20 Bảng 3.4 Khối lượng cắn chiết với dung môi chiết khác 21 Bảng 3.5 Khối lượng cắn chiết với phương pháp chiết khác 22 Bảng 3.6 Khối lượng cắn chiết với thời gian chiết khác 23 Bảng 3.7 Khối lượng cắn chiết với tỉ lệ rắn – lỏng khác 24 Bảng 3.8 Kết màu sắc dịch chiết nhiệt độ bảo quản khác 25 Bảng 3.9 Kết màu sắc dịch chiết môi trường khác 26 Bảng 3.10 Thành phần hóa học cặn chiết hoàng đằng 27 Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính kháng sinh 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cây hồng đằng Hình 1.2 Quả hồng đằng Hình 1.3 Hoa hoàng đằng Hình 1.4 Cấu trúc chung ancaloit hoàng đằng Hình 2.1 Một số hình ảnh cây, hoa hoàng đằng 10 Hình 2.2 Hồng đằng cắt lát phơi khơ 11 Hình 2.3 Bột hồng đằng 11 Hình 2.4 Một số hóa chất sử dụng 11 Hình 2.5 Dịch lọc thu theo thứ tự từ trái sang phải dung môi clorofom, n-hexan, etanol 960 15 Hình 2.6 Bộ dụng cụ chiết Soxhlet 16 Hình 3.1 Dịch lọc thu theo thứ tự từ trái sang phải dung môi clorofom, n-hexan, etanol 960 21 Hình 3.2 Cắn thu theo hai phương pháp ngấm kiệt chiết soxhlet 22 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn phụ thuộc %m cắn vào thời gian chiết 23 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn phụ thuộc %m cắn vào thể tích etanol 960 24 Hình 3.5 Màu sắc dịch chiết môi trường khác 25 Hình 3.6 Từ trái sang phải theo thứ tự ống nghiệm 1, ống nghiệm 26 Hình 3.7 Sắc kí đồ GC-MS thành phần hóa học hợp chất dịch chiết hồng đằng 27 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngày nay, với tiến khoa học, ngành công nghệ tổng hợp Hố dược phát triển mạnh mẽ Nhờ nhiều biệt dược tạo sử dụng rộng rãi cơng tác phịng chữa bệnh nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ Mặc dù đạt nhiều thành tựu quan trọng nhiều hợp chất cịn khó tổng hợp tổng hợp chi phí đắt Vì thế, chỗ đứng thảo dược y học không Thiên nhiên ưu ban tặng cho Việt Nam ta “rừng vàng, biển bạc” Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm tạo điều kiện phát triển thuận lợi cho thảm thực vật Do mà nguồn dược liệu từ cỏ Việt Nam vô phong phú đa dạng Từ xa xưa, dân gian ta biết dùng loại dược liệu để điều trị nhiều bệnh khác Một thuốc nam người xưa sử dụng nhiều hoàng đằng Hoàng đằng loài mọc hoang dại nhiều vùng núi Việt Nam từ Lạng Sơn Nam Bộ, nhiên phân bố phong phú vùng núi từ Nghệ An trở vào [2], [3] Hoạt chất hồng đằng ancaloit, ancaloit palmatin chiếm từ 1-2% Ngồi cịn có berberin, jatrorrhizin, columbamin, palmatrubin,… [2], [3], [12] Các ancaloit có hoạt tính sinh học cao, dùng y học dân gian để chữa bệnh đường tiêu hóa tiêu chảy, lỵ đặc biệt ức chế tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) liên cầu khuẩn (Streptococcus) [2], [3], [9], [10], [12], bệnh truyền nhiễm chúng thành phần thuốc an thần, thuốc cai nghiện [8] Ngoài ra, từ bã hoàng đằng, người ta thấy chứa hợp chất đitecpenoit clerodan: fibraurin, dehydrocolumbin có tính kháng khuẩn, kháng nấm Loại chất dùng làm chất bảo quản ngũ cốc, hoa tốt, chống mối mọt không gây ô nhiễm môi trường…[4] Tuy nhiên nay, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu mang tính thành phần, tính chất, khả ứng dụng, cơng nghệ khai thác hợp chất hố học có hoàng đằng Đây vấn đề đáng quan tâm nghiên cứu nhằm góp phần quy hoạch, khai thác, chế biến ứng dụng sản phẩm hồng đằng cách có hiệu quả, khoa học Kĩ thuật GC-MS có độ xác cao, nhiễm ngồi thu thập thơng tin từ tR, ta cịn thu thập thơng tin từ giá trị m/z so sánh thư viện phổ chuẩn 2.8 Thử hoạt tính kháng sinh Dịch chiết từ thân hồng đằng tiến hành đuổi dung mơi thu lấy cắn Cắn gởi đến phịng hóa sinh ứng dụng – Viện hàn lâm khoa học cơng nghệ việt nam –Viện hóa học – 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội để tiến hành thử hoạt tính kháng sinh Phương pháp thử: kiểm định định tính theo phương pháp khuyếch tán thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn Các chủng vi sinh vật thử gồm: - Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum - Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa - Nấm: Candida albican CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết xác định số tiêu hóa lí hồng đằng 3.1.1 Độ ẩm Bột thân hồng đằng khơ tiến hành xác định độ ẩm Số lượng mẫu lấy để xác định độ ẩm mẫu Độ ẩm chung độ ẩm trung bình mẫu Kết xác định độ ẩm trung bình mẫu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khảo sát độ ẩm STT m1(g) m2(g) m3(g) W(%) 44,896 2,008 46,774 6,481 34,181 2,035 36,084 6,493 30,046 2,067 32,339 6,472 43,055 2,024 44,948 6,483 45,483 2,011 47,364 6,456 Wtb (%) 6,480 Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình thân hồng đằng khơ 6,480% Kết hồn tồn phù hợp theo chuyên luận dược liệu hoàng đằng Dược điển Việt Nam IV 14% [1] 3.1.2 Hàm lượng tro Lấy mẫu hoàng đằng xác định độ ẩm trên, nung lò nung nhiệt độ 400-4500C để xác định hàm lượng tro Hàm lượng tro lấy trung bình từ mẫu Kết xác định hàm lượng tro trung bình trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết khảo sát hàm lượng tro STT m1(g) m2(g) m4(g) % tro (%) 44,896 2,008 44,957 3,038 34,181 2,035 34,249 3,342 30,046 2,067 30,479 3,532 43,055 2,024 43,129 3,656 45,483 2,011 45,557 3,680 Hàm lượng tro trung bình 3,449 Vậy hàm lượng tro trung bình là: 3,449% Kết hoàn toàn phù hợp theo chuyên luận dược liệu hoàng đằng Dược điển Việt Nam IV hàm lượng tro không 5% [1] 3.1.3 Hàm lượng số kim loại nặng Tro thu sau nung mẫu hòa tan dung dịch nước cường toan HCl:HNO3 (1:3) định mức nước cất bình định mức 50ml thu dung dịch Dung dịch gởi đến trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung bộ, số 660, Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng để xác định hàm lượng kim loại nặng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Kết phân tích trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Bảng hàm lượng số kim loại nặng hoàng đằng TCVN 3572 - 81 theo Hàm Hàm lượng lượng kim loại (ppm) (mg/kg) tế ngày 4/4/1998 (mg/kg) Fe 0,125 3,125 5,0 Hg 0,0010 0,025 0,4 Pb 0,0022 0,055 2,0 Kim loại định Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT Bộ Y Căn vào định số 867/1998/QĐ-BYT Bộ Y tế ngày 4/4/1998 (mg/kg) số tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép rau khô Fe: 5mg/kg, Hg: 0,4 mg/kg, Pb: 2mg/kg hàm lượng kim loại thân hồng đằng khơng ảnh hưởng đến sức khoẻ người hàm lượng kim loại nặng thân hoàng đằng Fe: 3,125mg/kg, Hg: 0,025mg/kg, Pb: 0,055mg/kg 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết tối ưu 3.2.1 Khảo sát chọn dung môi chiết 3.2.1.1 Bằng cảm quan - Chuẩn bị cốc thủy tinh rửa nước cất sấy khô Đánh số thứ tự từ đến - Lấy khoảng 10g bột thân hoàng đằng cho vào cốc - Thêm vào cốc 100ml dung môi: clorofom, n-hexan, etanol 960 - Ngâm khoảng ngày - Lọc lấy dịch lọc - Nhận xét cảm quan màu dịch lọc thu Hình 3.1 Dịch lọc thu theo thứ tự từ trái sang phải dung môi clorofom, n-hexan, etanol 960 Như vậy, màu dịch lọc thu đậm dần theo thứ tự dung môi chiết clorofom, n-hexan, etanol 960 Bằng cảm quan, ta thấy với dung môi etanol 960, lượng chất chiết nhiều 3.2.1.2 Bằng thực nghiệm - Cất thu hồi dung môi dịch lọc ta thu cắn - Cắn cho vào bình hút ẩm, sau cân cân phân tích Kết khối lượng cắn trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Khối lượng cắn chiết với dung môi chiết khác STT Tên dung môi Khối lượng cắn thu (g) Clorofom 9,47 n-hexan 23, 07 Etanol 960 30,52 Từ kết cho thấy khối lượng cắn thu chiết bột thân hoàng đằng dung môi etanol 960 lớn Nguyên nhân thân hồng đằng có chứa nhiều hợp chất phân cực nên chúng tan tốt dung môi phân cực etanol tan dung môi không phân cực khác clorofom, n-hexan Do đó, tơi chọn dung mơi etanol 960 để chiết ancaloit thân hoàng đằng 3.2.2 Phương pháp chiết 3.2.2.1 Phương pháp ngấm kiệt - Cân xác 10g bột thân hồng đằng cho vào bình tam giác Thêm vào 100ml etanol 960, đậy nắp lại, để thời gian - Sau lọc, thu dịch - Dịch lọc sau cô bay dung môi thu cắn Cắn đem cân cân phân tích Phương pháp soxhlet 3.2.2.2 - Cân xác 10g bột thân hồng đằng gói vào giấy lọc Sau cho vào dụng cụ chiết soxhlet - 100ml dung mơi etanol 960 chứa bình cầu thiết bị chiết soxhlet, bốc phần nhiệt độ 800 C - Sau thời gian giờ, rút điện để nguội, tháo thiết bị - Dịch chiết thu tiến hành cô bay dung môi thu cắn Cắn cho vào bình hút ẩm, sau cân cân phân tích Hình 3.2 Cắn thu theo hai phương pháp ngấm kiệt chiết soxhlet Kết khối lượng cắn trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Khối lượng cắn chiết với phương pháp chiết khác STT Phương pháp chiết Khối lượng cắn thu (g) Phương pháp ngấm kiệt 14,05 Phương pháp chiết soxhlet 14,98 Như vậy, lượng cắn chiết thu từ hai phương pháp xấp xỉ Tuy nhiên, lượng cắn thu phương pháp chiết soxhlet nhiều Do đó, tơi lựa chọn phương pháp chiết soxhlet để chiết tách ancaloit thân hoàng đằng 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết Tiến hành chiết soxhlet 10g bột thân hoàng đằng với 100ml dung môi etanol 960 thời gian giờ, giờ, giờ, giờ, 10 giờ, 12 nhiệt độ 800C Dịch chiết cô bay dung môi thu cắn Cắn cho vào bình hút ẩm, sau cân lấy khối lượng Kết khối lượng cắn trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Khối lượng cắn chiết với thời gian chiết khác Khối lượng STT Khối lượng mẫu(g) Thời gian(h) cắn(g) % khối lượng cắn 10,0423 1,0292 10,25 10,0983 1,5218 15,07 10,2934 2,0414 19,83 10,3974 3,0887 29,71 10,2345 10 3,0417 29,72 10,2069 12 3,1002 30,40 Đường biểu diễn phụ thuộc % m cắn vào thời gian chiết 35 30 % m cắn 25 20 % khối lượng cắn 15 10 0 10 12 14 thời gian (h) Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn phụ thuộc %m cắn vào thời gian chiết Như vậy, thời gian tăng lượng cắn chiết thu nhiều Đến thời gian lượng cắn chiết thu tăng mạnh Nguyên nhân tăng thời gian chiết, trình tiếp xúc dung mơi ngun liệu tăng nên làm tăng khối lượng chất chiết từ dược liệu Từ lúc trở lượng chất dược liệu gần tách hồn tồn Vì nên tiếp tục tăng thời gian khối lượng cắn chiết không tăng bao nhiêu, mà lại nhiều thời gian Do đó, thời gian chiết tối ưu 3.2.2 Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng Tiến hành chiết soxhlet 10g bột thân hoàng đằng khoảng thời gian 8giờ, nhiệt độ 800C với dung môi etanol 960 theo tỉ lệ 60ml, 80ml, 100ml, 120 ml, 140ml, 160ml Dịch chiết cô bay dung mơi thu cắn Cắn cho vào bình hút ẩm , sau cân lấy khối lượng Kết khối lượng cắn trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Khối lượng cắn chiết với tỉ lệ rắn – lỏng khác Khối lượng Thể tích dung % khối lượng STT mẫu(g) môi etanol(ml) Khối lượng cắn(g) cắn 10,2567 60 1,1025 10,75 10,1984 80 1,9441 19,06 10,4874 100 3,0897 29,46 10,0845 120 2,9752 29,50 10,0498 140 2,9692 29,54 10,1207 160 2,9983 29,63 Đường biểu diễn phụ thuộc % m cắn vào thể tích etanol 35 30 %m cắn 25 20 %m cắn 15 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Thể tích etanol (ml) Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn phụ thuộc %m cắn vào thể tích etanol 960 Như vậy, tăng thể tích etanol 960 khối lượng cắn chiết tăng lên Đến V = 100ml khối lượng cắn chiết thu tăng mạnh Nguyên nhân thể tích dung mơi tăng làm tăng khả tiếp xúc dung môi nguyên liệu nên làm tăng khối lượng cắn chiết từ dược liệu, đến lúc lượng chất dược liệu tách gần hoàn toàn nên tiếp tục tăng thể tích dung mơi khơng chiết thêm chất mà lại tốn dung mơi Do đó, chọn tử lệ rắn- lỏng tối ưu 10g nguyên liệu/100ml etanol (1/10) 3.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết ancaloit từ thân hoàng đằng 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Lấy mẫu dịch chiết hồng đằng dung mơi etanol 960 bảo quản điều kiện khác Sau ngày lấy quan sát màu sắc dịch chiết, thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết màu sắc dịch chiết nhiệt độ bảo quản khác Mẫu Điều kiện bảo quản Hiện tượng Vừa chiết Màu vàng, Để nhiệt độ phịng Màu thay đổi, Để tủ lạnh Màu thay đổi, Như nhiệt độ không ảnh hưởng đến dịch chiết từ thân hồng đằng với dung mơi etanol 960 3.3.2 Ảnh hưởng môi trường Lấy mẫu dịch chiết hồng đằng dung mơi etanol 960 cho vào ống nghiệm: ống để đối chứng, ống cho HCl, ống cho NaOH vào (xem hình 3.5) Hình 3.5 Màu sắc dịch chiết môi trường khác Màu sắc dịch chiết thay đổi trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết màu sắc dịch chiết môi trường khác Mẫu Môi trường Hiện tượng Trung tính Màu vàng Axit Màu đậm hơn, dung dịch trở nên đục Bazơ Màu đậm thêm thành màu nâu đỏ Như môi trường ảnh hưởng đến dịch chiết từ thân hoàng đằng chiết dung mơi etanol 960 3.4 Nhận biết định tính ancaloit Cho vào ống nghiệm, ống cắn chiết Thêm dung mơi etanol 960 để hịa tan cắn chiết Ống nghiệm dùng làm mẫu đối chứng Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch thuốc thử Wagner vào ống nghiệm thấy xuất kết tủa nâu (xem hình 3.6) Điều chứng tỏ cắn chiết hồng đằng có ancaloit Hình 3.6 Từ trái sang phải theo thứ tự ống nghiệm ống nghiệm 3.5 Kết xác định thành phần hóa học hợp chất dịch chiết hoàng đằng Bột thân hoàng đằng tiến hành chiết soxhlet với dung môi etanol 960 thời gian giờ, dịch chiết thu có màu vàng đậm Cô đuổi dung môi thu cắn chiết Cắn gởi đến Trung tâm kỹ thuật đo lường chất lượng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng để tiến hành đo sắc kí khí kết hợp với khối phổ GC-MS Kết định danh cấu tử có cắn chiết thân hồng đằng GCMS thể phổ đồ hình 3.7 Hình 3.7 Sắc kí đồ GC-MS thành phần hóa học hợp chất dịch chiết hoàng đằng Kết từ sắc kí đồ - khối phổ thu cho thấy dịch chiết thu từ thân hoàng đằng có 14 cấu tử, có cấu tử ancaloit Bảng 3.10 Thành phần hóa học cặn chiết hoàng đằng STT tR Định danh Hàm lượng(%) 12,154 2,82 Công thức cấu tạo KLPT (m/z) Cycloheptasiloxane 519 H3C H3C tetradecamethyl- H C H3C CH3 CH3 CH3 O O O Si Si Si Si CH3 O Si O Si H3C H3C H3C H3C 12,361 1,98 Phenol, 3,5- O Si O H3C CH3 OH 206 bis(1,1H3C dimethylethyl) H3C 25,601 13,53 1,2- CH3 CH3 CH3 278 benzendicarboxylic acid, CH3 mono(2- ethylhexyl) este O OH O O CH3 CH3 37,757 1,49 Berberine 336 H3C H3C O N O O O 37,879 2,51 Palmatine 342 H3C H3C O O N OCH OCH Như vậy, palmatin ancaloit chiếm tỉ lệ phần trăm nhiều (2,51%) hỗn hợp cấu tử thu từ dịch chiết thân hồng đằng, berberin chiếm 1,49% Hai ancaloit có tác dụng kháng khuẩn với Shigella, liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, số nấm men gây bệnh số động vật nguyên sinh Những nghiên cứu chuột nhắt cho thấy berberin palmatin có khả làm giảm thiếu máu cục bô, tái cung cấp máu cho tình trạng tổn thương tim cấp tính [14] Ở liều khảo sát 50 mg/kg, hai ancaloit có tác động bảo vệ phục hồi tốt trí nhớ không gian bị làm suy giảm scopolamin [7] Do đó, thuốc nghiên cứu thuốc chữa bệnh tim, suy giảm nhận thức đặc biệt Alzheimer [7] 3.6 Thử hoạt tính kháng sinh cắn chiết thân hoàng đằng Bột thân hồng đằng tiến hành chiết soxhlet với dung mơi etanol thời gian giờ, dịch chiết thu có màu vàng đậm Cô đuổi dung môi thu cắn chiết Cắn chiết gởi đến phịng hóa sinh ứng dụng- Viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam –Viện hóa học – 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Kết thử hoạt tính kháng sinh trình bày bảng 3.13 Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính kháng sinh Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật nấm kiểm định - IC50 μg/ml Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) Tên Staphylococcus Bacillus Lactobacillus Salmonella Escherichia mẫu aureus subtilis fermentum enterica coli Cao chiết Hoàng đằng >128 >128 >128 >128 >128 Nấm Pseudomonas aeruginosa Candida albican >128 >128 Theo nghiên cứu trước hoạt chất hồng đằng có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) liên cầu khuẩn (Streptococcus) Trong đề tài này, tiến hành thử thêm hoạt tính kháng sinh cắn chiết hồng đằng với vi khuẩn Gram (+) Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, vi khuẩn Gram (-) Salmonella enterica, Escherichia, Pseudomonas aeruginosa nấm Candida albican mẫu thử khơng thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định với nồng độ thử KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số kết luận sau: Bột hồng đằng khơ có: độ ẩm trung bình 6,440%; hàm lượng tro 3,449%, hàm lượng kim loại nặng (Fe: 3,125mg/kg, Hg: 0,025mg/kg, Pb: 0,055mg/kg) phù hợp với TCVN 3572 - 81 theo Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT Bộ Y tế ngày 4/4/1998 Đã khảo sát tìm điều kiện thích hợp để chiết tách ancaloit từ thân hoàng đằng phương pháp chiết soxhlet với dung môi etanol 960 là:  Thời gian chiết  Tỉ lệ nguyên liệu rắn (g):dung môi lỏng (ml) 10:100 (1:10) Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết từ thân hoàng đằng sau:  Nhiệt độ không ảnh hưởng đến dịch chiết  Môi trường có ảnh hưởng đến dịch chiết Bằng phương pháp GC-MS xác định thành phần hàm lượng ancaloit có dịch chiết hồng đằng với dung môi etanol 960 sau: Berberine (1,49%); Palmatine (2,51%) Cắn chiết hồng đằng với dung mơi etanol khơng thể hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum), vi khuẩn Gram (-) (Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), nấm Candida albican với nồng độ thử II KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học hồng đằng dung môi chiết khác Tiếp tục nghiên cứu chạy sắc kí cột để tách cấu tử tinh khiết từ hồng đằng để tìm hiểu hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng Tiếp tục thử hoạt tính kháng sinh cắn chiết hoàng đằng với chủng vi sinh vật khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội [2] Bộ Y tế (2007), Dược liệu học tập II, NXB Y học, Hà Nội, tr.109-111 [3] Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.193 [4] Lâm Ngọc Thiềm, Phạm Hoàng Ngọc, Lê Lim Long, Dùng phương pháp tính lượng tử để xác định cấu trúc 7,8- Dehydro-Columbin ( Fibleucin) tách chiết từ hoàng đằng [5] Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1996), Cơ sở lý thuyết hóa học phân tích, Dùng cho sinh viên ngành hóa trường đại học, In lần thứ 3, Nhà xuất giáo dục [6] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Trực (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học TP Hồ Chí Minh [7] Nguyễn Hồi Nam, Võ Phùng Ngun, Trần Hùng (2010), Tác động berberin palmatin trí nhớ hình ảnh khơng gian chuột nhắt,Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh số 14 [8] Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Thị Hồng Minh, Lâm Ngọc Thiềm, Trần Văn Vinh (1997), Tuyển tập báo cáo toàn văn Hội Nghị toàn quốc đề tài nghiên cứu khoa học lĩnh vực hóa lý hóa lý thuyết, NXB Y học, Hà Nội, tr.89 [9] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây Cỏ Việt Nam- Quyển I, NXB Trẻ, tr.332 [10] Phan Quốc Kinh (1971), Nghiên cứu Alcaloid chiết xuất từ thuốc Việt Nam, ĐH Dược khoa Hà nội, tr.10, tr.42 [11] Trần Tứ Hiếu (2001), Hố học phân tích, NXB Đại học quốc gia Hà Nội [12] Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.1312 Tiếng nước [13] Irokawa cộng (1986), Phytochemistry 28, tr.905-908 [14] Young Min Kim, Yu Min Ha, Young Chu Jin, Young Chun Jin (2009), Palmatine from Coptidis rhizoma reduces ischemia-reperfusion-mediated acute myocardial injury in the rat, Food and Chemical Toxicology Internet [15] http://botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Menispermaceae&list=familia [16]http://thaoduocviet.net/Cay-Th%E1%BA%A3oD%C6%B0%E1%BB%A3c/hoang-dang.html [17]http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_Bi%E1%BB%83n_b%E1%BB%A9 c_c%C3%A1t [18]http://yume.vn/bvpharma/article/cay-thuoc-viet-nam-h-2.35D85F23.html ... đằng cách có hiệu quả, khoa học Xuấ t phát từ thực tế trên, với lòng say mê ham học hỏi nghiên cứu khoa học, chọn đề tài ? ?Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần ancaloit thân hồng đằng? ??... Mục đích nghiên cứu - Xác định số tiêu hóa lý độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng bột thân hồng đằng - Xây dựng quy trình chiết tách ancaloit thân hoàng đằng - Xác định thành phần hoá... HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC ANCALOIT CĨ TRONG THÂN CÂY HỒNG ĐẰNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC SINH VIÊN THỰC