NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH HỘI CHỨNG GÀY CÒM SAU CAI SỮA LIÊN QUAN ĐẾN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE Ở ĐÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC

1 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH HỘI CHỨNG GÀY CÒM SAU CAI SỮA LIÊN QUAN ĐẾN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE Ở ĐÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM Clinical Signs and Pathological Lesions in Pigs with PCV2 associated - Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in Some Northern Provinces of Vietnam Huỳnh Thị Mỹ Lệ1, Nguyễn Văn Giáp1, Đặng Hữu Anh1, Nguyễn Bá Tiếp2 Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, 2Bộ môn Giải Phẫu– Tổ chức, Khoa Thú y, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 10 Đại tác giả liên hệ: huynhtmle@yahoo.com 11 12 TÓM TẮT 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích xác định biểu lâm sàng biến đổi bệnh tích chủ yếu lợn nghi mắc hội chứng gày còm sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS) liên quan đến porcine circovirus type (PCV2) Đã thu thập 39 lợn sau cai sữa có biểu còi cọc nghi mắc PMWS từ 16 trại lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam (bao gồm Hà Nội, Hịa Bình, Hải Dương, Bắc Giang) Triệu chứng chủ yếu quan sát biểu lợn cịi cọc lơng khơ, xơ xác (100%); lợn có triệu chứng hô hấp với tỷ lệ 89,74% Một số triệu chứng lâm sàng khác lợn bao gồm tượng hoàng đản (15,38%); tiêu chảy (23,08%); triệu chứng thần kinh (10,26%) viêm da (20,51%) Bệnh tích đại thể gồm tượng xác gầy sưng, xuất huyết hạch lympho (tỷ lệ dao động từ 94,87 % đến 100%); tỷ lệ có bệnh tích hạch amidan 53,85%, phổi (92,31%), gan (41,02%), thận (30,77%), ruột (28,21%) lách (17,95%); có 7,69% lợn bị viêm khớp Các biến đổi vi thể điển hình PMWS liên quan đến PCV2 viêm mãn tính phá hủy mạch máu; viêm dạng hạt vói hình thành tế bào khổng lồ đa nhân tìm thấy phổi, hạch bẹn nông, thận gan lợn bệnh Kết kiểm tra kỹ thuật nested PCR cho thấy 94,87% mẫu bệnh phẩm lợn nghiên cứu bị nhiễm PCV2, genotype PCV2b Từ khóa: lợn, PCV2, hội chứng còi cọc sau cai sữa 30 31 SUMMARY 32 33 34 35 36 The aim of this study was to determine main clinical signs and pathological lesions of pigs with PCV2 - associated PMWS Thirty nine postweaning pigs with suspected PCV2-associated PMWS were collected from 16 farms of nothern provinces of Vietnam (Hanoi, Hoa Binh, Bac Giang and Hai Duong) Clinical signs included wasting with weight loss, ill-thrift and rough hair coat (100%), respiratory clinical signs (89,74%), jaundice (15,38%), diarrhea (23,08%), neurologic 37 38 39 40 41 42 43 44 signs (10,26%) and dermatitis (20,51%) Gross lesion finding included body prominent backbone and swollen, hemorrhagic lympho nodes (ranging from 94.87% to 100%) Gross lesions could also be found in the tonsil (53.85%), lung (92.31%), liver (41.02%), kidney (30,77%), intestines (28,21%) and spleen (17.95%), arthritis (7.69%) Microscopic lesions consisted of vasculitis and granulomatous inflammation with the forming of multinucleated giant cells in the lung, superficial inguinal lymph nodes, kidney and liver Using nested PCR method, PCV2b antigen were positive in 94.87% of samples from suspected pigs Keywords: pigs, PCV2, postweaning multisystemic wasting syndrome 45 46 I ĐẶT VẤN ĐỀ 47 Porcine circovirus type (PCV2) nguyên nhân khởi phát gây hội chứng liên quan 48 tới PCV2 (Porcine circovirus type 2-associated disease, PCVAD) PCV2 tác động đến tế bào 49 lympho tế bào có thẩm quyền miễn dịch tế bào đơn nhân, đại thực bào tế bào tua 50 (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác 51 xâm nhập gây bệnh Trong hầu hết trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ 52 gây nhiễm đồng thời với số mầm bệnh truyền nhiễm không truyền nhiễm (Rovira 53 cs.,, 2002) Tomás cs., (2008) cho PCV2 điều kiện cần, với tác nhân gây 54 nhiễm khác điều kiện ngoại cảnh để gây thành bệnh PCVAD 55 PCV2 có liên quan đến Hội chứng gầy còm lợn sau cai sữa (postweaning 56 multisystemic wasting syndrome – PMWS); Hội chứng viêm da viêm thận (porcine 57 dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS); Hội chứng viêm đường hô hấp (porcine 58 respiratory diseases complex) Hội chứng rối loạn sinh sản lợn (porcine reproductive 59 disorders) Trong số bệnh circovirus gây ra, PMWS coi nguyên nhân gây thiệt 60 hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn PMWS thường xảy lợn từ – 16 tuần 61 tuổi Tỷ lệ ốm thường dao động từ - 30% (đôi lên đến 50 - 60%), tỷ lệ chết khoảng từ - 62 20% 50% 63 Ở Việt Nam, PCV2 phát số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 với tỷ lệ 64 nhiễm 38,97% đến 2006 tỷ lệ nhiễm tăng đến 96,47%, chứng tỏ PCV2 lưu hành 65 phổ biến chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng cs., 2006) 66 nguyên nhân gây còi cọc lợn cai sữa số trại lợn thành phố Hồ Chí Minh Nghiên 67 cứu số tác Lam Thu Huong Duong Chi Mai (2006); Lê Tiến Dũng (2006) 68 cho thấy có lưu hành PCV2 đàn lợn ni thành phố Hồ Chí Minh (trích theo 69 Nguyễn Thị Thu Hồng cs., 2010) Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu PCV2 bệnh 70 virus gây đàn lợn nuôi tỉnh miền Bắc hạn chế 71 Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích xác định biểu lâm 72 sàng, biến đổi bệnh lý chủ yếu lợn mắc hội chứng gày cịm sau cai sữa có liên quan đến 73 PCV2 đồng thời xác định tỷ lệ nhiễm PCV2 lợn nghi mắc hội chứng gày còm sau cai sữa Kết 74 giới thiệu báo cung cấp thông tin nhằm khẳng định tồn PCVAD 75 tỉnh, thành phố phía Bắc 76 II NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 77 2.1 Nguyên liệu 78 - Ba mươi chín lợn sau cai sữa nghi mắc hội chứng gày còm PMWS thu thập từ 16 trại 79 lợn tỉnh Hà Nội, Hịa Bình, Hải Dương Bắc Giang Toàn trại lựa chọn để 80 lấy mẫu chưa tiêm phòng vacxin phòng bệnh PCV2 gây 81 82 - Các mẫu bệnh phẩm lấy làm tiêu vi thể từ quan biểu bệnh tích đại thể điển hình bao gồm phổi, hạch lympho, thận gan 83 - Các hóa chất dụng cụ sử dụng kỹ thuật làm tiêu vi thể 84 - Chủng PCV2a PCV2b chuẩn Phịng thí nghiệm virus học, Trường đại học Thú 85 y, Đại học Quốc gia Seoul cung cấp 86 Hoá chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm: (1) dung dịch ly giải mẫu có chứa 27% 87 sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% 88 sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K; (2) phenol-chloroform-isoamyl alcohol 89 (25:24:1); (3) isopropyl; (4) cồn 70%; (5) dung dịch đệm TE (pH = 8) Sinh phẩm, hóa chất 90 dùng cho phản ứng nested PCR: (1) hot start PCR kit (i-StarMaster, iNtRON Biotechnology, 91 Korea); cặp mồi đặc hiệu dùng cho phát định type PCV2 lựa chọn dựa theo 92 nghiên cứu công bố trước (bảng 1) 93 Bảng Trình tự cặp mồi dùng chẩn đốn xác định genotype PCV2 Mồi xi/ngược Loại mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Đặc hiệu chung AGGGCTGTGGCCTTTGTTAC CV1/CV2 Đặc hiệu chung GAAGAATGGAAGAAGCGG VF2/VR2 2aF/2aR Đặc hiệu type 2a GGGTATAGAGATTTTGTTGGTC GCACCTTCGGATATACTGTC Đặc hiệu CACAGAGCGGGGGTTTGAGC TCTTCCAATCACGCTTCTGC CTCACAGCAGTAGACAGGT 2bF/2bR Kích Vị trí thước nucleotide (bp) 1329-1348 989 530-549 62-79 359 125 403-421 CCGTTACCGCTGGAGAAGGA Fenaux cs, 2000 Yang cs, 2003 1460-1481 1584-1603 1460-1481 172 type 2b Tài liệu tham khảo Kim cs, 2010 1633-1652 94 95 2.3 Phương pháp nghiên cứu 96 2.3.1 Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích lợn mắc chứng gày còm 97 - Lợn nghi mắc chứng gày còm sau cai sữa PMWS liên quan đến PCV2 theo dõi 98 triệu chứng mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể, đánh giá theo Opriessnig cộng (2007) 99 - Tiêu vi thể thực theo phương pháp thường quy với mẫu từ 100 quan nội tạng có biến đổi bệnh tích đại thể điển hình gồm phổi, hạch lympho, thận 101 gan 102 103 104 105 - Các quan gồm gan, hạch amidan, hạch lympho, thận, lách, phổi, ruột tiến hành đồng bảo quản -200C tách ADN Mẫu thu thập thời gian từ năm 2011 – 2012 2.3.2 Phương pháp tách ADN 106 Các bước chiết tách ADN tổng số từ huyễn dịch bệnh phẩm 10% gồm: (1) ly giải mẫu 107 (250 µl) dung dịch sucrose/proteinase K (500 µl) 560C/90 phút, (2) tách pha ADN 108 dung dịch phenol-chloroform-isoamyl (200 µl), (3) tủa ADN isoprpyl -200C/15 phút, (4) 109 tinh ADN cồn 70%, (5) cặn ADN hòa tan 30 µl dung dịch đệm TE Thao 110 tác ly tâm (12000 vòng/phút/15 phút/40C) lặp lại từ bước đến bước 111 2.3.3 Phương pháp nested PCR chẩn đoán định genotype PCV2 112 Các bước thực gồm: (1) tổng hợp sản phẩm PCR vịng ngồi sử dụng cặp mồi đặc 113 hiệu CV1/CV2 chung cho genotype; (2) xác định có mặt PCV2 với cặp mồi 114 VF2/VR2 chung cho genotype; (3) định type cặp mồi đặc hiệu genotype 2aF/2aR 115 (PCV2a) 2bF/2bR (PCV2b) Thành phần phản ứng PCR chuẩn bị theo hướng dẫn 116 nhà sản xuất Chu trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR chẩn đoán định type PCV2 117 Cặp mồi CV1/CV2 VF2/VR2 2aF/2aR 2bF/2bR Các giai đoạn phản ứng Tiền biến tính Biến tính Bắt mồi Kéo dài Kéo dài cuối Tiền biến tính Biến tính Bắt mồi Kéo dài Kéo dài cuối Tiền biến tính Biến tính Bắt mồi Kéo dài Kéo dài cuối Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Số vòng lặp 94 94 61 72 72 94 94 55 72 72 94 94 57 72 72 300 20 20 90 300 300 20 20 30 300 300 20 20 20 300 35 1 35 1 35 118 119 Sản phẩm PCR phân tích phương pháp điện di thạch agarose 1,5% có bổ 120 sung 0,5 µg/ml ethidium bromide 121 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 122 Số liệu xử lý chương trình Excel 2003; so sánh sai khác yếu tố 123 phép thử χ2 với phần mềm Minitab 14.0 phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1) 124 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 125 3.1 Kết thu thập mẫu 126 Tiêu chí quan trọng trình lựa chọn mẫu lợn sau cai sữa có 127 triệu chứng gày cịm so với lứa tuổi, lợn sống nuôi đàn Thông tin chi tiết 128 mẫu bệnh phẩm chúng tơi thu thập trình bày bảng Bảng 3: Thông tin chi tiết lợn nghi mắc PMWS thu thập 129 TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Tổng số mẫu (n) 11 17 Ký hiệu mẫu HN1 HN2 HN3 HN4 HN5 HN6 HN7 HN8 HN9 HD1 HD2 HD3 HD4 HD5 HD6 HD7 HD8 HD HD10 HD 11 BG1 BG2 BG3 BG4 BG5 BG6 BG BG8 BG9 BG10 BG11 BG12 BG 13 BG14 BG15 BG16 BG17 HB1 HB2 Địa điểm Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Hải Dương Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Hịa Bình Hịa Bình Tuổi lợn (tuần) 16 14 14 15 13 14 12 12 13 11 12 14 10 14 13 11 16 15 14 16 13 12 15 16 11 15 12 13 11 15 16 12 13 13 15 12 14 15 Khối lượng (kg) 35 15 18 20 13 16 21 17 20 13 17 22 15 15 12 12 14 11 20 20 30 20 15 20 20 12 23 15 19 11 26 31 15 11 13 14 14 17 15 130 131 Đã thu thập 39 lợn gày cịm từ 16 trại lợn ni địa phương, Hà Nội 132 (9 con, từ trại), Hải Dương (11 con, từ trại), Bắc Giang (17 con, từ trại) Hịa Bình (2 133 con, từ trại) Tất 39 lợn có khối lượng thấp so với tiêu sinh lý còi cọc 134 so với lợn lứa tuổi Một số lợn biểu gày cịm cịn có số biểu bệnh 135 lý khác viêm da, mắc hội chứng hô hấp tiêu chảy làm tăng thêm thiệt hại sức sản xuất 136 lợn 137 Tuổi lợn dao động từ – 16 tuần, có đến 38/39 (97,44%) lợn từ 11-16 tuần 138 tuổi; phù hợp với công bố Gillespie cộng (2009) lợn thường mắc PMWS lứa tuổi từ 139 -16 tuần 140 3.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích lợn nghi mắc PMWS 141 3.2.1 Triệu chứng lâm sàng Những lợn thu thập địa phương quan sát triệu chứng lâm sàng mổ khám 142 143 kiểm tra bệnh tích đại thể Kết trình bày bảng bảng 144 Qua kiểm tra triệu chứng lâm sàng, biểu lợn còi cọc lông khô, xơ xác chiếm tỷ 145 lệ cao (100%) Lợn có triệu chứng hơ hấp với tỷ lệ 89,74% Một số triệu chứng lâm sàng 146 khác lợn bao gồm tượng hoàng đản (15,38%); tiêu chảy (23,08%); triệu chứng thần kinh 147 (10,26%) viêm da (20,51%) (p