ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN Mã số: Đ2013-02-53 Chủ nhiệm đề tài: TS Bùi Xuân Đông Đà Nẵng, 12/2013 MỞ ĐẦU Trong nguyên liệu vỏ tôm, chitin liên kết chặt chẽ với protein, lipid chất khoáng (pha rắn) Việc thu nhận chitin từ nguồn nguyên liệu xây dựng đưa protein chất khống trạng thái lỏng (pha lỏng), từ loại bỏ chúng khỏi chitin Để sản xuất chitin đạt tiêu chuẩn chất lượng quốc tế cần loại bỏ hồn tồn protein khống chất, lipid Hiện phương pháp hóa học dùng phổ biến để thu nhận chitin cách sử hóa chất đậm đặc, tức xử lý nguyên liệu điều kiện “khắc nghiệt” (môi trường axit mạnh, bazơ mạnh, nhiệt độ cao thời gian kéo dài), thường dẫn tới làm giảm chất lượng chitin thương phẩm Các hư hỏng sản phẩm chitin thường gặp thu nhận theo phương pháp hóa học là: biến dạng cấu trúc phân tử, giảm độ nhớt dung dịch chitin chitosan Bên cạnh việc bảo quản sử dụng hóa chất có độ đậm đặc cao mà địi hỏi tiếp xúc trực tiếp công nhân gây nhiều quan ngại vấn đề bảo đảm an toàn sức khỏe cho người lao động Theo phương pháp hóa học thu nhận sản phẩm phân giải protein hỗn hợp axit amin tự hòa lẫn chất độc hại, chất độc hại sinh protein bị thủy phân sâu dẫn đến phân giải axit amin nên việc sử dụng sản phẩm dịch thủy phân gặp phải nhiều hạn chế, ví dụ khơng sử dụng thực phẩm hay sản xuất thức ăn chăn nuôi Các hướng sử dụng chitin dẫn xuất từ chitin thực tế năm gần không ngừng mở rộng dẫn tới cần tìm kiếm thử nghiệm phương pháp để thu nhận polymer sinh học Một vấn đề có tính thời cịn tồn nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu vỏ tơm tạo điều kiện thu hồi chitin tồn hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có nó, bên cạnh việc hướng tới phát triển bền vững sở giảm thiểu ô nhiễm môi trường Mục tiêu nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản nhằm thu sản phẩm như: chitin, chitosan sản phẩm phụ chất màu carotenoid chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chitin/chitosan Vỏ tôm, ghẹ, cua, mai mực nhiều loại vỏ giáp xác khác chiếm 15 tới 35% tổng khối lượng khai thác, nguồn nguyên liệu quý để điều chế hợp chất polymer tự nhiên – aminopolysaccharide (chitin chitosan), dẫn xuất chúng oligosaccharite glucosamine, sản phẩm ngày trở nên thiết yếu lĩnh vực khác Ví dụ: + sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm, hay thành phần thực phẩm chức + sử dụng làm chế phẩm y dược (để giảm cân, điều hòa áp huyết, giảm colesteron; chế phẩm chống ung thư loại thuốc kháng thể) + sử dụng mỹ phẩm để bảo vệ da tóc + sử dụng để làm nước đầm hồ tự nhiên nhân tạo (keo tụ hấp phụ hỗn hợp độc hại, loài vi khuẩn, kim loại nặng) + dùng chế phẩm nông nghiệp (các chế phẩm chữa bệnh cho động vật, chế phẩm chống lại bệnh cho thực vật) [21, 27] Chitin phân bố rộng rãi tự nhiên, với xellulo hợp chất hữu phổ biến bề mặt trái đất Nó nguồn tài nguyên dồi dào, ước tính vào khoảng 100 nghìn tỷ tấn/năm Nhưng khác với xellulo, chitin nguồn sinh khối tự nhiên khai thác Chitin lần Giáo sư khoa học tự nhiên, giám đốc vườn thực vật thuộc Viện hàn lâm khoa học TP Nensi (Pháp) – Henri Braconnot phát năm 1811 nghiên cứu thành phần nấm ông đặt tên “fungin” Năm 1823 A.Odier điều chế chitin từ cánh bọ cánh cứng đặt tên “chitin” (Tiếng Hy-lạp citwu- nghĩa áo) Còn chitosan lần phát năm 1859 nhà khoa học C Rouget, từ thời điểm giới khoa học bắt đầu nghiên cứu thực nghiệm sử dụng polymer Những cơng trình Nga, liên quan tới việc điều chế chitin thực đạo Viện sĩ P Sorugin năm 19341935 Các thử nghiệm sử dụng chitosan F Cadov thực năm 1941 Hiện nhằm mục đích phát triển nghiên cứu chitin/chitosan Nga có Hiệp hội liên bang chitin (The Russian chitin society: www.chitin.ru), thành lập từ năm 2000 Chitin poly (1,4) - acetamido - deoxy -  - D glucose Công thức cấu tạo chitin trình bày hình 1.1 Hình 1.1: Công thức cấu tạo chitin Liên kết  (1,4) glucoside mắt xích cấu tạo nằm lệch góc 1800 tạo nên mạch xoắn Liên kết bền, dễ bị cắt đứt tác nhân ion H+ axit Sự có mặt nhóm amino chitin làm cho chúng có đặc tính sinh học chuyên biệt tham gia phản ứng đặc trưng Chitin polymer có tính chất xác định, bao hàm khả bị phân hủy vi sinh vật có hoạt tính sinh học Nên chitin quan tâm nghiên cứu loại vật liệu chức đặc biệt Điều khác biệt chitin so với polysaccharide khác phân tử chitin tích điện dương mạnh, giúp cho chitin tạo liên kết với phân tử mang điện tích âm bề mặt Trong nguyên liệu khác chitin có khác biệt thành phần cấu tạo hàm lượng chitin khác [12, 21, 25] Chitin chuyển hóa thành nhiều dẫn xuất khác nhau, hay hặp chitosan Chitosan poly (1,4) -2-amino-2-deoxy-β-D-glucan Nó tạo thành N-deacetyl phân tử chitin, có cơng thức cấu tạo hình 1.2 Chitosan có số ưu việt so với chitin, kể đến tính tan nước dung dịch acid Khối lượng phân tử chitosan phụ thuộc vào điều kiện xử lý chitin hay vỏ tôm, thông thường từ 10 đến 1000 kDal Đơn vị phần trăm độ deacety xác định mức độ deacetyl (đây tỉ lệ khối lượng glucosamine so với số monomer chung phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thường từ 70-90% Hình 1.2 – Công thức cấu tạo chitosan Do đặc trưng cấu tạo nên chitin chitosan có tính chất đặc trưng nhóm amino (-NH) nhóm hydroxyl (-OH) Chúng có khả liên kết với nhiều kim loại nặng tạo nên hợp chất gọi chelate Chitin có đặc tính hoạt hóa thấp phân tử chitin có hai nhóm hydroxyl mắt xích (monomer) tham gia vào phản ứng hóa học Chitosan nhờ có nhóm amino tự nên có lượng tự lớn, tạo điều kiện cho chitosan hòa tan dung dịch acid hữu số acid vơ Ngồi ra, polymer cịn bị thủy phân chứa liên kết glucoside liên kết peptide Có thể dễ dàng tạo nhóm ưa nước cách biến tính chitin/chitosan, nên mở khả mơ hình hóa tính chất chúng Chitin có trạng thái tinh thể là: α, β γ – chitin Phổ biến bền vững α-chitin, phân tử có liên kết đối song song, nhờ liên kết hydro Phân tử β γ – chitin bền vững gặp Chitosan tồn dạng tinh thể, tạo polymer chitosan phụ thuộc vào trạng thái vật lí Chitin/chitosan bền vững tác dụng kiềm, bị thủy phân tác dụng acid Khi bị thủy phân hoàn toàn dung dịch acid HCl acid sunfuric nhiệt độ cao chitin chitosan bị thủy phân đến monosaccharide-D-glucosamine Ở điều kiện mềm tạo thành hỗn hợp oligosaccharide Dung dịch HCl thường dùng để thủy phân phần, sản phẩm tạo trực tiếp glucosamine từ đoạn oligosaccharide với khả polymer hóa 2-4 Xử lý siêu âm làm phân hủy chitin chitosan Sự thủy phân liên kết glucoside phân tử chitin/chitosan tác dụng yếu tố khác (oxy hóa, xử lý nhiệt) làm đứt mạch polymer chúng, làm giảm khối lượng phân tử, tăng khả hịa tan, tính chất thường ứng dụng để điều chế dung dịch, sau dùng vào mục đíc khác Sự thủy phân liên kết amid (peptit) chitin tạo chitosan Về ngun tắc khơng có danh giới rõ rang chitin chitosan Ở trạng thái tự nhiên chitin có số nhóm amino tự (5-15%) Thơng thường chitosan cho sản phẩm, hịa tan dung dịch acid hữa loãng (như acid acetic), tương ứng với độ deacetyl không 55-60%.Sự thủy phân liên kết peptide dung dịch acid bazơ tác dụng enzyme (chitosanase) Một phương pháp deacetyl với hiệu xuất cao thường thủy phân bazơ mạnh Quá trình deacetyl làm biến đổi cấu trúc polymer, dẫn đến làm giảm khối lượng phân tử polymer Trong tự nhiên chitin/chitosan bị phân giải nhiều sinh vật khác nhau, chúng có khả sinh enzyme chitinase chitosanase Phần lớn enzyme chitinase vi sinh vật thủy phân liên kết N-acetyl-β-(1,4)-glucosamin theo chế khác Chitinase thực vật bậc bao khơng có chitin thành phần cấu tạo Enzyme chitosanase thủy phân chitosan chế cắt endo Như chitosan bị phân giải tác động nhiều chế phẩm enzyme khác glycanase, lipase protease từ nguồn khác Enzyme cellulose T viride phân giải chitosan đến chitooligosacharide Enzyme papain xúc tác thủy phân chitosan làm giảm độ nhớt chitosan Xử lý chitin enzyme thủy phân mở khả sản xuất N-acetyl-D-glucosamin enzyme chitinase Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm N-acetyl lên q trình thủy phân với lysim chứng minh rằng, độ deacetyl tối ưu 0,7, thu đoạn oligosaccharide đến tetramer Oligosaccharide có độ dài polymer từ 2-8 ứng dụng phụ gia thực phẩm, thành phần chế phẩm y dược điều chế cách phân giải chitosan enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus № 7-M bền pH từ 5-11 Chitosan hòa tan điều chế phương pháp enzyme sau: xử lý chitosan với độ deacetyl 60-90% enzyme chitosanase môi trường acid nhiệt độ 30-60 0C Sản phẩm thu nhận được, tách phương pháp siêu âm, có khả hịa tan nước [21,25] 1.2 Tổng quan vi khuẩn Bacsillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc giới Bacteria, ngành Firmicuter, lớp Bacili, Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, lồi subtilis Năm 1835, vi khuẩn tìm đặt tên Vibrio subtilis Christian Gottfried Ehrenberg Đến năm 1872 Ferdinand Cohn đổi thành Bacillus subtilis Bacillus subtilis loại trực khuẩn gram dương, có hình que đứng riêng lẽ kết thành chuỗi thành sợi có khả sinh ngoại bào tử Ngoại bào tử hình thành gặp điều kiện bất lợi môi trường thiếu hụt thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ cao, sản phẩm phụ tạo thành môi trường ức chế hoạt động vi khuẩn, Bào tử tồn môi trường thời gian dài gặp điều kiện thuận lợi trở lại, nảy mầm hình thành nên tế bào vi khuẩn Vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính proteaza amilaza, có khả phân huỷ nhiều dạng hợp chất hữu đặc biệt protein tinh bột Trước đây, người ta nghĩ loại trực khuẩn hiếu khí bắt buộc, điều khơng xác Trong điều kiện yếm khí vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển, có điều kiện hiếu khí Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển 35 – 450C (môi trường nuôi cấy kà 370C) nhiệt độ tối đa 600C Mơi trường có pH 4,5 chúng ngừng phát triển [4] Vi khuẩn tìm thấy phổ biến tự nhiên, nhiều cỏ khơ, cịn gọi trực khuẩn cỏ khơ Dưới hình ảnh vi khuẩn Bacillus subtilis soi kính hiển vi sau nhuộm gram hình ảnh khẩn lạc thu nhận sau ni cấy (hình 1.3) Hình 1.3 - Vi khuẩn Bacillus subtilis sau Hình 1.4 - Hình ảnh đĩa khuẩn lạc nhuộm gram vi khuẩn Bacillus subtilis Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, mép viền cưa, bề mặt khuẩn lạc không nhẵn bóng mà nhăn có nếp gấp nhỏ (hình 1.4) Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu: Nguyên liệu sử dụng bao gồm: a) Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập giữ giống phịng thí nghiệm CNSH - Khoa Hoá - trường Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng; b) Vỏ tôm (gồm phần đầu vỏ) thu nhận từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến xuất thủy sản Thọ Quang – TP Đà Nẵng Phụ phẩm sau thu nhận từ nhà máy chế biến thủy sản sấy cho khơ rịn nhiệt độ 40 C nghiền nhỏ bảo quản làm nguồn nguyên liệu thu nhận chitin, sau từ chitin thu nhận chitosan Trong nghiên cứu nguyên liệu vỏ tôm thu nhận từ hai loại tôm phổ biến chế biến địa bàn TP Đà Nẵng tôm sú (tiger shrimp – Penaeus monodon Fabricius) tôn thẻ chân trắng (White Shrimp - Penaeus vannamei) Các thí nghiệm tiến hành hỗn hợp loại đầu vỏ tơm b a Hình 2.1 – Sự khác số nguyên liệu tôm, vỏ chúng dùng để thu nhận chitin/chitosan a) Tôm sú; b) tôm thẻ chân trắng c) Nội tạng cá để thu nhận chế phẩm enzyme protease thu gom từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến xuất thủy sản Thọ Quang Nguyên liệu hỗn hợp nội tạng hai loài cá: cá nục sò (Decapterus maruadsi) cá nục dài (Decapterus lajang Bleeker) – thức ăn chủ yếu chúng lồi động vật: chân chèo (Copepoda), có vỏ (Ostracoda), lưỡng túc (Amphipoda) [Nguyễn Nhật Thi, 1991] Do đặc điểm thức ăn nên nội tạng chúng chứa nhiều enzyme nhóm protease, phân giải thức ăn giàu protein Tạo điều kiện cho việc tách chiết chế phẩm enzyme protease Nội tạng cá sau thu nhận từ nhà máy rửa sạch, xử lý nước muối 5%, sau bảo quản đơng lạnh nhiệt độ -220C phục vụ thu nhận chế phẩm enzyme protease 2.1.2 Hoá chất thiết bị: Hoá chất chính: - Các hố chất tinh khiết : HCl đậm đặc, Foocmol 40%, cồn tuyệt đối, KOH 0,01N, H2SO4… - Các thị màu : thimolphtalein, phenolphtalein… - Pepton, casein, cao thịt, cao nấm… - Và hóa chất phục vụ thí nghiệm phân tích khác Thiết bị: - Tủ ổn nhiệt, máy lắc, thiết bị tiệt trùng, tủ lạnh đông, tủ cấy vô trùng - Thiết bị li tâm - Thiết bị cô đặc chân không - Thiết bị phân tích đạm Kjeldahl - Và thiết bị thơng dụng phịng thí nghiệm CNSH khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Bên cạnh phương pháp cơng nghệ sinh học, số phương pháp phân tích hóa sinh chủ yếu dùng nghiên cứu sau: -Hàm lượng lipid (%), protein (%), tro (%) hàm lượng nước (%) xác định theo GOST 7636-85 (LB Nga) -Hàm lượng khống phân tích theo chuẩn AOAC (1990) - Phương pháp xác định N-formon theo Sorensen - Hoạt độ enzyme, chế phẩm enzyme protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến - Phương pháp xác định QMAFAM (CFU/g) theo GOST 10444.15 – 94 (LB Nga) - Độ khử khống vỏ tơm xác định theo công thức KK=[(mK1-mK2)/mK1]x100%; mk1, mk2-hàm lượng chất khoáng ban đầu sau khử khoáng vỏ tôm -Độ khử protein vỏ tôm xác định theo công thức KK=[(mP1-mP2)/mP1]x100%; mP1, mP2-hàm lượng protein ban đầu sau khử protein vỏ tôm -Độ deacety sản phẩm chitosan xác định theo tỉ lệ khối lượng glucosamine so với số monomer chung phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thường từ 70-90% -Độ nhớt chitosan xác định nhớt kế Roto Brookfield 2.3 Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu trung bình ba lần phân tích Kết phân tích thống kê phần mềm Minitab Professional v16.1.0.0 Giá trị p < 0,05 xem có ý nghĩa mặt thống kê 2.4 Sơ đồ mô hình thí nghiệm (hình 2.2) o Tính chất vật lí hóa học chitin/chitosan Tổng quan nghiên cứu nước chitin/chitosan Các phương pháp thu nhận chitin: hóa học, sinh học Ứng dụng vi khuẩn B subtilis sản xuất chitin Phương pháp thu nhận chitosan Các lĩnh vực ứng dụng chitin/chitosan Xây dựng mơ hình thí nghiệm giải vấn đề cần nghiên cứu đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ đầu tơm Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt độ enzyme nội tạng cá Khử màu vỏ đầu tôm Tách chiết enzyme protease từ nội tạng cá Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy khả sinh protease B.subtilis Khử khoáng vỏ đầu tôm Nghiên cứu khử protein đầu vỏ tôm Khử protein chế phẩm enzyme protease, tách chiết từ nội tạng cá Khử protein chế phẩm enzyme protease Khử khoáng lần Đánh giá chất lƣợng chitin Chitin Chitosan Hình 2.2 – Sơ đồ mơ hình bƣớc thực nghiên cứu Đánh giá chất lƣợng chitosan Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học vỏ tôm, nguyên liệu nội tạng cá phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá 3.1.1 Thành phần hóa học số nguyên liệu chứa chitin, phổ biến thành phố Đà Nẵng Phân tích thành phần hóa học vỏ tơm sau sấy khô nhiệt độ 400C nhận thấy hàm lượng chitin tương đối cao từ 33-35% tổng khối lượng vỏ tôm khô nên vỏ tôm nguyên liệu giàu chitin Bên cạnh hàm lượng protein 12-14%, địi hỏi cần có biện pháp phù hợp để loại bỏ khỏi nguyên liệu để thu hồi chitin tinh Đồng thời hàm lượng chất khoáng cao 37-40% tổng khối lượng nguyên liệu, nên cần sử dụng phương pháp loại khoáng độ pH phù hợp để đạt hiệu suất tốt thu nhận chitin/chitosan Bảng 3.1 Thành phần hóa học ngun liệu vỏ tơm STT Loại ngun liệu Vỏ tơm sú Thành phần hóa học, % Protein Lipid Chất khoáng Chitin Nước 14±1,3 1,5±0,2 37±1,9 33±1,2 14,5±1,9 Vỏ tôm thẻ 12±1,2 0,4±0,1 40±2,1 35±2,5 12,6±1,7 chân trắng Hỗn hợp vỏ tôm sú vỏ 13±1,6 0,95±0,5 38,5±2,4 39,5±1,6 8,05±1,5 tơm thẻ chân trắng Ngồi ra, hàm lượng lipid hỗn hợp vỏ tôm sú vỏ tôm thẻ chân trắng gần 1%, lipid chứa chất màu đặc trưng vỏ tôm carotenoid, carotenoid gây ảnh hưởng đến chất lượng chitin tính cảm quan, tận dụng chất màu để ứng dụng công nghiệp thực phẩm 3.1.2 Kết xác định thành phần hóa học nguyên liệu nội tạng cá Các kết thí nghiệm xác định thành phần hóa học nghun liệu dùng để tách chiết chế phẩm enzyme protease trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 - Thành phần hóa học nguyên liệu nội tạng cá Nguyên liệu Protein 12±1,0 11±1,2 Hàm lƣợng, % Lipid Nước 16,36±1,3 70±2,0 17,4±1,6 67±1,4 Tro Nguyên liệu tươi 1,64±0,2 Nguyên liệu đông 2,6±0,4 lạnh Từ bảng 3.2 ta thấy sau trình bảo quản lạnh đông hàm lượng nước nguyên liệu giảm xuống, nguyên nhân khả giữ nước nguyên liệu giảm Hàm lượng protein bị giảm từ 12% xuống 11%, nguyên nhân protein bị phân giải tác dụng vi sinh vật bị thất thoát tiến hành giã đơng ngun liệu 10 Hình 3.9 – Sự phụ thuộc độ khử protein vào nồng độ chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Từ đồ thị xác định nồng độ chế phẩm enzyme tối ưu để thực trình thủy phân 0,45 – 0,5 % tính theo khối lượng hỗn hợp phản ứng Phản ứng enzyme phụ thuộc vào nhiệt độ nên tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ lên độ khử protein nguyên liệu, kết thể hình 3.10 Hình 3.10 - Ảnh hƣởng nhiệt độ lên phản ứng enzyme thủy phân protein nguyên liệu Phân tích liệu từ đồ thị nhận thấy rằng, tăng nhiệt độ q trình khử protein vỏ tơm từ 30 lên 500C tốc độ phản ứng enzyme tăng thời điểm thứ 30-36, tương ứng với độ khử protein từ 70 -72% Trong trình tiến hành phản ứng enzyme khử protein nhiệt độ 600C độ thủy phân protein sau 54 đạt 50%, giảm độ khử protein giải thích q trình biến 18 tính phần protein chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Như nhiệt độ tối ưu để tiến hành q trình khử protein xác định 400C Theo nghiên cứu Hamzazade A.I enzyme protease khơng có khả loại bỏ protein dạng cấu trúc nằm lớp chitin (Hamzazade, 2002), nên để loại bỏ hồn tồn nhóm protein cần thực bước rửa chitin kiềm sau thực phản ứng khử protein 3.4.3 Kết đánh giá chất lượng chitin thu nhận phương pháp ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá Để đánh giá chất lượng chitin dùng phương pháp đánh giá cảm quan xác định thành phần hóa học chitin thành phẩm Kết xác định trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 – Một số tiêu chất lƣợng chitin sản xuất phƣơng pháp ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá Chỉ tiêu Kết Màu sắc Màu trắng Hàm lượng nước, % 7,8-8,0 Hàm lượng protein, 0,4-0,6 Hàm lượng chất khoáng, % 0,3-0,4 QMAFAM , CFU/g 3,3˟102 Chitin thu có màu trắng tự nhiên, hàm lượng nước 7,8-8,0%, hàm lượng protein 0,40,6% hàm lượng chất khoáng chiếm 0,3-0,4% Đánh giá độ an tồn thơng qua tiêu vi sinh vật tổng số (QMAFAM, CFU/g) phù hợp với yêu cầu chất lượng tiêu chuẩn chitin quốc tế SanPin 2.3.2.1078-01 (của LB Nga) 3.4.4 Đánh giá chất lượng chitosan sản xuất từ chitin tách chiết cách ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Trên sở nguồn chitin thu nhận có hàm lượng protein 1%, hàm lượng khống 0,5% chúng tơi thực q trình deacetyl theo phương pháp hành ứng dụng Việt Nam số nước giới Quá trình deacetyl tiến hành dung dịch NaOH 50% nhiệt độ 90-1350C giờ, tỷ lệ chitin : NaOH 1:3 – 1:5 Chitosan thu sau trình deacetyl rửa nước lọc sấy khơ nhiệt độ 55-600C Trong bảng 3.5 trình bày kết đánh giá chất lượng chitosan Bảng 3.5 – Một số đặc điểm chất lƣợng chitosan thu nhận từ chitin tách chiết từ vỏ tôm ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá Chỉ tiêu chất lƣợng Đặc điểm sản phẩm chitosan Độ deacetyl, % 79-80 Độ nhớt [η], dl/g 14,9 - 18 Hàm lượng, % Nước 8,7 Chất khống 0,2 Các chất khơng hịa tan 0,3 Hiệu suất thu hồi chitosan từ chitin theo phương pháp nghiên cứu đạt 84-86% so với khối lượng chitin khô Chất lượng chitosan phù hợp với nhiều công bố khoa học [12, 18, 30] 19 3.4.5 Kết nghiên cứu xử lý loại phế thải sinh trình xử lý nguyên liệu thành chitin/chitosan Trong trình sản xuất chitin tạo thành sản phẩm phụ pha rắn pha lỏng Pha rắn phần protein chưa thủy phân hết tạo thành tách chiết enzyme protease Pha lỏng bao gồm: dung dịch axit tạo thành sau q trình khử khống; dịch thủy phân sau q trình khử protein; dung dịch bazơ trình deacetyl Đặc điểm thành phần hóa học trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 – Một số đặc điểm phế thải rắn lỏng Loại phế liệu Phần chưa bị thủy phân Dung dịch axit Dịch thủy phân Dung dịch bazơ Phần protein chưa Hàm lƣợng, % tro protein 0,6-0,7 13,1- 13,8 pH 5,5-6 3-3,5 2,5-3 14 bị thủy phân nước 80-84 lipid 0.8-1 97-97,5 2,5-2,9 0,5-0,6 0,03 89-90 0,3 -0,35 8-8,5 0,5-0,6 97-98 0,5-0,6 0,8-0,8 0.05 sau q trình tách chiết chế phẩm enzyme protease tận dụng để sản xuất thức ăn gia súc.Phần dung dịch chứa chất dinh dưỡng từ hỗn hợp dịch thủy phân nghiên cứu biện pháp thu hồi nghiên cứu tiếp theo, nhằm mục đích sử dụng nuôi cấy vi sinh vật 3.5 Kết nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B subtilis để loại bỏ protein nguyên liệu vỏ tôm 3.5.1 Kết nghiên cứu nhằm chuẩn bị giống vi khuẩn Bacillus subtilis Để sử dụng giống vi khuẩn B Subtilis xử lý vỏ tôm theo quy tắc công nghệ sinh học cần trải qua số bước cố định: hoạt hóa giống – để hoạt hóa giống chúng tơi tìm độ pha lỗng tối ưu 10-5, sau 24 nuôi cấy môi trường hoạt hóa có chứa cao thịt, cao nấm, pepton NaCl (phụ lục 2) nhận thấy mật độ khuẩn lạc nhiều mọc riêng rẽ, hoàn toàn phù hợp cho yêu cầu thí nghiệm (bảng 3.7) Sau chọn độ pha lỗng phù hợp để hoạt hóa vi khuẩn tiến hành kiểm tra hoạt lực sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis cách sử dụng phương pháp đo vòng thủy phân dựa khả bắt màu thuốc thử Amido-black với protein mà không bắt màu với acid amin (phụ lục 4) STT Bảng 3.7 - Mật độ khuẩn lạc ni cấy mơi trƣờng hoạt hố với độ pha loãng khác Độ pha loãng Số khuẩn lạc đếm đƣợc 10-1 Khuẩn lạc mọc nhiều, tràn đĩa thạch, khuẩn lạc mọc dính 10-2 Các khuẩn lạc mọc nhiều, đa số khuẩn lạc mọc dính liền nhau, có số mọc riêng rẽ 10-3 127 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cụm khuẩn lạc mọc liền 10-4 80 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cụm khuẩn lạc mọc dính liền vào 10-5 17 khuẩn lạc mọc riêng rẽ -6 10 khuẩn lạc mọc riêng rẽ 10-7 Khơng có khuẩn lạc mọc 10-8 Khơng có khuẩn lạc mọc 20 Sau nhuộm quan sát thấy chung quanh khuẩn lạc xuất vòng thuỷ phân màu sáng, vùng mơi trường cịn lại có màu xanh đậm thuốc nhuộm hình 3.11 Hình 3.11 - Đĩa khuẩn lạc sau nhuộm thuốc nhuộm Amido-Black Để chọn vi khuẩn có hoạt tính mạnh, chúng tơi tiến hành đo đường kính vịng thuỷ phân sáu khuẩn lạc Đường kính vịng thuỷ phân tính hiệu số đường kính ngồi vịng thủy phân (D) đường kính khuẩn lạc (d) Kết đo bảng 3.8 Bảng 3.8 - Đƣờng kính vịng thuỷ phân khuẩn lạc Mẫu khuẩn lạc M1 M2 M3 M4 M5 M6 D - d (mm) 2,8 2,0 1,4 0,8 1,8 1,2 Kết cho thấy vòng thuỷ phân khuẩn lạc M1, M2, M5 lớn nhất, vòng thuỷ phân khuẩn lạc M4 nhỏ Chúng giữ giống ba chủng M1, M2, M5 Riêng chủng M1 có đường kính vịng thuỷ phân lớn chọn để nhân giống cho thí nghiệm Dịng vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính mạnh sau chọn lựa tiến hành nhân giống cấp1 Dựa theo thành phần môi trường khảo sát TS Đỗ Thị Bích Thuỷ (Luận án tiến sỹ năm 2001), chúng tơi sử dụng mơi trường có bổ sung cao nấm, cao men, pepton muối (phụ lục 5) Thành phần mơi trường có chứa nhiều chất dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn B subtilis sinh trưởng phát triển Chủng M1 vào cấy vào môi trường ni 35oC 24 máy lắc thu canh trường giống cấp Đã kiểm tra độ khiết chủng Bacillus subtilis cách quan sát kính hiển vi đồng thời kiểm tra hoạt lực sinh tổng hợp enzyme giống cấp (hình 3.12 3.13) 21 Hình 3.12 - Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis soi dƣới kính hiển vi Hình 3.13 - Vòng thuỷ phân vi khuẩn Bacillus subtilis sau nhân giống cấp Từ kết thu quan sát kính hiển vi chúng tơi thấy vi khuẩn đồng nhất, khơng có vi khuẩn lạ xuất chứng tỏ giống cấp không bị nhiễm vịng thuỷ phân thu có kích thước đường kính lớn đạt yêu cầu cho thí nghiệm Hình 3.14 - Vịng thuỷ phân vi khuẩn Bacillus subtilis sau nhân giống cấp Chúng tiến hành nhân giống cấp từ nguồn giống cấp thu nhận cách môi trường nhân giống cấp giảm tỷ lệ thành phần chất giàu dinh dưỡng pepton, cao thịt, cao nấm bổ sung thêm tinh bột vỏ tôm khô nghiền nhỏ vi khuẩn làm quen dần nhằm mục đích xử lý phế liệu vỏ tơm q trình tách chiết chitin Môi trường sau khử trùng để nguội, chúng tơi bổ sung thêm 10% thể tích giống cấp 1, nuôi máy lắc 35oC 24 Giống cấp thu được kiểm tra khả sinh tổng hợp enzyme protease, kết thu hình 3.14 22 Kết thu cho thấy vòng thuỷ phân giống cấp lớn so với vòng thuỷ phân giống cấp Điều giải thích chất dinh dưỡng môi trường nhân giống cấp dạng đơn giản có khối lượng phân tử thấp phù hợp cho vi khuẩn B subtilis hấp thụ Cịn mơi trường nhân giống cấp 2, chất dinh dưỡng đơn giản dạng cao phân tử nên vi khuẩn B subtilis hấp thụ hết chúng buộc phải tiết thêm nhiều enzyme để phân huỷ tinh bột vỏ tơm với mục đích bổ sung thêm chất dinh dưỡng cho nhu cầu sống chúng Với dẫn liệu khoa học thực nghiệm độ lớn đường kính vịng thuỷ phân đến kết luận giống cấp thu hoàn toàn đáp ứng việc ứng dụng để phân giải protein 3.5.2 Kết ứng dụng Bacillus Subtilis để loại bỏ protein vỏ tôm Các nghiên cứu nước chứng minh rằng, vi khuẩn Bacillus subtilis lồi vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện ưa ấm Nhằm mục đích tìm điều kiện tối ưu cho vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng phát triển tốt sinh nhiều enzyme protease có hoạt lực mạnh phục vụ cho mục đích loại protein vỏ tơm, chúng tơi tiến hành xây dựng 12 mơ hình thí nghiệm để khảo sát mức độ thủy phân protein vỏ tôm phơi khô nghiền nhỏ với tỉ lệ giống bổ sung khác 10% ,20%, 30% với mức nhiệt độ 35 oC, 42oC, 48oC, 54oC, 35 Để đảm bảo cho vỏ tôm tiếp xúc trực tiếp tồn diện dịch chứa vi khuẩn đồng thời có đủ oxy để đảm bảo cho vi khuẩn hô hấp, phát triển cho vỏ tôm nghiền nhỏ vào bình tam giác 250 ml đổ ngập dịch chứa tỉ lệ giống tương ứng sục khí Theo mơ hình thí nghiệm thăm dị nhằm loại bỏ protein vỏ tôm theo cách trên, tiến hành thí nghiệm phân tích độ thuỷ phân protein nhiệt độ 48oC với hàm lượng giống vi khuẩn B subtilis 20% dựa thay đổi màu sắc dung dịch, độ đục Hàm lượng đạm hoà tan xác định sau thuỷ phân kết trình hình 3.15 Hình 3.15 – Sự thay đổi hàm lƣợng đạm hịa tan môi trƣờng chứa vi khuẩn B Subtilis vỏ tôm nhiệt độ 480C Từ kết nghiên cứu chứng minh chủng Bacillus subtilis sinh trưởng phát triển mạnh sinh nhiều enzyme protease xúc tác q trình thủy phân protein vỏ tơm phơi khơ nghiền nhỏ Trong trình thủy phân quan sát thấy hỗn hợp phản ứng có tạo bọt khí với số lượng nhỏ, điều lí giải protein bị thủy phân tạo axit amin tự làm giảm pH môi trường phản ứng, môi trường pH thấp tạo điều kiện cho q trình khử 23 khống có vỏ tơm tạo bọt khí Thí nghiệm chứng minh nhiệt độ 480C điều kiện tốt cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn B subtilis Tuy nhiên để khẳng định điều cần có thí nghiệm khảo cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên trình thủy phân 3.5.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ giống lên độ thủy phân Để khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ giống lên trình thủy phân chúng tơi tiến hành thủy phân protein vỏ tôm với tỉ lệ giống bổ sung 10%, 20% 30% theo thể tích, thí nghiệm tiến hành nhiệt độ chọn trước 480C Sau nuôi cấy vi khuẩn B subtilis, định kì lấy mẫu chuẩn độ phương pháp phooc-môn, thu kết hình 3.16 Hình 3.16 - Hàm lƣợng đạm hòa tan thu đƣợc thủy phân protein vỏ tôm với tỉ lệ bổ sung giống khác 480C Theo đồ thị, nhìn chung lượng đạm hoà tan thu ba mẫu thí nghiệm với tỷ lệ giống bổ sung 10%, 20%, 30% theo thể tích sau khoảng thời gian khác có xu hướng tăng Ở mẫu thí nghiệm bổ sung 10% giống, giai đoạn đầu hàm lượng đạm hồ tan chuẩn tăng mạnh, có lúc vượt qua mẫu chứa lượng giống 20%, 30% Tuy nhiên, bắt đầu thứ 24 – 27, lượng đạm hoà tan thu lại tăng chậm dần đến cuối thí nghiệm lượng đạm thu thấp so với mẫu lại khoảng 0,4 mg/ml Với mẫu thí nghiệm bổ sung 20% 30% giống, mức độ thuỷ phân tăng đồng Mặc dầu giai đoạn cuối lượng đạm thu mẫu chứa 30% giống cao so với mẫu chứa 20% giống tỷ lệ lớn không đáng kể xét hiệu phân huỷ protein vấn đề kinh tế chúng tơi chọn tỷ lệ giống cấp cho q trình thuỷ phân 20% 3.5.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên độ thủy phân protein vỏ tôm 24 Với tỷ lệ giống vi khuẩn B subtilis thích hợp 20% chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình thủy phân protein Quá trình thủy phân tiến hành mức nhiệt độ: 350C, 420C, 480C 540C Sau ni, định kì lấy mẫu chuẩn độ phương pháp phooc-môn, thu kết đồ thị hình 3.17 Hình 3.17 – Sự phụ thuộc trình thủy phân protein vỏ tơm vào nhiệt độ Phân tích số liệu thông qua đường cong đồ thị 3.17 rút số nhận xét sau: Ở nhiệt độ 35oC lượng đạm thuỷ phân khoảng thời gian 17 đầu tăng, tỷ lệ đạm hoà tan cao so với hàm lượng đạm hồ tan thu 54oC lại khơng với tỷ lệ thu mức độ phân huỷ nhiệt độ 42oC 48oC; Ở mức nhiệt độ 42oC, giai đoạn đầu, hàm lượng đạm hoà tan thu có tăng lên sau thứ 21 hàm lượng đạm hồ tan khơng tăng có xu hướng giảm xuống Điều nhiệt độ thích hợp cho nhiều vi sinh nhiễm tạp khác nên sau thời gian nuôi cấy, chủng B subtilis bị ức chế kìm hãm hoạt động vi sinh vật khác; Ở nhiệt độ 48oC, 14 đầu, hàm lượng đạm hoà tan thu có thấp so với mẫu ni 42oC Tuy nhiên sau hàm lượng đạm hồ tan tăng lên rõ rệt vượt qua mẫu lại Như chúng tơi trình bày trên, chủng B subtilis lồi ưa ấm Mức nhiệt độ 48oC ức chế nhiều loại vi sinh vật nhiễm tạp khác lại nhiệt độ phù hợp cho chủng B subtilis sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme Mặc khác, theo nhiều tài liệu nghiên cứu nhiệt độ 48oC nằm khoảng nhiệt độ tối thích cho enzyme protease hoạt động Do lượng protein bị thuỷ phân mức nhiệt độ cao; Ở nhiệt độ 54oC hàm lượng đạm hoà tan thu không đáng kể yếu ba mức nhiệt độ cịn lại nhiều Điều mức nhiệt độ cao nên ức chế sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis 25 Từ kết thu chứng minh mức nhiệt độ 48oC nhiệt độ tối ưu cho q trình phân giải protein vỏ đầu tơm enzyme protease chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Bên cạnh đó, từ đồ thị hình 3.6; 3.7; 3.8 chúng tơi nhận thấy thời gian kéo dài lượng đạm bị thuỷ phân sinh tăng dần, nhiên trình thủy phân protein có xu hướng chậm lại sau lên men 32 Nếu tiếp tục kéo dài thời gian phản ứng hiệu thủy phân protein tăng khơng đáng kể điều kéo dài thời gian sản xuất nên chọn thời gian thuỷ phân tối ưu 32 3.5.2.3 Kết xử lý vỏ tôm sau trình thủy phân vi khuẩn B subtilis Phần vỏ tôm sau loại protein rửa nước, phơi khô, cân trọng lượng Sản phẩm vỏ tôm loại protein mà thu có màu hồng nhạt, có độ mềm định, nhiên phần mắt tơm cịn màu đen cịn lượng nhỏ protein vỏ tơm chưa thuỷ phân triệt để Sản phẩm chúng tơi tiến hành loại khống dung dịch acid HCl 1M Sản phẩm sau rửa sạch, phơi khơ cân trọng lượng So sánh giảm khối lượng mẫu xử lý sau cơng đoạn loại protein loại khống phương pháp sinh học phương pháp hoá học (bảng 3.9) Bảng 3.9 - Sự giảm khối lƣợng vỏ tôm qua công đoạn Cách xử lý Khối lƣợng vỏ tôm ban đầu Phương pháp sinh học Phương pháp hố học 100 (g) 100 (g) Khối lƣợng cịn lại sau loại protein 69 (g) 53 (g) Khối lƣợng cịn lại sau loại khống 48 (g) 36 (g) Dựa vào kết thu bảng 3.9 nhận thấy hiệu phân huỷ protein enzyme protease Bacillus subtillis vỏ tôm ban đầu thấp so với xử lý NaOH, màu sắc sản phẩm sau phơi khô không sáng đẹp Để đánh giá chất lượng chitin dùng phương pháp đánh giá cảm quan xác định thành phần hóa học chitin thành phẩm Kết xác định trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 – Một số tiêu chất lƣợng chitin sản xuất phƣơng pháp ứng dụng vi khuẩn B subtilis Chỉ tiêu Kết Màu sắc Hàm lượng nước, % Hàm lượng protein, Hàm lượng chất khoáng, % QMAFAM‫ ٭‬, CFU/g Màu hồng nhạt 7,8-8,0 0,4-0,6 0,3-0,4 3,3˟105 Quá trình deacetyl tiến hành dung dịch NaOH 50% nhiệt độ 90-1350C giờ, tỷ lệ chitin : NaOH 1:3 – 1:5 Chitosan thu sau trình deacetyl rửa nước lọc sấy khơ nhiệt độ 55-600C 26 Trong q trình sản xuất chitin/chitosan cần xử lý dịch thủy phân chứa enzyme sinh hai công đoạn lên men deacetyl có đặc điểm khác độ pH Chúng tiến hành thu gom hỗn hợp dịch thủy phân, sau khuấy gia nhiệt 100 độ C phút để thu hồi nguồn protein bị biến tính tạo thành kết tủa nhiệt độ cao Nguồn protein cô đặc hướng tới sử dụng làm thức ăn chăn nuôi 3.6 So sánh chất lƣợng chitosan sản xuất theo phƣơng pháp hóa học ứng dụng công nghệ sinh học Từ kết xác định số tiêu chất lượng chitosan bảng 3.11 nhận thấy chitosan sản xuất theo công nghệ ứng dụng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá ứng dụng vi khuẩn B subtilis có độ deacetyl độ nhớt cao so với chitosan sản xuất theo phương pháp hóa học Tuy nhiên trình bảo quản chitin sản xuất theo phương pháp ứng dụng vi khuẩn B subtilis phân tích tiêu vi sinh vật, nhận thấy vi sinh vật tổng số (QMAFAM) lớn tháng bảo quản thứ mức 3,3x105 CFU/g, điều ảnh hưởng đến chất lượng chitin Bảng 3.11 – So sánh số đặc điểm chất lƣợng chitosan sản xuất theo phƣơng pháp hóa học ứng dụng công nghệ sinh học Đặc điểm sản phẩm chitosan sản xuất theo phƣơng pháp Chỉ tiêu chất lƣợng hóa học ứng dụng protease ứng dụng vi khuẩn từ nội tạng cá B subtilis Độ deacetyl, % 79 79-80 82 Độ nhớt [η], dl/g 10,9 14,9 - 18 18,1 Hàm lượng, %: Nước 8,8 8,7 8,7 Chất khoáng 0,1 0,2 0,2 Các chất khơng hịa tan 0,3 0,3 0,4 So sánh màu sắc cho thấy chitin/chitosan sản xuất theo phương pháp hóa học ứng dụng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá có ưu điểm so với phương pháp ứng dụng vi khuẩn B subtilis Vấn đề xử lý chất màu chitin biện pháp khử khống cơng nghệ sản xuất chitin phương pháp ứng dụng vi khuẩn B subtilis tiếp tục nghiên cứu nghiên cứu 3.7 Đề xuất sơ đồ công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học Từ kết nghiên cứu trên, đề xuất dây chuyền công nghệ xử lý vỏ tôm thu hồi hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học: chất màu carotenoid, chitin, chitosan ứng dụng giải pháp công nghệ sinh học sau: 3.6.1 Dây chuyền công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá (hình 3.18) 27 Hình 3.18 – Sơ đồ cơng nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá 3.6.2 Dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B.subtilis (hình 3.19) 28 Hình 3.19 – Sơ đồ cơng nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B subtilis 29 KẾT LUẬN Dựa kết nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chitin/chitosan ứng dụng biện pháp công nghệ sinh học có chúng tơi rút số kết luận san: - Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá có chất lượng tốt với hàm lượng protein nhỏ 0,5%, tiêu vi sinh vật đạt chuẩn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin có độ deacetyl 79-89% độ nhớt cao đến 18 dl/g phù hợp với báo cáo khoa học nước quốc tế - Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng vi khuẩn B subtilis có tiêu cảm quan thấp, vi sinh vật tổng số tương đối cao mức 3,3x105 nằm giới hạn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin có độ nhớt 18,1 dl/g – có chất lượng bảo đảm so với báo cáo nước quốc tế - Công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học sử dụng chế phẩm enzyme từ nội tạng cá vi khuẩn B subtilis góp phần giảm đáng kể lượng hóa chất dùng cơng đoạn khử protein - Bên cạnh sản phẩm cịn thu sản phẩm phụ chất màu carotenoid chất màu tự nhiên sử dụng cơng nghiệp thực phẩm Tuy nhiên, so sánh mức độ phức tạp công nghệ để áp dụng thực tế cơng nghệ ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá có nhiều ưu việt 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1) Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Luyến, Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtillis để loại protein khỏi phần vỏ phế liệu tơm (PLT), Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thuỷ sản số 2/2006 2) Lê Ngọc Tú, Hố sinh cơng nghiệp, NXB khoa học- kĩ thuật, Hà Nội 3) Lê Xuân Phương, Vi sinh vật công nghiệp, NXB xây dựng Hà Nội 4) Lương Đức Phẩm, 2003, Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, NXB Giáo dục 5) Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, 2003, Thí nghiệm cơng nghệ sinh học- NXB đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 6) Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 7) Nguyễn Nhật Thi, 1991 Cá biển Việt nam: Cá xương vịnh Bắc Bộ NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 8) Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, Nxb Y học, Hà Nội, 47 - 48 9) Phan Thị Cẩm Vân, Nghiên cứu thu nhận ứng dụng chế phẩm enzyme protease thô dạng bột từ Bacillus subtilis 10) Trần Thị Luyến, Bùi Văn Tú, Nghiên cứu sử dụng Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú (Penaeus monodon) để thu hồi chitin, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thuỷ sản số 03 – 04/2006 11) Vũ Ngọc Bội, Nghiên cứu trình thuỷ phân protein cá enzyme protease từ Bacillus subtilis, luận án tiến sỹ học, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Tiếng nƣớc ngồi 12) Muzzarelli R.A.A Chitin, Oxford: Pergamon Press, 1977, 309 tr 13) Немцев С В Али Салем Омер Материалы Международной конференции «Технология переработки гидробионтов»ю М.: ВНИРО, 1994, trang 125-127 14) Феофилова Е.П., Терешина В.М., Менорская С.А Микробиология, 1995 Т.64, №1, trang 26-30 15) Немцев С.В и др Пчеловодство, 2001 №5, trang 50-51 16) Эрнст Л.К и др Аграрная Россия, 2000 №5, trang 51-57 17) Быков В.П Тезисы, доклады IV Всероссийской конференции « Производство и применение хитина и хитозана» М.,1995, trang 3-5 18) Немцев С.В Материалы III Всесоюз конф «Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования» М.: ВНИРО, 1992, trang 7-15 31 19) Hood M.A Absract First Inter Conf Chitin/Chitosan Boston: 1997 P.44-45 20) Girand-Guille M.M., Bouligand Y Chitin in Nature and Technology Ed By Muzzarelli R.A.A., C Jenniaux, Gooday G.W.N –Y and L.: Plenum Press, 1986 P.29-35 21) Сафронова Т.М., Выговская Г.П Щиголива Т.Д Биохимические свойства хитинсодержащего сырья Э.И ЦНИИТЭИРХ М., 1974, в.11 trang 3-7 22) А.с 665683 СССР С 08В 37.8 23) Бржески М.М Материалы II Междунар Конф По хитину и хитозану Саппоро, Япония, 1982 Пер С англ КЕ-57232 Киев: Всесоюзный центр перевод, 1983 15 trang 24) Волкова Н.И., Орлова Т.А Тез I Всесоюз Науч Техн Конф По производству и использованию хитина и хитозана из панциря и других ракообразных Владивосток: Дальрыбвтуз, 1983, trang 19-22 25) Пат 4199496 USA Пер с.Англ КЕ-49589 Киев: Всесоюзный центр переводов, 1984 20 trang 26) Пат 3862122 USA Перю с.Англ КЕ-49584 Киев: Всесоюзный центр переводов, 1984 25 trang 27) Chitin and Chitosan: production, properties and usage/ Ed By Academician of the Russian Academy of Agricultural sciences K.G Skriabin, G.A Vikhoreva Dr Sc (Chem), V.P Varlanmov Dr Sc (Chem) Moscow nouka 2002, 360 trang 28) Ricardo A.A, Muzzarelli Fabio Tanfani Carbohydrate Resea rch, No 107 (1982) 189 - 214 29) Shigehiro Hirano Chitin biotechnology applications, Elsevier Science, (1996) 237 - 257 30) Shigemasa Y, Morimoto M, Saimoto H, Okamoto Y and Miami S, Applications of chitin and chitosan for biomaterials, Tottori, Japan, 680-855 31) Wenlung Chen and Robin Y - Y Robin A modified chemical procedure for determination of glucosamine and its application for estimation of mold growth rapid in Peanut Kernels and Koji, Agri Food Chemistry, 47 (1999) 32) Timothy J Maher Glucosamine continuing Education Module, New Hope Institute of Retailing (5/2000) - 33) Noirot P (2007) "Replication of the Bacillus subtilis chromosome", Bacillus: Cellular and Molecular Biology (Graumann P, ed.), Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-12-7 34) Theruvathil K Sini, Sethumadhavan Santhosh* and Paruthapara T Mathew (2007), Study on the production of chitin and chitosan from shrimp shell by using Bacillus subtilis fermentation, Science Direct 32