KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA DẠ DÀY HOÀN BÀ GIẰNG TRÊN THỰC NGHIỆM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM BỘ MÔN DƯỢC LÝ Độc lập – T – Hạnh phúc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA DẠ DÀY HOÀN BÀ GIẰNG TRÊN TH C NGHIỆM Hà Nội, năm 2017 A ĐỘC TÍNH CẤP Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Thuốc nghiên cứu: Thuốc nghiên c u: Dạ dày hoàn Bà Giằng sản xuất Cơ sở sản xuất Y học Cổ truyền Bà Giằng đạt Tiêu chuẩn sở Liều dùng người: Ngày uống 2-3 lần, lần uống 12 viên Bảng 1.1 Thành phần viên Dạ dày hồn Bà Giằng Thành phần Hàm lượng Lá khơi (Ardisia silvestris) 16,0 mg Dạ cẩm (Herba Hedyotidis capitellatae) 12,0 mg Mẫu lệ (Concha Ostreae) 8,0 mg Cam thảo (Radix Glycyrrhizae) 6,0 mg Nga truật (Rhizoma Zedoariae) 12,0 mg Chè dây (Folium Ampelopsis) 10,0 mg Hậu phác (Cortex Magnoliae offcinalis) 8,0 mg Khổ sâm (Folium Croton tonkinensis) 10,0 mg Trần bì (Pericarpium Citri reticulatae) 8,0 mg Chi t (Fructus Gardeniae sp) 8,0 mg Sa nhân (Fructus Amoni) 8,0 mg Thương truật (Rhizoma Atractylodis) 8,0 mg Tá dược v a đ 120 mg/viên Chuẩn bị mẫu nghiên c u độc tính cấp: lấy 150 viên, nghiền cối s , thêm nước cất thành 60 ml v a đ Đây dung dịch đậm đặc cho chuột nhắt trắng uống kim chuyên d ng Dung dịch đậm đặc dùng để nghiên c u độc tính cấp tính xác định LD50 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng ch ng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột ni phịng thí nghiệm c a Bộ mơn Dược lý 5-10 ngày trước nghiên c u suốt thời gian nghiên c u th c ăn chuẩn dành riêng cho chuột (do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp), uống nước t 1.2 Máy móc phục vụ nghiên cứu - Cân điện t c a Nhật, độ xác 0,001 gam - Kim đầu tù cho chuột uống - Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml 1.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử Dạ dày hồn Bà Giằngtheo đường uống chuột nhắt trắng Nghiên c u độc tính cấp xác định LD50 c a thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằngtrên chuột nhắt trắng theo đường uống [1], [2], [3] Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Chuột chia thành lô khác nhau, lô 10 Cho chuột uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằngvới liều tăng dần thể tích để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung c a chuột, trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nơn, co giật, kích động, tiết…) số lượng chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Tất chuột chết mổ để đánh giá tổn thương đại thể T xây d ng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 c a thuốc th Sau tiếp t c theo dõi tình trạng c a chuột đến hết ngày th sau uống thuốc Dạ Dày hoàn Bà Giằng 1.4 X lý số liệu Các số liệu x lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student phần mềm Microsoft Excel Kết nghiên cứu Chuột nhắt trắng uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằngt liều thấp đến liều cao Lô chuột uống đến liều 0,25 ml/10 g, lần 24 dung dịch đậm đặc tương đương /kg, theo dõi thấy liều Dạ dày hồn Bà Giằngkhơng có biểu gì, khơng xuất triệu ch ng bất thường 72 sau uống thuốc th Kết trình bày bảng Bảng 1: Kết nghiên cứu độc tính cấp Thuốc thử Dạ dày hồn Bà Giằng Lơ n chuột Liều Liều (ml/kg) (viên/kg Liều (g/kg T lệ thể trọng) thể trọng) Dấu hiệu chết bất thường (%) khác Lô 10 30 75,0 9,0 Không Lô 10 45 112,5 13,5 Không Lô 10 60 150,0 18,0 Không Lô 10 75 187,5 22,5 Không Kết bảng cho thấy: lô chuột uống Dạ dày hoàn Bà Giằngở liều t 75 viên/kg tương ng g dược liệu/kg đến liều tối đa 187,5 viên/kg tương ng 22,5 g dược liệu/kg khơng có biểu độc tính cấp T bảng tính liều dung nạp tối đa (Luôn nhỏ liều chết 50%) c a Dạ dày hoàn Bà Giằnglà: 187,5 viên/kg tương ng 22,5 g dược liệu/kg, gấp 21,7 lần liều d kiến dùng người (Trong tính người lớn trưởng thành nặng 50 kg, liều tối đa 36 viên/ngày, hệ số ngoại suy chuột nhắt 12) Kết luận: - Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng c a thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằngtheo đường uống chuột nhắt trắng - Thuốc th Dạ dày hồn Bà Giằngkhơng có biểu độc tính cấp liều 187,5 viên/kg tương ng 22,5 g dược liệu/kg - Dạ dày hoàn Bà Giằngở liều gấp 21,7 lần liều người khơng có độc tính cấp theo đường uống, chuột nhắt Vậy theo Tổ ch c Y tế giới, thuốc th dược liệu có tính an toàn cao [3] Dạ dày hoàn Bà Giằnglà thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Gerhard Vogel H (2008), Drug discovery and evaluation Pharmacological assays, Springer OECD (2001), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, acute oral toxicity, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19 World Health Organization (2000), Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization B ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu 1.1.1.1 Thu c nghi n c u Thuốc nghiên c u: Dạ dày hoàn Bà Giằng sản xuất Cơ sở sản xuất Y học Cổ truyền Bà Giằng đạt Tiêu chuẩn sở Liều dùng người: Ngày uống 2-3 lần, lần uống 12 viên Bảng 1.1 Thành phần viên Dạ dày hoàn Bà Giằng Thành phần Hàm lượng Lá khôi (Ardisia silvestris) 16,0 mg Dạ cẩm (Herba Hedyotidis capitellatae) 12,0 mg Mẫu lệ (Concha Ostreae) 8,0 mg Cam thảo (Radix Glycyrrhizae) 6,0 mg Nga truật (Rhizoma Zedoariae) 12,0 mg Chè dây (Folium Ampelopsis) 10,0 mg Hậu phác (Cortex Magnoliae offcinalis) 8,0 mg Khổ sâm (Folium Croton tonkinensis) 10,0 mg Trần bì (Pericarpium Citri reticulatae) 8,0 mg Chi t (Fructus Gardeniae sp) 8,0 mg Sa nhân (Fructus Amoni) 8,0 mg Thương truật (Rhizoma Atractylodis) 8,0 mg Tá dược v a đ 120 mg/viên 1.1.1.2 Ho ch t nghi n c u Kit định lượng enzym chất chuyển hoá máu: ALT (alanin aminotransferase); AST (aspartat aminotransferase); bilirubin toàn phần; albumin; cholesterol toàn phần; creatinin c a hãng Hospitex Diagnostics (Italy) hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng máy sinh hóa bán t động Erba c a Ấn Độ Các dung dịch xét nghiệm máu c a hãng Exigo, định lượng máy Exigo - Boule Medical AB c a Th y Điển Các hoá chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học 1.1.2 Động vật thực nghiệm Chuột cống trắng ch ng Wistar, hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 180g ± 20g, Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng - Hà Tây cung cấp Động vật thí nghiệm ni ngày trước nghiên c u suốt thời gian nghiên c u điều kiện phịng thí nghiệm với đầy đ th c ăn nước uống Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội 1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên c u độc tính bán trường diễn chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn c a Tổ ch c Y tế Thế giới [1], [2] Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên làm lô: - Lô ch ng (n=10): Uống nước cất ml/100g/ngày - Lô trị (n=10): Uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng liều 4,32 viên/kg/ngày - Lô trị (n=10): Uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng liều 12,96 viên/kg/ngày Chuột uống nước cất thuốc th 60 ngày liên t c, ngày lần vào buổi sáng C c ch ti u theo d i tr c v qu tr nh nghi n c u: - Tình trạng chung, thể trọng c a chuột; - Đánh giá ch c phận tạo máu thơng qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công th c bạch cầu số lượng tiểu cầu; - Đánh giá ch c gan thông qua định lượng số chất chuyển hoá máu: Bilirubin toàn phần, albumin cholesterol toàn phần; - Đánh giá m c độ h y hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym máu: ALT, AST; - Đánh giá ch c thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết Các thông số theo dõi kiểm tra vào trước, sau 30 ngày, sau 60 ngày uống nước cất thuốc th Mô bệnh học: Sau 60 ngày uống thuốc th , chuột mổ để quan sát đại thể toàn quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận c a 30% số chuột lô Các xét nghiệm vi thể th c Trung tâm Nghiên c u Phát sớm Ung thư (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết vi thể) 1.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu nghiên c u x lý thống kê theo phương pháp t-test Student test trước - sau (Avant-après) 10 Hoạt độ ALT (UI/l) Thời gian Trước uống thuốc Sau 30 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) Lô chứng Lô trị p Lô trị (t-test student) 60,60 ± 12,78 66,10 ± 13,49 66,30 ± 12,06 > 0,05 61,80 ± 15,31 62,40 ± 13,66 61,70 ± 12,93 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 64,60 ± 13,95 60,20 ± 12,16 63,50 ± 10,50 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.10 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng, xét nghiệm đánh giá m c độ h y hoại tế bào gan hoạt độ ALT máu chuột lô trị (uống thuốc th liều 4,32 viên/kg/ngày) lô trị (uống thuốc th liều 12,96 viên/kg/ngày) khơng có s khác biệt có ý nghĩa so với lơ ch ng so sánh gi a thời điểm trước sau uống thuốc th (p>0,05) 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng đến chức gan Bảng 2.11 Ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng đến nồng độ bilirubin toàn phần máu chuột Bilirubin toàn phần (mmol/l) Thời gian Lô chứng Lô trị 19 Lô trị p (t-test student) Trước uống thuốc Sau 30 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) 13,58 ± 0,57 13,53 ± 0,61 13,24 ± 0,48 > 0,05 13,45 ± 0,52 13,29 ± 0,54 13,48 ± 0,44 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 13,54 ± 0,56 13,49 ± 0,48 13,38 ± 0,54 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.11 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng, xét nghiệm đánh giá nồng độ bilirubin tồn phần máu chuột lơ trị (uống thuốc th liều 4,32 viên/kg/ngày) lô trị (uống thuốc th liều 12,96 viên/kg/ngày) khơng có s khác biệt có ý nghĩa so với lơ ch ng so sánh gi a thời điểm trước sau uống thuốc th (p>0,05) Bảng 2.12 Ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng đến nồng độ albumin máu chuột Albumin (g/dl) p (t-test Thời gian Lô chứng Lô trị Lô trị Trước uống thuốc 2,79 ± 0,22 2,88 ± 0,26 2,74 ± 0,16 > 0,05 2,71 ± 0,29 2,89 ± 0,29 2,85 ± 0,24 > 0,05 Sau 30 ngày uống thuốc 20 student) p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05 2,69 ± 0,30 2,86 ± 0,32 2,70 ± 0,22 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.12 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng, nồng độ albumin máu chuột lô trị (uống thuốc th liều 4,32 viên/kg/ngày) lô trị (uống thuốc th liều 12,96 viên/kg/ngày) khơng có s khác biệt có ý nghĩa so với lô ch ng so sánh gi a thời điểm trước sau uống thuốc th (p>0,05) Bảng 2.13 Ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng đến nồng độ cholesterol toàn phần máu chuột Cholesterol tồn phần (mmol/l) p Thời gian Lơ chứng Lô trị Lô trị (t-test student) Trước uống thuốc 1,32 ± 0,23 1,33 ± 0,15 1,28 ± 0,18 > 0,05 1,30 ± 0,22 1,32 ± 0,14 1,33 ± 0,24 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,27 ± 0,22 1,28 ± 0,20 1,29 ± 0,17 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sau 30 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) 21 > 0,05 Kết bảng 2.13 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng, nồng độ cholesterol tồn phần máu chuột lơ trị (uống thuốc th liều 4,32 viên/kg/ngày) lô trị (uống thuốc th liều 12,96 viên/kg/ngày) khơng có s khác biệt có ý nghĩa so với lơ ch ng so sánh gi a thời điểm trước sau uống thuốc th (p>0,05) 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng chức thận Bảng 2.14 Ảnh hưởng Dạ dày hoàn Bà Giằng đến nồng độ creatinin máu chuột Creatinin (mg/dl) p (t-test Thời gian Lô chứng Lô trị Lô trị Trước uống thuốc 1,04 ± 0,08 1,07 ± 0,07 1,03 ± 0,09 > 0,05 1,03 ± 0,07 1,04 ± 0,05 1,02 ± 0,08 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,04 ± 0,10 1,06 ± 0,10 1,05 ± 0,10 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sau 30 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) student) > 0,05 Kết bảng 2.14 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng, lô trị uống thuốc th liều 4,32 viên/kg/ngày lô trị uống thuốc th liều 12,96 viên/kg/ngày, nồng độ creatinin máu chuột khơng có s thay đổi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô ch ng so sánh gi a thời điểm trước sau uống thuốc th (p>0,05) 22 2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng Dạ dày hồn Bà Giằng lên hình thái cấu trúc vi thể gan, thận chuột 2.6.1 Đại thể Trên tất chuột th c nghiệm (cả lô ch ng lô dùng thuốc th ), không quan sát thấy thay đổi bệnh lý đại thể c a quan tim, phổi, gan lách, t y, thận hệ thống tiêu hóa c a chuột 2.6.2 Vi thể Sau 60 ngày uống nước cất/thuốc th : Bảng 2.15 Hình ảnh vi thể gan thận chuột cống sau 60 ngày uống Dạ dày hoàn Bà Giằng Lô nghiên cứu Lô ch ng sinh học Lô uống Dạ dày hoàn Bà Giằng liều 4,32 viên/kg/ngày Vi thể gan Vi thể thận - 3/3 mẫu bệnh phẩm gan - 3/3 mẫu bệnh phẩm bình thường thận bình thường - 3/3 mẫu bệnh phẩm gan - 3/3 mẫu bệnh phẩm bình thường thận bình thường - 2/3 mẫu bệnh phẩm gan bình thường Lơ uống Dạ dày hồn - 1/3 mẫu bệnh phẩm có tình Bà Giằng liều 12,96 trạng thối hóa nhẹ: Bào viên/kg/ngày tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ giới hạn bình thường 23 - 3/3 mẫu bệnh phẩm thận bình thường Hình thái vi thể gan Ảnh 2.1 Hình thái vi thể gan chuột lơ chứng sinh học (chuột số 01) (HE x 400) Tế bào gan bình thường (HE x 400: Nhu m Hematox lin - Eosin, ph ng i 400 l n) Ảnh 2.2 Hình thái vi thể gan chuột lô trị (chuột số 33) (HE x 400) Tế bào gan bình thường 24 Ảnh 2.3 Hình thái vi thể gan chuột lơ trị (chuột số 38) (HE x 400) Tế bào gan bình thường Ảnh 2.4 Hình thái vi thể gan chuột lơ trị (chuột số 39) (HE x 400) Tế bào gan bình thường 25 Ảnh 2.5 Hình thái vi thể gan chuột lô trị (chuột số 16) (HE x 400) Tế bào gan thối hóa nhẹ Ảnh 2.6 Hình thái vi thể gan chuột lô trị (chuột số 24) (HE x 400) Tế bào gan bình thường 26 Ảnh 2.7 Hình thái vi thể gan chuột lơ trị (chuột số 25) (HE x 400) Tế bào gan bình thường Hình thái vi thể thận: Ảnh 2.8 Hình thái vi thể thận chuột lô chứng (chuột số 01) (HE x 400) Thận bình thường (HE x 400: Nhu m Hematox lin - Eosin, ph ng i 400 l n) 27 Ảnh 2.9 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 33) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 2.10 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 38) (HE x 400) Thận bình thường 28 Ảnh 2.11 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 39) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 2.12 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 16) (HE x 400) Thận bình thường 29 Ảnh 2.13 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 24) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 2.14 Hình thái vi thể thận chuột lô trị (chuột số 25) (HE x 400) Thận bình thường NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN 30 Trên hai lô chuột, lô uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng liều 4,32 viên/kg/ngày lơ uống thuốc th Dạ dày hồn Bà Giằng liều 12,96 viên/kg/ngày, kết cho thấy: - Cả hai liều thuốc th khơng làm ảnh hưởng đến tình trạng chung, m c độ tăng trọng lượng c a chuột so với lô ch ng - Không làm thay đổi kết xét nghiệm đánh giá ch c tạo máu (số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công th c bạch cầu) so với lô ch ng - Không làm thay đổi kết xét nghiệm đánh giá ch c gan (nồng độ bilirubin toàn phần, albumin cholesterol toàn phần máu chuột) so với lô ch ng - Không gây h y hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT máu chuột) so với lô ch ng - Không làm thay đổi kết xét nghiệm creatinin máu chuột sau 60 ngày uống thuốc th liên t c so với lô ch ng - Không gây tổn thương mặt hình thái quan sát đại thể quan c a chuột so với lô ch ng - Cấu trúc vi thể gan, thận c a chuột: tổn thương cấu trúc vi thể gan, thận so với lô ch ng sau 60 ngày uống thuốc th 31 KẾT LUẬN Thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng giao cho Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu th độc tính bán trường diễn động vật th c nghiệm theo đường uống, kết cho thấy: - Thuốc th Dạ dày hồn Bà Giằng khơng gây độc tính bán trường diễn chuột cống trắng uống thuốc th Dạ dày hoàn Bà Giằng liều 4,32 viên/kg/ngày (liều tương đương d kiến lâm sàng) 12,96 viên/kg/ngày (liều tương đương gấp lần d kiến lâm sàng) - Tất số theo dõi tình trạng chung, cân nặng, ch c tạo máu, ch c gan, m c độ h y hoại tế bào gan, ch c thận mô bệnh học gan, thận nằm giới hạn bình thường, khơng có s khác biệt rõ rệt so với lô ch ng [3], [4] 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO OECD (2008), Guidelines for the testing of chemicals repeated dose oral toxicity study in rodents, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 407 World Health Organization (2000), Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization Nguyễn Thế Khánh, Phạm T Dương (2001), X t nghi m s d ng lâm sàng, Nhà xuất Y học Vũ Đình Vinh (2001), H ng d n s d ng c c x t nghi m sinh ho , Nhà xuất Y học, tr 115-287 H N i, ng tháng n m 2017 Trưởng Bộ môn Dược lý Phạm Thị Vân Anh Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận ch ký TS Phạm Thị Vân Anh Trưởng phòng Tổ chức Cán 33