Phân lập và mô tả đặc điểm tuyến trùng có khả năng diệt sâu hại từ mẫu đất quảng nam (62)

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp, đƣợc đồng ý ban lãnh đạo viện công nghệ sinh học, Trƣờng đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, thực đề tài: “Phân lập mơ tả đặc điểm tuyến trùng có khả diệt sâu hại từ mẫu đất Quảng Nam (62)’’ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo viện công nghệ sinh học, Trƣờng đại học Lâm Nghiệp Việt Nam dạy hƣớng dẫn suốt trình học tập Tơi gửi lời cảm ơn tới thầy Lê Thọ Sơn chị Hồng Minh Trang mơn công nghệ gen di truyền phân tử hƣớng dẫn trực tiếp truyền đạt kiến thứ cho tơi thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Tơi cảm ơn hỗ trợ tài LBAR (tên nhóm nghiên cứu) vật liệu tiêu hao làm thí nghiệm từ thầy Hà Văn Hn Cùng với lịng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Phan Tùng Phát LỜI CAM ĐOAN Tên là: Phan Tùng Phát, sinh viên ngành công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Tơi xin cam đoan khóa luận với đề tài “Phân lập mơ tả đặc điểm tuyến trùng có khả diệt sâu hại từ mẫu đất Quảng Nam (62)” hoàn toàn đƣợc thực dựa lực Các số liệu, kết trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Nếu có gian dối tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn Sinh viên Phan Tùng Phát MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1.1.Giới thiệu tuyến trùng 1.1.1.Khái niệm tuyến trùng 1.1.2.Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng 1.2.Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng 1.2.1.Khái niệm tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng 1.2.2.Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng EPN 1.2.3.Ƣu tuyến trùng EPN phòng trừ sinh học 1.3.1.Đặc tính sinh học tuyến trùng 1.3.2.Cơ chế xâm nhập tuyến trùng vào côn trùng vật chủ 1.4.1.Trên giới 1.4.2.Tại Việt Nam CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 NGHIÊN CỨU 10 2.1.Mục tiêu 10 2.2.Nội dung nghiên cứu 10 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 10 2.3.1Phân lập tuyến trùng từ mẫu đất Quảng Nam 10 2.3.3.Đánh giá khả giết côn trùng tuyến trùng 11 2.3.4.Nhân nhanh số lƣợng tuyến trùng 12 2.3.5.Phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái chu kì sinh trƣởng tuyến trùng 12 2.3.6.Các kỹ thuật phân tử chuẩn loại tuyến trùng 13 2.3.7.Bảo quản đông lạnh tuyến trùng 17 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1.Khả xâm nhiễm tiêu diệt côn trùng mẫu 62 18 3.2.Đặc điểm hình thái chu kì sinh trƣởng mẫu tuyến trùng 62 18 3.3.Kết phân tử dòng tuyến trùng 62 22 3.3.1.Kết điện di sản phẩm PCR 22 3.3.2.Kết giải trình tự DNA 23 3.4.Kết bảo quản đông lạnh mẫu tuyến trùng 62 25 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 4.1.Kết luận 26 4.1.1.Học tập 26 4.1.2.Kết 26 4.2.Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT EPN (Entomopathogenic Nematode) :Tuyến trùng kí sinh IJs (Infective Juveniles) :Ấu trùng xâm nhiễm DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 14 Bảng 3.1: Thời gian tiêu diệt côn trùng vật chủ mẫu tuyến trùng 62 18 Bảng 3.2: Kích thƣớc theo giai đoạn mẫu tuyến trùng 62 20 Bảng 3.3: Kích thƣớc trung bình theo giai đoạn mẫu tuyến trùng 62 20 Bảng 3.4: Tỷ lệ sống mẫu tuyến trùng 62 sau bảo quản đơng lạnh 25 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Sâu gạo 10 Hình 2.1: Chu trình PCR 15 Hình 3.1: Chu kỳ sinh trƣởng mẫu tuyến trùng 62 19 Hình 3.2: Các giai đoạn phát triển mẫu tuyến trùng 62 21 Hình 3.3: Các phận trƣởng thành mẫu tuyến trùng 62 21 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu 62 22 Hình 3.3: So sánh trình tự nucleotide với ngân hàng NCBI 23 Hình 3.4: So sánh trình tự nucleotide với ngân hàng NCBI 24 ĐẶT VẤN ĐỀ Với phát triển dân số ngày tăng kèm theo nhu cầu lƣơng thực, biện pháp tăng suất trồng cần đƣợc cải tiến Để tăng sản lƣợng, ngƣời áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để diệt trừ sâu bệnh chiếm phần lớn Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thời kì đầu đem lại lợi ích lớn, nhƣng kéo theo nhiều hệ lụy nhƣ ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe ngƣời vật nuôi, phá vỡ cân hệ sinh thái Vì phƣơng pháp bảo vệ thực vật biện pháp sinh học dần thay biện pháp hóa học Vì tơi thực đề tài “Phân lập mô tả đặc điểm tuyến trùng có khả diệt sâu hại từ mẫu đất Quảng Nam (62)’’ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1.1.Giới thiệu tuyến trùng 1.1.1.Khái niệm tuyến trùng Tuyến trùng gọi giun tròn động vật khơng xƣơng sống thuộc ngành giun trịn Đây nhóm động vật đa dạng phong phú hành tinh Sự phong phú đa dạng tuyến trùng thể số lƣợng loài, số lƣợng cá thể nhƣ kiểu sống, phân bố hệ sinh thái chúng (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Tuyến trùng nhóm động vật có mơi trƣờng sống hệ sinh thái đa dạng Sở dĩ chúng đa dạng nhƣ chúng có nhiều khả thích nghi theo hệ sinh thái khác nhau, từ sống tự đến dạng kí sinh ngƣời, động vật thực vật Một số nhóm lồi tuyến trùng vừa có pha sống tự xen kẽ với pha sống kí sinh (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) a.Tuyến trùng sống tự - Tuyến trùng đất: Chủ yếu nhóm tuyến trùng ăn vi khuẩn, nấm, thực vật (khơng phải kí sinh), ăn thịt ăn chất mùn hữu - Tuyến trùng nƣớc: Sống tầng đáy thủy vực biển Đây nhóm tuyến trùng nguyên thủy nhóm sinh thái phong phú đa dạng Ở môi trƣờng nƣớc, chúng dinh dƣỡng vi khuẩn, cỏ biển, ăn thịt ăn chất mùn hữu lớp trầm tích Sự phân chia tƣơng đối tuyến trùng đất chủ yếu sống mạch nƣớc nhỏ đất, ngƣợc lại tuyến trùng nƣớc chủ yếu sống tầng trầm tích thủy vực b.Tuyến trùng kí sinh - Tuyến trùng kí sinh động vật: thƣờng đƣợc quen gọi giun tròn động vật, bao gồm tuyến trùng kí sinh ngƣời động vật Đây nhóm tuyến trùng có kích thƣớc tƣơng đối lớn, chun hóa cao với đời sống kí sinh động vật, gây nhiều bệnh hiểm nghèo cho ngƣời động vật Trong số nhóm tuyến trùng kí sinh trùng có số lồi thuộc hai giống Steinernema Heterorhabditis lồi kí sinh gây bệnh cho côn trùng nên đƣợc nghiên cứu sử dụng phịng trừ sinh học - Tuyến trùng kí sinh thực vật: gồm lồi kí sinh gây hại cho thực vật Đây nhóm tuyến trùng thích nghi với đời sống kí sinh thực vật phát triển Nhóm có số đặc trƣng quan trọng nhƣ thƣờng có kích thƣớc hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chun hóa để châm chích mơ thực vật hút chất dinh dƣỡng, đời sống chúng có quan hệ bắt buộc trực tiếp với thực vật 1.1.2.Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng Có thể nói, văn minh Trung Hoa Ai Cập trƣớc gần 5000 năm, ngƣời bắt đầu biết đến giun tròn, đặc biệt giun trịn kí sinh ngƣời động vật Trong nhiều kỉ trƣớc sau công nguyên, phát hiểu biết giun tròn tập trung trung tâm văn minh cổ đại Phƣơng Đông nhƣng sau phát chủ yếu đƣợc tìm thấy châu Âu Bắc Mỹ Do ý nghĩa thực tiễn gắn với đời sống ngƣời đa phần có kích lớn nên hầu hết lồi giun trịn kí sinh ngƣời động vật đƣợc phát sớm Ngƣợc lại loài tuyến trùng kí sinh thực vật, kí sinh trùng hầu hết nhóm tuyến trùng sống tự đất, nƣớc đƣợc biết đến muộn (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Sự hiểu biết cấu tạo giải phẫu sinh lí tuyến trùng cịn hạn chế hầu hết tuyến trùng có kích thƣớc nhỏ Chỉ đến phát minh kính hiển vi điện tử, nhiều vấn đề quan trọng cấu trúc tuyến trùng đƣợc nghiên cứu làm sáng tỏ Các kĩ thuật đại giúp cho nghiên cứu tuyến trùng ngày hoàn thiện Hiện nay, kĩ thuật mới, nhiều loài tuyến trùng đƣợc nhân ni phịng thí nghiệm Điều cho phép triển khai nghiên cứu thực nghiệm sinh lí sinh hóa tuyến trùng Các nghiên cứu thực nghiêm tạo khả hiểu biết sâu sinh lí, sinh hóa q trình kí sinh, gây bệnh tuyến trùng 1.2.Tuyến trùng kí sinh gây bệnh trùng 1.2.1.Khái niệm tuyến trùng kí sinh gây bệnh trùng Tuyến trùng kí sinh gây bệnh trùng (hay cịn gọi EPN) đại diện cho nhóm tuyến trùng sinh sống đất ký sinh loạt lồi trùng Những tuyến trùng thuộc hai họ Steinernematidae Heterorhabditidae Cho đến nay, 70 loài đƣợc mơ tả Steinernematidae có khoảng 20 lồi Heterorhabditidae Tuyến trùng có mối quan hệ với vi khuẩn Enterobacteriaceae chúng hoạt động giết chết nhiều lồi cơng trùng (Rousel A.O and Ming M.L, 2014) Tuyến trùng EPN chủ yếu kí sinh gây bệnh cho côn trùng hại đất, trùng phải qua phần vịng đời vùng sinh thái đất Khi tiếp cận vật chủ, EPN thƣờng xâm nhập qua miệng, hậu môn, lỗ thở, tuyến tơ nơi có lớp kitin mỏng Khi xâm nhập đƣợc vào bên thể vật chủ, EPN giải phóng vi khuẩn cộng sinh 1.2.2.Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng EPN Vai trị kí sinh gây bệnh trùng số lồi tuyến trùng đƣợc tìm từ năm 1930 tiềm phòng trừ sâu hại chúng đƣợc biết sớm Tuy nhiên thời gian dài sau đó, phát triển mạnh mẽ thuốc hóa học bảo vệ thực vật nên nghiên cứu nhóm tuyến trùng kí sinh gây bệnh trùng ứng dụng chƣa đƣợc quan tâm phát triển Những nghiên cứu sâu rộng nhóm tuyến trùng thực năm 70 kỉ trƣớc, việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật bắt đầu gây hậu nghiêm trọng nhƣ: sâu kháng thuốc, phá vỡ hệ cân sinh thái, ô nhiễm môi trƣờng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời,… (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Mặc dù vai trò tác nhân sinh học tuyến trùng EPN đƣợc biết tới muộn nhƣng từ năm 1970 trở lại đây, chúng nhóm tác nhân sinh học đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ toàn diện 1.2.3.Ưu tuyến trùng EPN phòng trừ sinh học Sở dĩ tuyến trùng EPN giành đƣợc quan tâm nhanh chóng nghiên cứu ứng dụng nhóm tuyến trùng có ƣu sau: - Có khả kí sinh gây bệnh cho nhiều loại sâu hại khac - An tồn cho ngƣời, động vật, thực vật mơi trƣờng - Sâu hại khơng có khả kháng với tổ hợp kí sinh gây bệnh - Có khả chủ động tìm diệt sâu hại giết chết sâu hại - Có khả sản xuất sinh khối lớn công nghệ nhân nuôi invitro invivo - Tồn lâu đất nhân nhanh số lƣợng có sâu hại nên cần phun EPN lần cho trình dài - Dễ dàng áp dụng phòng trừ sâu hại thiết bị phun thuốc chuẩn đƣợc sử dụng rộng rãi Ngồi trùng hại trịng nơng nghiệp, tuyến trùng EPN có tiềm phịng trừ mối hại đê điều Tuyến trùng EPN có khả phịng trừ số đối tƣợng côn trùng y học nhƣ muỗi, gián, ruồi,… đối tƣợng gây hại cho sức khỏe cộng đồng 1.3.Cơ chế xâm nhập, kí sinh gây bệnh EPN 1.3.1.Đặc tính sinh học tuyến trùng Mặc dù tuyến trùng kí sinh gây bệnh trùng thuộc giống Steinernema Heterorhabditis lồi kí sinh bắt buộc trùng, nhƣng chúng lại có pha chun hóa tồn bên ngồi vật chủ trùng, thƣờng mơi trƣờng đất, ấu trùng xâm nhiễm (Infective junveniles-IJs), giai đoạn đặc biệt vịng đời nhóm tuyến trùng Ở giai đoạn này, chúng khơng cần dinh dƣỡng nhƣng có khả tồn lâu dài môi trƣờng đất chƣa gặp vật chủ (Edwin E.Lewis cộng sự, 2002) Thực chất giai đoạn ấu trùng nằm chờ đất sãn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để kí sinh gây bệnh Một chu kỳ xâm nhập phát triển tuyến trùng EPN thể côn trùng vật chủ thƣờng pha ấu trùng đến pha phát triển kí sinh bên Mồi xuôi F: 5’- GAC CCG TCT TGA AAC ACG GA - 3’ Mồi ngƣợc B: 5’- TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA - 3’ Phƣơng pháp tiến hành Mix hỗn hợp PCR nhƣ sau: Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Thể tích phản ứng (µl) Thành phần Master Mix 2x 25 Nƣớc deion 12 Primer F Primer R DNA tổng số Tổng thể tích 50 01 mẫu đối chứng (+) thay DNA tổng số DNA đƣợc xác định 01 mẫu đối chứng (-) không bổ sung DNA tổng số Sau chuẩn bị xong mẫu, khởi động máy PCR thiết lập chu trình PCR với giai đoạn nhƣ hình 2.1: Bƣớc 1: Làm nóng DNA primer 95oC phút Bƣớc 2: Biến tính 95oC 30 giây, nhằm phá vỡ cầu nối hydrogen nối hai sợi DNA Bƣớc 3: Gắn mồi 53oC 30 giây, giai đoạn giúp đoạn mồi gắn vào sợi DNA đơn Bƣớc 4: Kéo dài 72oC phút, giai đoạn DNA polymerase gắn vào hoạt động dọc theo sợi DNA cần khuếch đại Bƣớc 5: Các bƣớc từ đến đƣợc lặp lại 35 lần Bƣớc 6: giữ mẫu 4oC, nhiệt độ DNA khơng bị hƣ hại vịng đêm 14 95oC 95oC 2:00 0:30 72oC 53oC 1:00 72oC 5:00 oC 0:30 ∞ Hình 2.1: Chu trình PCR c.Điện di sản phẩm PCR Điện di trình dịch chuyển phân tử tích điện dung dịch dƣới tác dụng điện trƣờng Dụng cụ - Hóa chất + Cân điện tử + Agarose + Lọ thủy tinh + Đệm TAE 1X + Lị vi sóng + Maker 1kb + Bể điện di + Pipet, đầu côn Phƣơng pháp tiến hành Bƣớc 1: Cân 1g agarose vào bình dẫn đệm TAE 1X đến 100ml để thu đƣợc gel agarose 1% Đun nồi khử trùng lị vi sóng agarose tan hồn tồn Nếu trình đun nƣớc nhiều phải thêm nƣớc cho đủ 100 ml Bổ sung redsafe để nguội khoảng 600C đổ vào buồng điện di có cài sẵn lƣợc Chiều dày gel khoảng 5mm thích hợp Sau 30-40 phút, gel đơng cứng, gỡ lƣợc Đƣa gel vào bể điện di Để hình băng DNA gel điện di ta sử dụng Redsafe tính an tồn so với thuốc nhuộm truyền thống ethidium bromide nhằm phát acid nucleic gel agarose Thuốc nhuộm RedSafe phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh gắn chèn vào DNA RNA Bƣớc 2: Hút 5µl Maker tra vào giếng Bƣớc 3: Hút 5µl lần lƣợt mẫu đối chứng (+), đối chứng (-), mẫu PCR tra vào giếng 15 Bƣớc 4: Cắm nguồn điện chạy điện di Chú ý cắm cực Chạy điện di 100V 60 phút Bƣớc 5: Soi gel dƣới đèn UV kiểm tra kết d.Tinh DNA Dụng cụ - Hóa chất + Máy ly tâm +Kit tinh DNA (hãng Norgen) + Pipet, đầu côn +Nƣớc deion + Ống eppendorf + Găng tay Phƣơng pháp tiến hành Bƣớc 1: Chuyển 100μl sản phẩm PCR (không bao gồm dầu) vào ống li tâm thêm lần thể tích dd BNL Buffer/Plus, trộn vortex Bƣớc 2: Đặt cột vào ống ly tâm Bƣớc 3: Chuyển hỗn hợp mẫu vào cột Ly tâm 10,000 vòng 30 giây, sau loại bỏ dịch chảy Bƣớc 4: Thêm 750μl dung dịch Washing Buffer/Plus (bổ sung ethanol) vào cột Ly tâm 10,000 vịng 30 giây, sau loại bỏ dịch chảy Hãy chắn ethanol (96-100%) đƣợc thêm vào Wash Buffer Plus mở lần Bƣớc 5: Ly tâm lại tốc độ tối đa (12,000 vịng/phút) ba phút để làm khơ màng cột Lƣu ý: Chất lỏng dƣ cần đƣợc loại bỏ hoàn toàn bƣớc Bƣớc 6: Đặt cột vào ống ly tâm Bƣớc 7: Thêm 40μl dd H2O vào trung tâm màng cột, giữ cột phút Bƣớc 8: Ly tâm tốc độ cao (12,000 vòng/phút) phút để làm DNA e.Giải trình tự DNA sau tinh đƣợc gửi giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger dịch vụ ngồi (Cơng ty TNHH Phát triển Cơng nghệ Ứng dụng Việt Nam - VNDAT) 16 2.3.7.Bảo quản đông lạnh tuyến trùng a Dụng cụ hóa chất + Glycerol (hãng Scharlau) + Ống eppendorf + Pipet, đầu b Thí nghiệm bảo quản đông lạnh tuyến trùng Sử dụng tuyến trùng giai đoạn ấu trùng (IJ) lây nhiễm giai đoạn sinh sống tự tuyến trùng Giai đoạn ấu trùng sống đất tìm kiếm vật chủ thích hợp giai đoạn tuyến trùng không ăn không phát triển Đợi xâm nhập vào vật chủ côn trùng (Edwin E,Lewis & David I,Shapiro-Ilan, 2002) Các bƣớc thí nghiệm bảo quản đơng lạnh tuyến trùng : Bƣớc 1: Hút 500µl dung dịch glycerol pha loãng với nồng độ xác định vào ống eppendorf Bƣớc 2: Hút 500µl dung dịch tuyến trùng (chủ yếu giai đoạn IJs) vào ống glycerol Nồng độ EPN khoảng 1000 IJs/ml Với mẫu ta làm 02 ống giống Bƣớc 3: Đặt ống bảo quản EPN tủ mát (5–10oC) 2–3 để tuyến trùng thích nghi dần với nhiệt độ Bƣớc 4: Chuyển ống bảo quản EPN vào tủ lạnh (–20oC) 03 ngày để lƣu trữ Bƣớc 5: Lấy mẫu ống để kiểm tra bảo quản đơng lạnh Chuyển ống bảo quản EPN cịn lại vào bình đựng mẫu bảo quản nitơ lỏng chuyên dụng c.Kiểm tra kết bảo quản đông lạnh tuyến trùng Sau ngày bảo quản lạnh tủ âm sâu, lấy nhanh ống eppendorf đông lạnh chứa EPN làm tan lạnh cách để 5-10 phút nhiệt độ phịng Sau đổ dung dịch chứa EPN đĩa petri (Փ10) để nhiệt độ phòng 24 Tiến hành kiểm tra đánh giá tỷ lệ sống tuyến trùng dƣới kính hiển vi soi Tuyến trùng sống đƣợc xác định sở chúng chuyển động chạm vào 17 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Khả xâm nhiễm tiêu diệt côn trùng mẫu 62 Bảng 3.1: Thời gian tiêu diệt côn trùng vật chủ mẫu tuyến trùng 62 Kí hiệu: + Sống; ‒ Chết Lần Lần Lần Thời gian Mẫu Đối chứng Đối chứng 62 Đối chứng Đối chứng 62 Đối chứng Đối chứng 62 24h 48h 72h 96h 120h + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + - Từ bảng 3.1 cho thấy, ba lần thử nghiệm mẫu tuyến trùng 62 tiêu diệt côn trùng vật chủ ấu trùng bƣớm sáp sau 24-48 Các mẫu đối chứng đối chứng 2, côn trùng vật chủ ấu trùng bƣớm sáp sống chứng tỏ điều kiện mơi trƣờng bên ngồi nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, nƣớc không ảnh hƣởng đến sống côn trùng vật chủ Xác côn trùng chết thí nghiệm đƣợc đem rửa sạch, đặt vào đĩa petri có đặt sẵn giấy lọc bổ sung thêm vài giọt nƣớc để nhiệt độ phòng Kết sau khoảng 96h từ chết phát thấy có mặt tuyến trùng Điều chứng tỏ tuyến trùng mẫu 62 có khả xâm nhập tiêu diệt trùng 3.2.Đặc điểm hình thái chu kì sinh trƣởng mẫu tuyến trùng 62 a.Chu kì sinh trƣởng mẫu tuyến trùng 62 Việc nghiên cứu xác định thời gian sinh trƣởng phát triển dịng tuyến trùng có ý nghĩa quan trọng việc xác định thời gian nhân ủ nhƣ giai đoạn thí nghiệm Nhằm tối ƣu để phân loại sản xuất sinh khối tuyến trùng nhƣ giai đoạn tối ƣu cho thí nghiệm Sự sinh trƣởng phát triển mẫu tuyến trùng 62 kéo dài 8-9 ngày, trải qua ba giai đoạn phát triển chính: trứng, ấu trùng, trƣởng thành Trong thời 18 gian để cá thể đẻ trứng từ 01 đến 03 ngày, thời gian để trứng nở ấu trùng từ 01 đến 1.5 ngày, thời gian để phát triển từ ấu trùng đến cá thể trƣởng thành từ 03 đến 04 ngày Hình 3.1: Chu kỳ sinh trƣởng mẫu tuyến trùng 62 Tùy vào điều kiện môi trƣờng sống mà trƣởng thành đẻ trứng giữ trứng lại thể mẹ Khi môi trƣờng sống thuận lợi trƣởng thành đẻ trứng vào thể côn trùng môi trƣờng sống Nhƣng điều kiện môi trƣờng bất lợi khan thức ăn trƣởng thành giữ trứng cở thể để ấu trùng nở sử dụng thể mẹ để lấy dinh dƣỡng b.Đặc điểm hình thái mẫu tuyến trùng 62 Tiến hành đo kích thƣớc giai đoạn sinh trƣởng phát triển mẫu tuyến trùng 62 dƣới kính hiển vi điện tử ta thu đƣợc kết nhƣ sau: 19 Bảng 3.2: Kích thƣớc theo giai đoạn mẫu tuyến trùng 62 Trứng (mm) STT Dài 0.05 0,06 0,05 0,05 0,06 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,06 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,0515 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TB Rộng 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 Ấu trùng 24h (mm) Dài 0,66 0,75 0,67 0,61 0,64 0,64 0,66 064 0,64 0,57 0,71 0,64 0,64 0,59 0,64 0,68 0,64 0,64 0,65 0,64 0,6475 Rộng 0,02 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03 0,03 0,028 Trƣởng thành (mm) Dài 2,2 2,27 2,21 2,26 1,81 2,22 1,88 1,83 1,72 1,85 1,93 1,88 1,90 1,74 2,11 1,85 1,77 1,78 1,91 1,83 1,948 Rộng 0,12 0,12 0,12 0,11 0,09 0,11 0,10 0,09 0,09 0,09 0,10 0,09 0,09 0,09 0,11 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,099 Bảng 3.3: Kích thƣớc trung bình theo giai đoạn mẫu tuyến trùng 62 Giai đoạn Chiều dài (mm) Chiều rộng (mm) Trứng 0,05 ± 0,002 0,03 Ấu trùng (sau 24h) 0,6475 ± 0,016 0,028 ± 0,003 Trƣởng thành 1,948 ± 0,066 0,099 ± 0,01 Quan sát đặc điểm hình thái dƣới kính hiển vi cho thấy mẫu tuyến trùng 62 chủ yếu lƣỡng tính khơng quan sát thấy đực Có hình thái giai đoạn trƣởng thành nhƣ: thuôn dài đầu đi, cuống họng hình trịn, có trứng xếp dày buồng trứng 20 A B C Hình 3.2: Các giai đoạn phát triển mẫu tuyến trùng 62 A: Trứng; B: Ấu trùng 24h; C: Trƣởng thành A B C Hình 3.3: Các phận trƣởng thành mẫu tuyến trùng 62 A: Đầu; B: Buồng trứng; C: Đi 21 3.3.Kết phân tử dịng tuyến trùng 62 3.3.1.Kết điện di sản phẩm PCR Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu 62 Từ kết điện di, ta thấy DNA thu đƣợc có kích thƣớc từ 300 – 500bp, khơng thấy vạch phụ, không sáng rõ Trong giếng đối chứng âm xuất vạch tƣơng tự Kết không nằm dự kiến điều kit thực PCR có vấn đề chúng tơi lặp lại thí nghiệm nhiều lần (14 lần) cho kết tƣơng tự Điều thực khó giải thích Thứ nhất, sản phẩm kit chúng tơi bị phơi nhiễm trƣớc làm phản ứng PCR Thứ hai, phức hợp phản ứng PCR chúng tơi tạo loại vật chất ví dụ nhƣ DNA tự tổng hợp, điều thú vị lần đầu xuất nguyên lý DNA tự tạo theo cách cũ cần có DNA khn cần đƣợc kiểm tra cẩn thận trƣớc kết luận Trƣớc tiên cần phản ánh kết với nhà thiết kế kit Tuy tiến hành giải trình tự DNA băng mẫu 22 3.3.2.Kết giải trình tự DNA Trình tự DNA mẫu 62 đọc theo chiều F: TTGCACTAGTGCATGCGAGTGTTTGGGTGTCAACCCGTGCGCGTAAT GAAAGTGAACGGAGGTGGGACCCTCTTGGGGGGCATCCACCCCCCCC TAGATCTTTCGATGGGTTTCTGTGAGAGAGCATGTGTGTGGACCCCC AAAAGATTGAGATCTGTCTGAGTATAGGGAGAACCCAGGAAACTCTC TTGGGGGGGCTCACCGCGTCTCTGACGCGCATCTCTCTCCTCATTTTT GTGTATGGGGGAAAAAGAATTCTAACACCCTCTTATATGGTTCTTTCC CAAAAAA Tiến hành so sánh trình tự DNA với ngân hàng NCBI, ta thu đƣợc kết nhƣ sau: Hình 3.3: So sánh trình tự nucleotide với ngân hàng NCBI Ghi chú: Description :Mô tả E value :Chỉ số E Max score :Hệ số Max Ident :Hệ số Ident Total score :Hệ số Total Accession :Dịng/lồi Query cover :Độ bao phủ 23 Thơng thƣờng ngƣời ta chọn vài trình tự để dự báo lồi, tơi thấy trình tự DNA so sánh có tƣơng đồng với DNA nhiều loài nấm khác Ví dụ nhƣ lựa chọn thứ hai (hình 3.4) cho thấy trình tự lồi nấm Acarospora cf dissipata nhƣng có 61 vị trí sai khác Hình 3.4: So sánh trình tự nucleotide với ngân hàng NCBI Qua hình 3.3 3.4 ta thấy, đoạn DNA mẫu tuyến trùng 62 có tƣơng đồng với DNA nhiều lồi nấm khác nhau, Ngồi ra, có 61 vị trí nucleotide sai khác với đoạn gen đƣợc so sánh ngân hàng NCBI, Kiểm tra đối chiếu với phổ trình tự cho thấy vị trí sai khác phổ bị nhiễu, không tin tƣởng, Từ chúng tơi đƣa giả thiết: 1, Đây trình tự mới, trình tự chƣa xuất nhóm tuyến trùng, Điều xảy chủng đƣợc phân lập nhóm nghiên cứu chúng tơi 2, Có thể trình tự khơng lý q trình thực PCR, tinh sản phẩm PCR, gửi mẫu đọc trình tự Chúng phản ánh vấn đề tới công ty chủ quản 3, Có thể đoạn DNA lồi trùng với đoạn DNA nhận diện nấm 24 Do nguồn lực có hạn, nên chúng tơi chƣa thể thực lại việc giải trình tự, Chúng tơi tiến hành kiểm chứng có đủ nguồn lực 3.4.Kết bảo quản đông lạnh mẫu tuyến trùng 62 Bảng 3.4: Tỷ lệ sống mẫu tuyến trùng 62 sau bảo quản đông lạnh Nồng độ Glycerol (%) Tỷ lệ tuyến trùng sống sót (%) Lần Lần Lần 4,2 3.5 3,7 5.5 5,3 5,7 16 0 Kết sau ba lần thí nghiệm cho thấy sau 72 bảo quản lạnh nhiệt độ -20 C nồng độ glycerol khác tỷ lệ sống sót tuyến trùng khác Ở nồng độ glycerol 16% tuyến trùng tuyến trùng khơng có khả sống sót sau bảo quản lạnh Ở nồng độ glycerol 4% sau bảo quản có tuyến trùng sống sót,tỷ lệ tuyến trùng sống sót đạt cao nồng độ glycerol 8% o Kết đƣợc giải thích nƣớc đóng vai trò quan trọng ổn định cấu trúc, chức đại phân tử trì tính tồn vẹn màng lipid Glycerol giúp làm tăng khả chịu lạnh cách chống tạo tinh thể băng tuyết đông lạnh tuyến trùng thấm vào màng sau nƣớc bị (Farman Ali cộng sự, 2015) 25 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận 4.1.1.Học tập 1) Học đƣợc kỹ thuật ứng dụng kiến thức lý thuyết vào thực tiễn làm việc 2) Qua trình làm thí nghiệm tơi hoc đƣợc nhiều kỹ phịng thí nghiệm nghiên cứu tuyến trùng, kỹ thao tác sinh học phân tử đặc biệt kỹ liên quan đến tách chiêt DNA, PCR, tinh sản phẩm PCR, giải trình tự DNA, điện di sản phẩm PCR, so sánh trình tự DNA đọc kết so sánh nhiều nguyên lý kỹ thuật, kỹ kỹ thuật khác 4.1.2.Kết Từ thí nghiệm với mẫu tuyến trùng 62 đƣợc phân lập từ mẫu đất thu nhận tỉnh Quảng Nam, rút đƣợc số kết nhƣ sau: 1) Mẫu tuyến trùng 62 có khả kí sinh tiêu diệt trùng 2) Mơ tả đƣợc mẫu tuyến trùng 62 với kích thƣớc hình ảnh nhƣ 3) Xác định đƣợc thời gian sinh trƣởng phát triển mẫu tuyến trùng 62 4) Đã tiến hành thực tách chiết DNA, làm PCR, chạy điện di Agarose, tinh sản phẩm PCR, giải trình tự DNA so sánh trình tự DNA cho mẫu tuyến trùng 62 5) Bảo quản mẫu tuyến trùng 62 nồng độ Glycerol 8% cho tỉ lệ sống cao 4.2.Kiến nghị Do điều kiện kĩ thuật, thời gian kinh phí hạn chế nên cịn số vấn đề chúng tơi chƣa giải đƣợc, Vì vậy, chúng tơi có số đề xuất cho hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: 1) Xác định phân loại xác lồi mẫu tuyến trùng 62 2) Tìm kiếm phƣơng pháp bảo quản đông lạnh tuyến trùng khác để tăng tỷ lệ sống tuyến trùng 3)Nghiên cứu, ứng dụng tuyến trùng để sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1, Nguyễn Ngọc Châu, 2008, Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng Việt Nam, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ 2, Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật sở phòng trừ, NXB Khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh 3, Adler R Dillman and Paul W Sternberg (2012) Entomopathogenic Nematodes Curr Biol 22(11), 430-431 4, Boemare (2002) Biology, taxonomy and systematics of Photorhadus and Xenorhadus In: Gaugler, R (Ed.), Entomopathogenic Nematology CABI, 35-36 5, David I Shapiro-Ilan (2002), Richou Han, C.Dolinksi (2012) Entomopathogenic nematode production and application technology Journal of Nematology 44, 206-217 6, Edwin E.Lewis & David I,Shapiro-Ilan (2002), Host cadavers protect entomopathogenic nematodes during freezing Journal of Invertebrate Pathology 81, 25-32 7, Farman Ali and David A.Wharton (2015), Infective Juveniles of the Entomopathogenic Nematode, Steinernema feltiae Produce Cryoprotectants in Response to Freezing and Cold Acclimation PLoS One 10(10), e0141810 8, Gaugler R (2002) Entomopathogenic Nematology Wallingford, UK: CABI Publishing 9, Kristen E Murfin et al (2012) Nematode-Bacterium symbioses – Cooperation and Conflict Revealed in the ‘Omics’ Age Biol Bull 223(1), 85102 10, Mark Blaxter and Georgios Koutsovoulos (2014) The evolution of parasitism in Nematoda Parasitology 142 (suppl 1), 26-39 11, Pavel Dobes et el (2012) An improved method for nematode infection assays in Drosophila larvae Fly (Austin) 6(2), 75-79 27 12, Rousel A,O, Ming M,L, S,P,S (2014), Soil sampling and isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steineinematidea, Heterorhabditidea), Journal of Visualized Experiments 89, 1-8 13, Saša ŠIRCA, Gregor UREK (2009), Morphological and molecular characterization of six Longidorus species (Nematoda: Longidoridae) from Slovenia, Russian Journal of Nematology 17, 95-105 28 ... thực đề tài ? ?Phân lập mô tả đặc điểm tuyến trùng có khả diệt sâu hại từ mẫu đất Quảng Nam (62)? ??’ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1.1.Giới thiệu tuyến trùng 1.1.1.Khái niệm tuyến trùng Tuyến trùng gọi... 4.1.2.Kết Từ thí nghiệm với mẫu tuyến trùng 62 đƣợc phân lập từ mẫu đất thu nhận tỉnh Quảng Nam, rút đƣợc số kết nhƣ sau: 1) Mẫu tuyến trùng 62 có khả kí sinh tiêu diệt côn trùng 2) Mô tả đƣợc mẫu tuyến. .. học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Tơi xin cam đoan khóa luận với đề tài ? ?Phân lập mô tả đặc điểm tuyến trùng có khả diệt sâu hại từ mẫu đất Quảng Nam (62)? ?? hoàn toàn đƣợc thực dựa lực Các