Tạo chủng nấm aspergillus niger đột biến có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập Viện Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học tập trƣờng Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà hành trang quý báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Kim Dung – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hƣớng hƣớng dẫn em suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin kính chúc thầy, giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công sống nhƣ nghiệp nghiên cứu giảng dạy Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Nguyễn Thị Tú Anh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme pectinase 1.1.1 Cơ chất pectin 1.1.2 Enzyme pectinase 1.1.3 Một số phƣơng pháp sản xuất enzyme pectinase 1.2 Tổng quan Aspergillus niger 11 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 11 1.2.2 Đặc điểm, phân bố 11 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận pectinase từ A niger 13 1.3 Đột biến cải tạo chủng 15 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liệu 18 2.3.2 Hóa chất 18 2.3.3 Thiết bị 18 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 4.1 Hoạt hóa chủng nấm mốc giữ giống ống nghiệm 19 2.4.2 Nghiên cứu xác định điều kiện chiếu UV phù hợp 19 2.4.3 Nghiên cứu tạo chủng đột biến từ chủng A niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao 22 ii 2.4.4 Điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp pectinase từ A.niger 25 2.4.5 Thu dịch enzyme thô 25 2.4.6 Kết tủa enzyme ethanol 26 2.4.7 Định lƣợng đƣờng khử DNS 26 2.4.8 Xác định hoạt độ Pectinase 27 2.4.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu 28 CHƢƠNG K T QUẢ VÀ THẢO LU N 29 3.1 Kết xác định điều kiện chiếu UV phù hợp 29 3.1.1 Khảo sát thời gian chiếu 29 3.1.2 Khảo sát khoảng cách chiếu 30 3.2 Nghiên cứu tạo chủng đột biến từ A niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao 31 3.2.1 Tuyển chọn sơ dựa vào vòng thủy phân với thuốc thử lugol 31 3.2.2 Tuyển chọn dựa vào hoạt độ Pectinase từ chủng đột biến 33 3.2.3 Sàng lọc dựa tính ổn định khả sinh tổng hợp enzym 34 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp pectinase 35 3.3.1 Ảnh hƣởng hàm lƣợng pectin 35 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ 36 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian lên men 37 K T LU N VÀ KI N NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tỉ lệ ứng dụng loại enzyme công nghiệp Bảng 1.2: Giá trị kinh tế loại enzyme Bảng 2.1 Khảo sát thời gian chiếu xạ 20 Bảng 2.2 Khảo sát khoảng cách chiếu xạ 21 Bảng 2.3 Giá trị đƣờng kính vịng phân giải chất D d thu đƣợc từ chủng đột biến 22 Bảng 2.4 Thí nghiệm xác định khả tổng hợp enzyme chủng đột biến 23 Bảng 2.5 Khả sinh tổng hợp pectinase chủng cải tạo qua hệ 24 Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp Pectinase 25 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống A niger 29 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng khoảng cách chiếu xạ tới tỉ lệ sống A niger 31 Bảng 3.3: Giá trị đƣờng kính vịng phân giải chất thu đƣợc từ chủng đột biến 32 Bảng 3.4 Kết kiểm tra khả tổng hợp enzym chủng đột biến 33 Bảng 3.5 Khả sinh tổng hợp pectinase chủng cải tạo qua hệ 34 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh tác động pectinase lên phân tử pectin Hình 1.2: Sơ đồ thu nhận enzyme pectinase k thuật từ canh trƣờng nấm mốc Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger 12 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn monogalacturonic acid 26 Hình 3.1: Khuẩn lạc A niger với thời gian chiếu UV khác 30 Hình 3.2a Vịng thủy phân chủng đột biến mặt trƣớc sau đ a 33 Hình 3.2b: Hình ảnh so sánh chủng nấm gốc nấm sau đột biến hệ………………………………………………………………………………35 Hình 3.3: Ảnh hƣởng hàm lƣợng pectin đến hoạt độ enzyme 35 Hình 3.4: Hình ảnh biến đổi màu sắc dung dịch phản ứng pectinase với pectin bổ sung nồng độ chất cảm ứng khác 36 Hình 3.5: Ảnh hƣởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 37 Hình 3.6: Hình ảnh biến đổi màu sắc dung dịch phản ứng pectinase với pectin bổ sung nồng độ chất cảm ứng khác 37 Hình 3.7: Ảnh hƣởng thời gian lên men đến hoạt độ enzyme 38 Hình 3.8: Mơi trƣờng lên men thu enzyme pectinase sau 3, ngày 38 Hình 3.9: Hình ảnh biến đổi màu sắc dung dịch phản ứng pectinase với pectin bổ sung nồng độ chất cảm ứng khác 39 v ĐẶT VẤN ĐỀ Pectinase nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân pectin, giải phóng đơn phân acid galacturonic Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khác nhƣ polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tác thủy phân phân tử pectin tạo sản phẩm khác Pectinase thƣờng đƣợc sử dụng ngành công nghệ thực phẩm nhƣ sản xuất loại nƣớc uống, góp phần chiết rút chất màu, tannin chất hòa tan làm tăng chất lƣợng thành phẩm Nhờ pectinase mà thu đƣợc dịch có nồng độ đậm đặc để sản xuất mứt hoa quả; dùng pectinase để tách lớp keo hạt cà phê Với vai trò quan trọng, pectinase đƣợc sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích lớn cơng nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp nhẹ Trƣớc nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật động vật Ngày nay, ngƣời ta nghiên cứu tìm nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng mang lại lợi ích kinh tế Một đặc điểm bật pectinase enzyme đƣợc dùng khơng giới hạn thực phẩm khơng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời Bằng ƣu điểm dễ nuôi cấy, sinh trƣởng phát triển nhanh, cho nhiều enzyme thời gian ngắn, vi sinh vật lựa chọn hàng đầu nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng suất sản xuất lên cao Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp đƣợc thực chủ yếu từ Aspergillus niger A niger phân lập đƣợc từ tự nhiên có khả sinh tổng hợp pectinase mức trung bình Tuy nhiên, để sản xuất pectin quy mô lớn cần phải cần lƣợng enzym lớn với hoạt lực enzym cao Trong bối cảnh nay, công nghiệp ngày phát triển, nhu cầu ngƣời không ngừng tăng cao, cần thiết nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả tạo hàm lƣợng enzym lớn, hoạt độ cao để phục vụ cho đời sống ngƣời Vì vậy, nghiên cứu cải tạo chủng A niger để nâng cao lực sinh tổng hợp pectinase công việc cần thiết Mặt khác, việc cải biến chủng A niger phƣơng pháp hiệu để sinh tổng hợp enzyme pectinase cao Có phƣơng pháp cải biến chủng A niger phƣơng pháp tái tổ hợp phƣơng pháp đột biến nhờ hóa chất tia UV… Tuy nhiên, phƣơng pháp cải biến cách dùng tia UV đột biến chủng dễ dàng, thời gian tiến hành nhƣ đem lại hiệu cao Trên sở đó, mục tiêu đề tài “Nghiên cứu tạo chủng A niger đột biến có khả sinh tổng hợp enzyme pectinase cao” nhằm tăng hiệu suất trình lên men sinh tổng hợp pectinase từ phục vụ nhu cầu sản xuất nƣớc mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme pectinase 1.1.1 Cơ chất pectin Pectin hợp chất cao phân tử mạch thẳng, đƣợc cấu tạo từ acid galacturonic liên kết -1,4 glucoside Tùy nguồn pectin khác mà pectin có khối lƣợng phân tử 200.000 Da Pectin tan nƣớc ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri, glycerine nóng Các pectin tự nhiên định vị thành phần tế bào liên kết với cấu trúc polysaccharide protein để tạo thành protopectin khơng tan Chúng ta phân hủy protopectin không tan tế bào thành pectin tan nƣớc cách đun nóng pectin mơi trƣờng acid, pectin tan khơng đồng dạng với Trong thực vật, pectin tồn dƣới ba dạng: - Pectin hòa tan: ester methylic polygalacturonic acid, tự nhiên có khoảng số nhóm carboxyl polygalacturonic acid đƣợc ester hóa methanol Pectin đƣợc ester hóa cao tạo gel đặc dung dịch acid dung dịch đƣờng có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên hợp chất pectin có khối lƣợng phân tử khác cấu trúc hóa học khơng đồng dạng Cấu trúc hóa học pectin -D-galacturonan hay -D-galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ đơn vị Dgalactopyranosyluronic acid liên kết theo kiểu -1,4 Mặt khác, mức độ oxy hóa phân tử polymer khác nhau, số định nhóm carboxyl bị ester hóa nhóm methoxyl Trong số trƣờng hợp, chẳng hạn pectin củ cải đƣờng có ester hóa nhóm carboxyl nhóm acetyl - Pectin acid: polygalacturonic acid có phần nhỏ nhóm carboxyl đƣợc ester hóa methanol Pectinate muối pectinic acid Pectic acid polygalacturonic acid hồn tồn giải phóng khỏi đơn vị galacturonic acid Pectate muối pectic acid - Protopectin: tạo độ cứng cho xanh, không tan nƣớc có cấu tạo hóa học phức tạp Trong protopectin có phân tử pectin, phân tử cellulose ion Ca2+, Mg2+ gốc phosphoric acid, acetic acid đƣờng Protopectin bị thủy phân acid giải phóng pectin hịa tan 1.1.2 Enzyme pectinase 1.1.2.1 Giới thiệu enzyme pectinase Enzyme pectinase enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin sản phẩm trình acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol,… nhóm enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi cơng nghiệp đứng sau amylase protease Sự phân hủy pectin tự nhiên thƣờng xảy trái chín Những enzyme có vai trị quan trọng trình bảo quản trái rau Hình 1.1: t n phâ 1.1.2.2 Ứng dụng enzyme pectinase - Hiện nay, pectinase đƣợc ứng dụng nhiều công nghiệp, với tỷ lệ 3% bảng 1.1 với giá trị lợi nhuận thu đƣợc lớn bảng 1.2 Bảng 1.1: Tỉ lệ ứng dụng loại enzyme công nghiệp [8] Bảng 1.2: Giá trị kinh tế loại enzyme [8] Ứng dụng pectinase chủ yếu l nh vực sau: - Trong sản xuất thực phẩm, ngƣời ta sử dụng chế phẩm pectinase duới dạng tinh khiết Ngƣời ta không dùng chế phẩm dƣới dạng canh trƣờng nấm mốc sấy khô Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc lƣợng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ , 3- , đến ,1 % - Trong sản xuất rƣợu vang, nhƣ sản xuất nƣớc nƣớc uống khơng rƣợu, sử dụng pectinase cách hiệu Nhờ tác dụng pectinase mà trình ép, làm lọc dịch dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đƣa pectinase vào khâu nghiền quả, làm tăng hiệu suất nƣớc sau ép tới 15 – 25% Bởi lẽ lệ sống thấp, thơng thƣờng nhỏ ,1% Do đó, thời gian chiếu 75 phút với tỉ lệ sống ,03% đƣợc lựa chọn cho việc cải tạo chủng A.niger 5002 3.1.2 ẩ A r vớ ế UV hảo sát khoảng cách chiếu Trong nghiên cứu tạo chủng đột biến tia UV, tỷ lệ sống bào tử nấm mốc phụ thuộc vào nguồn chiếu, thời gian khoảng cách chiếu Do việc khảo sát khoảng cách chiếu với thời gian nguồn chiếu cố định để tìm khoảng cách chiếu phù hợp cơng việc cần thiết Tiến hành chiếu bào tử A niger dƣới đ n UV cƣờng độ A, thời gian chiếu 75 phút, khoảng cách từ dịch bào tử đến đ n UV thay đổi khoảng 15 – 30 cm Tỷ lệ sống mẫu đƣợc thể bảng 3.2: 30 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng khoảng cách chiếu UV t i tỉ lệ sống A niger STT hoảng cách Số khuẩn lạc/ml Tỷ lệ sống (%) chiếu (cm) ĐC 87000 100 30 11692 13,44 25 4941 5,68 20 59 0,06 15 0,007 Ta thấy khoảng cách đ n UV dịch bào tử gần, tỷ lệ sống sót bào tử A niger giảm Ở khoảng cách cm, tỷ lệ sống sót 13,44%, giảm khoảng cách chiếu xuống 25 cm, tỷ lệ sống sót giảm cịn 5,68 %, đặt dịch bào tử cách đ n UV cm, tỷ lệ sống cịn ,06% Cuối khoảng cách 15cm tỉ lệ sống nhỏ ,007% Ở khoảng cách chiếu cm 15 cm cho tỷ lệ bào tử sống sót nhỏ ,1%, nhiên khoảng cách 15 cm, tỷ lệ sống nhỏ ,007% , hiệu suất chọn lọc không cao chọn khoảng cách chiếu phù hợp cm 3.2 Nghiên cứu tạo chủng đột biến từ A niger 5002 có khả sinh tổng hợp pectinase cao Sau tìm đƣợc điều kiện chiếu UV phù hợp thời gian chiếu 75 phút, khoảng cách cm , tiến hành chiếu xạ tạo chủng đột biến tuyển chọn chủng đột biến có khả sinh tổng hợp Pectinase cao 3.2.1 Tuyển chọn sơ dựa vào v ng thủy phân v i thuốc thử lugol Chiếu bào tử A niger 5002 cách đ n UV cm 75 phút, để dịch bào tử tối 24 trang MT2 thu đƣợc 59 khuẩn lạc Tiếp tục tách khuẩn lạc cấy chấm điểm đ a pettri chứa MT3 để xác định đƣờng kính vịng thủy phân Giá trị D d số chủng đột biến đƣợc tìm thấy cao so với chủng tự nhiên đƣợc biểu diễn bảng 3.3 31 Bảng 3.3: Giá trị đƣờng k nh v ng phân giải chất thu đƣợc từ chủng đột biến STT d (cm) 2,2 2 2,4 2,4 2,5 2 D (cm) 2,8 2,6 2,4 2,8 2,8 5,2 2,5 D/d 1,27 1,3 1,2 1,17 1,25 1,12 2,6 1,25 STT 31 32 33 34 35 36 37 38 d (cm) 1,2 1,6 1,8 2,4 1,5 1,5 D (cm) 1,4 3,0 2,7 4,3 3,4 2,9 1,9 4,5 D/d 1,4 2,5 1,69 2,39 1,7 1,21 1,27 10 11 12 13 14 15 2,2 1,6 1,8 1,2 1,9 1,7 2,4 2,5 2,2 5,5 3,8 2,6 2,4 1,2 1,14 1,38 3,06 3,17 1,37 1,41 39 40 41 42 43 44 45 2,1 2,2 1,9 1,8 3,2 6,5 2,4 2,1 2,2 2,4 5,2 1,48 3,25 1,09 1,1 1,1 1,33 2,6 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1,6 2,2 1,9 1,5 1,5 1,6 1,7 1,5 1,8 2,2 1,9 2,1 4,5 2,5 5,1 2,6 2,5 3,5 2,7 2,2 3,8 2,1 3,1 3,6 2,9 2,8 2,81 1,14 2,68 1,3 1,33 1,25 2,33 1,35 1,38 2,26 1,4 1,72 1,64 1,53 1,33 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 ĐC 1,5 1,7 1,6 1,4 1,5 1,7 1,8 1,6 1,2 1,2 1,4 1,3 1,1 1,4 2,5 4,9 2,1 3,9 3,2 4,6 4,5 1,9 2 1,6 1,8 1,7 2,2 1,67 2,89 1,31 1,43 2,6 1,88 2,56 2,81 1,58 1,67 1,43 1,6 1,38 1,55 1,57 32 V ế (m rướ v ĩ ) Theo khảo sát lựa chọn đƣợc 16 chủng có D d cao hẳn so với chủng gốc cho trình sàng lọc chủng in đậm bảng 3.3 3.2.2 Tuyển chọn dựa vào hoạt độ Pectinase từ chủng đột biến 16 chủng đƣợc sàng lọc sơ đƣợc nuôi cấy 72 thu enzyme ngoại bào, xác định hoạt độ pectinase Kết đƣợc thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết kiểm tra khả tổng hợp enzyme chủng đột biến Chủng Hoạt độ enzyme Hiệu suất so v i chủng gốc (U/ml) (%) ĐC 35,05 100 ĐB5 02.1 37,6 107,28 ĐB5 02.2 39,19 111,81 ĐB5 02.3 52,79 150,61 ĐB5 2.4 36,56 104,31 ĐB5 2.5 35,94 102,54 ĐB5 2.6 42,98 122,62 ĐB5 2.7 51,68 147,47 ĐB5 2.8 50,09 142,91 ĐB5 02.9 38,57 110,04 ĐB5 2.10 39,32 112,18 ĐB5 2.11 39,88 113,78 ĐB5 2.12 43,33 123,62 ĐB5 2.13 37,19 106,11 ĐB5 2.14 41,19 117,52 ĐB5 2.15 43,19 123,22 ĐB5 2.16 44,02 125,59 Kết bảng 3.4 cho thấy số 16 chủng có D d cao chủng tự nhiên có chủng có khả sinh tổng hợp pectinase cao 142,91% - 150,61%) so 33 với chủng tự nhiên, bao gồm: A niger ĐB5 2.03, ĐB5 2.07, ĐB5 Sau trình cải biến, chủng A niger có khả tổng hợp pectinase hoạt độ cao Nhƣ vậy, chủng đƣợc lựa chọn tiếp cho thử nghiệm nuôi cấy qua nhiều hệ để kiểm tra tính ổn định khả sinh tổng hợp pectinase chúng 3.2.3 Sàng lọc dựa t nh ổn định khả sinh tổng hợp enzyme chủng A niger ĐB5 3, ĐB5 7, ĐB5 đƣợc hoạt hóa, ni cấy môi trƣờng rắn xác định khả sinh tổng hợp enzyme chúng qua hệ Kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Khả sinh tổng hợp pectinase chủng cải tạo qua hệ Tên chủng Thế hệ (U/ml) 35,05 Thế hệ (U/ml) 34,97 Thế hệ (U/ml) 33,62 Thế hệ (U/ml) 33,25 Thế hệ (U/ml) 32,01 A niger 5002 ĐB5 2.03 52,79 52,21 52,01 51,87 50,96 ĐB5 2.07 51,68 51,06 48,92 46,48 44,02 ĐB5 2.08 50,09 49,98 42,17 39,87 35,18 Qua bảng kết ta thấy, chủng gốc A niger 5002 gần nhƣ ổn định hệ Ở chủng đột biến, ổn định hệ thứ nhƣng đến hệ thứ có xu hƣớng giảm nhanh hoạt tính pectinase hệ sau, hoạt lực pectinase giảm Nhƣ chủng đột biến ĐB5 hệ thứ 5, khả sản xuất pectinase đạt hiệu suất 70,23% so với hệ Trong chủng đột biến chủng ĐB5 ổn định qua hệ, đến hệ thứ 5, hiệu suất sinh tổng hợp pectinase đạt 96,53% so với hệ Nhƣ vậy, chủng đột biến A niger ĐB5 có khả sinh tổng hợp pectinase cao ổn định qua nhiều hệ Khả sản xuất pectinanse cao so với chủng gốc A niger đến 1,4 lần ổn định qua nhiều hệ Quan sát hình thái, màu sắc, hệ sợi chủng đột biến nhận thấy chủng A niger ĐB5 mang đặc điểm tƣơng tự nhƣ chủng gốc bao gồm: chủng có kích thƣớc khuẩn lạc > cm sau ngày nuôi cấy, bào tử màu đen sợi nấm màu trắng, mặt trái khuẩn lạc không màu 34 3.3 o ấm ố v ấm ế ế hảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp pectinase 3.3.1 Ảnh hƣởng hàm lƣợng pectin Pectin đóng vai trị chất cảm ứng cho trình tổng hợp pectinase Với phƣơng pháp lên men rắn, lƣợng pectin sử dụng đƣợc khảo sát khoảng – 16% w w Sau ngày nuôi, hoạt độ pectinase cao đạt 55,27 U/ml hàm lƣợng pectin 12% w w Hình 3.3 m hình 3.3) ế o enzyme Kết nghiên cứu tƣơng ứng với cơng bố nhóm sinh viên thuộc Khoa Tài nguyên Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một [4] Theo báo cáo nghiên cứu, hoạt độ enzyme thu đƣợc cao môi trƣờng rắn có bổ sung 12% chất pectin 35 ế Hình 3.4: m ị vớ ấ m Từ hình 3.4 thấy, ống Effendort chứa hỗn hợp dung dịch gồm enzyme thu đƣợc hàm lƣợng pectin 12% có màu đậm đến ống 16% ống 8% có màu sáng 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng lớn đến phát triển vi sinh vật, vi sinh vật sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme mục tiêu phạm vi định Mặc dù, A niger chủng nấm mốc hoạt động vùng nhiệt độ ƣa ấm khoảng – 40oC nhƣng qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp pectinase chủng A niger khác Bai ZH cộng nuôi cấy chủng A niger oC cho sinh tổng hợp pectinase [3], Akhter N cộng lại chọn oC cho nuôi cấy A niger IM-6 [1], Leda R Castilho cộng nuôi cấy A niger 35oC [6] Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme chủng A niger ĐB5 đƣợc thực khoảng 24 37oC Kết đƣợc thể hình 3.5 cho thấy nhiệt độ oC A niger ĐB5 phát triển mạnh sinh tổng hợp pectinase cao (58.15 U ml Do lựa chọn nhiệt độ ni cấy oC cho nghiên cứu 36 35 m ế Hình 3.6: ế m o z m ị vớ ấ m 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian lên men Thời gian lên men có ảnh hƣởng lớn sản xuất enzyme Thời gian lên men để đạt hoạt độ pectinase cao ngắn chi phí sản xuất thấp Kết hình 3.6 cho thấy chủng A niger ĐB5 2.03 có khả sinh tổng hợp pectinase cao 61,56 U/ml sau ngày Kết Mukesh kumar D J cộng nuôi cấy chủng A niger từ chủng Bacillus sp MFW7 cho hoạt độ pectinase cao sau ngày [8] Do lựa chọn thời gian nuôi cấy ngày để thu nhận enzyme A niger ĐB5002.03 [10][12] 37 Hình 3.7 m ngày Hình 3.8: Mơi rườ ngày ế o z m ngày lên men thu enzyme pectinase sau 3, ngày Ta thấy sau ngày, hệ sợi nấm phát triển ăn lan dày đặc bề mặt chất, nhiên so với ngày thứ 5, ngày thứ hệ sợi nấm an lan rộng hơn, dày hơn, đâm sâu vào chất nhƣng hoạt độ enzyme ngày thứ lại cao Điều chứng minh qua hình ảnh sau có chênh lệch độ đậm nhạt dịch ống Efennot 38 ế Hình 3.9: m ị vớ ấ m Khảo sát cho thấy thông số hàm lƣợng pectin, hàm ẩm nhiệt độ ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt độ peptinase Với hàm lƣợng pectin 12% nhiệt độ 30oC hoạt độ pectinase thu đƣợc cao sau ngày lên men 39 T LU N VÀ I N NGHỊ ết luận Qua trình nghiên cứu tạo chủng đột biến cho khả sinh tổng hợp pectinase cao tối ƣu hóa điều kiện ni cấy chủng đột biến, đề tài rút số kết luận sau: Đã khảo sát đƣợc điều kiện chiếu UV phù hợp đột biến cải tạo chủng nấm mốc A.niger cƣờng độ dòng điện A, khoảng cách chiếu: cm thời gian chiếu: 75 phút Đã tạo đƣợc chủng đột biến A.niger ĐB5 có cho hoạt độ enzym 52,79 U ml, cao chủng tự nhiên 1,4 lần ổn định qua hệ Từ xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy thời gian nuôi cấy chủng đột biến A.niger ĐB tỷ lệ cám: trấu = 7:2, hàm lƣợng pectin 12% nhiệt độ ⁰C khoảng thời gian ngày iến nghị Tiếp tục tiến hành nghiên cứu quy trình thu nhận tinh chế phẩm enzym pectinase từ chủng A niger ĐB Nghiên cứu ứng dụng enzyme pectinase chủng A.niger ĐB 5002.03 vào trình sản xuất nƣớc quả, rƣợu vang… để phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm 40 TÀI LIỆU THAM HẢO TÀI LIỆU TI NG VIỆT Lê Thị Hồng Ánh (2013) Nghiên cứu chuyển hóa saccharose thành fructoo igosaachrides (FOS) tinh FOS phương pháp c nano Luận án Tiến s k thuật, Trƣờng đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Vân Anh 14 Nghiên cứu ứng dụng endo-xylanase để sản xuất arabinoxy an từ cám gạo àm th c phẩm chức ĐT 2.11 CNSHCB Đỗ Biên Cƣơng, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu, Hoàng Thị Loan, Vũ Kim Dung (2012) Thu nhận khảo sát hoạt t nh sinh h c mannooo igosaccharit cao độ từ bã cơm dừa Tạp chí khoa học cơng nghệ trƣờng đại học 89, pp 13 - 134 Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Anh Dũng, Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Trần Thị Ngọc Nhƣ, 14 , Nghiên cứu thu nhận pectinase từ A.niger nuôi cấy môi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nang cao hiệu bóc vỏ tiêu Trƣờng ĐH Thủ Dầu Một Lê Thanh Nguyên, Vũ Thị Ninh, Đoàn Thị Phƣợng, Nguyễn Thị Thủy, Tạ Phi Vũ, Chiết tinh chế ứng dụng enzyme Nguyễn Văn Mùi Th c hành hóa sinh Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội Đặng Thị Thu, Đỗ Biên Cƣơng Báo cáo khoa h c tổng kết đề tài ĐL 16/2006-03: Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm mannoo igosaccharide ứng dụng tạo th c phẩm chức Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội Trịnh Thị Kim Vân, Nguyễn Thị Hoài Trâm, Đỗ Thanh Huyền, Đoàn Thanh Hƣơng Nghiên cứu điều kiện cơng nghệ để chuyển hóa xy an õi ngô tạo đường xy oo igosaccharide (XOS) Báo cáo Khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc Nhà xuất đại học Thái Nguyên, pp 738-742 TÀI LIỆU TI NG ANH Akhter N, Morshed M.A, Uddin A, Begum F, Sultan T, Azad KA (2011) Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media International Journal of Biosciences 1(1), pp 33 - 42 A Rasheedha Banu, M Kalpana Devi, G R Gnanaprabhal, BV Pradeep and M Palaniswamy, (2009), Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum - Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India m.palaniswamy@gmail.com Bai ZH, Zhang HX, Qi HY, Peng XW, Li BJ, (2011), Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance- Department of Environmental BioTechnology, The Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, P.O Box 2871, Beijing 100085 Hannan A, Bajwa R, Latif Z (2009) Status of Aspergillus niger strains for pectinases production potential Pakistan Journal of Phytopathology 21(1), pp 77 - 82 Ishtiaq Ahme , Muhammad Anjum Zia, Muhammad Azhar Hussain, Zain Akram, Muhammad Tahir Naveed, Azin Nowrouzi (2012) – Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its purification and characterization Leda R Castilho , Ricardo A Medronho, Tito LM Alves, (2010) Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger Maciel MHC., Herculano PN., Porto TS., Teixeira MFS., Moreira KA., Souza-Motta CM (2011) Production and partial characterization of pectinases from palm by Aspergillus niger URM4645 African Journal of Biotechnology 10(13), pp 2469 - 2475 Maldonado MC., Saad AMS (1998) Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state systems Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, pp 34- 38 Martos MA., Vazquez FM., Benassi FO., Hours RA (2009) Production of pectinase by A niger: Influence of fermentation conditions Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3), pp 567 - 572 10 Mukesh kumar D J1,*, Saranya G M2 , Suresh K2 , Andal Priyadharshini D2 , Rajakumar R2 and Kalaichelvan PT1 (2009) -Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp MFW7 using Cassava WasteCentre for Advanced Studies in Botany, University of Madras, Guindy Campus, Chennai, TN, India 2A.V.V.M Sri Pushpam College (Autonomous), Poondi, Thanjavur District, TN, India 11 Mukadam DS., Chavan AM., Taware AS., Taware SD (2010) Isolation, cloning and molecular characterization of polygalacturonase I (pgaI) gene from Aspergillus niger isolation from mango Indian journal of Biotechnology 9, pp 153 - 159 12 Mrudula S., Anitharaj R (2011) Pectinases production in solid state fermentation by Aspergillus niger Using orange peel as substrate Global Journal of Biotechnology & Biochemistry 6(2), pp 64 - 71 13 Nazneen Akhter1, M Alam Morshed1,3*, Azim Uddin3 , Feroza Begum2 , Tipu Sultan1 , Abul Kalam Azad1 (2012) 14 - Production of Pectinase by Aspergillus niger Cultured in Solid State Media- Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Faculty of Applied Science and Technology 15 Obechukwu C, Ezike, Sabinus Oscar O, Ferdinand C Chilaka (2016) -Production of Pectinases from Aspergillus niger using submerged fermentation with orange peels as carbon sourceBiochemistry, University of Nigeria Nsukka) Department of 16 Phutela U, Dhuna V, Sandhu S, Chadha BS (2005) Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels Brazilian Journal of Microbiology 36, pp 63 - 69 17 S Mrudula and R Anitharaj (2007) -Pectianse Production in Solid State Fermentation by Aspergillus niger Using Orange Peel as Substrate 18 Uzoma OA, Ihuaku OV, Joy O, Adedotun AA, Albert EO, Blessing OM (2009) Pectinase production by UV-2DG resistant mutant of Aspergillus niger with a catabolite repression resistance activity FASEB Journal, ... A niger đột biến có khả sinh tổng hợp enzym pectinase cao 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xác định điều kiện chiếu UV phù hợp - Tạo chủng đột biến từ chủng A niger 5002 có khả sinh tổng hợp. .. cao khả sinh tổng hợp pectinase trải qua giai đoạn: gây đột biến ngẫu nhiên UV, tuyển chọn 16 chủng có khả sinh tổng hợp pectinase cao đánh giá ổn định chủng đột biến qua hệ Hiệu gây đột biến ngẫu... tạo chủng A niger để nâng cao lực sinh tổng hợp pectinase công việc cần thiết Mặt khác, việc cải biến chủng A niger phƣơng pháp hiệu để sinh tổng hợp enzyme pectinase cao Có phƣơng pháp cải biến