(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** Hoàng Đăng Sáng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỘT BIẾN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA KẾT HỢP VỚI XỬ LÝ KHÁNG SINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐỖ THỊ HUYỀN ThS TRẦN BĂNG DIỆP LỜI CẢM ƠN Hà Nội - 2018 Để hoàn thành nghiên cứu hoàn thiện luận văn này, lời xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, ngƣời thầy bảo hƣớng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu - ThS Trần Băng Diệp ngƣời thầy cho tơi ý kiến q báu - TS Đỗ Thị Huyền, giúp tơi q trình hồn thiện luận văn Ngồi tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô giảng dạy cho nhiều kiến thức nhƣ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu Nhân dịp này, xin cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học, viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập Tơi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam anh chị em đồng nghiệp phòng Nghiên cứu Công nghệ xạ tạo điều kiện hỗ trợ tơi suốt q trình làm việc, học tập hồn thiện luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình học tập nghiên cứu Đề tài “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả sinh protease cao chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” nhận đƣợc hỗ trợ lớn từ đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ cấp Bộ, mã số ĐTCB/01/15/TTCX, Ths Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm./ Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Hoàng Đăng Sáng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu cá nhân Các số liệu tài liệu đƣợc trích dẫn luận văn trung thực Kết nghiên cứu không trùng với cơng trình đƣợc cơng bố trƣớc Tơi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội,tháng 11 năm 2018 Học viên Hoàng Đăng Sáng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Khuẩn lạc KKS- 0,2 DNA EDTA GLP – : Adenosine triphosphate : Các khuẩn lạc mọc môi trƣờng bổ sung rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml : Các khuẩn lạc mọc môi trƣờng bổ sung rifampicin nồng độ µg/ml : Các khuẩn lạc mọc mơi trƣờng bổ sung streptomycin nồng độ 20 µg/ml : Các khuẩn lạc mọc môi trƣờng bổ sung streptomycin nồng độ 200 µg/ml : Deoxyribonucleic acid : Ethylendiamin tetraacetic acid : Glucagon – like peptide – KS MMP MT PCR ppGpp : Kháng sinh : Matrix metallo protease : Môi trƣờng : Polymerase chain reaction : Guanosine – 5‟diphosphate – 3‟diphosphat RNA RNAP sp TB tRNA VK VSV : Ribonucleic acid : RNA polymerase : Species : Tế bào : RNA vận chuyển : Vi khuẩn : Vi sinh vật Khuẩn lạc KKS- Khuẩn lạc KKS- 20 Khuẩn lạc KKS- 200 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PROTEASE 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại protease 1.1.3 Nguồn thu protease 1.1.4 Ứng dụng protease 1.1.4.1 Ứng dụng công nghiệp 1.1.4.2 Trong nghiên cứu trị liệu 10 1.1.4.3 Trong nông nghiệp 11 1.2 BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS 12 1.2.1 Tổng quan Bacillus subtilis .12 1.2.1.1 Lịch sử phát phân loại 12 1.2.1.2 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên 12 1.2.1.3 Đặc điểm hình thái 12 1.2.1.4 Đặc điểm sinh hóa đặc điểm nuôi cấy 13 1.2.1.5 Bào tử khả tạo bào tử 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease Bacillus subtilis 15 1.2.2.1 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng 15 1.2.2.2 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng lên khả sinh tổng hợp protease 17 1.2.2.3 Ảnh hƣởng phƣơng pháp nuôi cấy 18 1.3 PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME 18 1.3.1 Công nghệ đáp ứng lại VSV 18 1.3.2 Công nghệ gen 19 1.3.2.1 Phƣơng pháp gây đột biến 19 1.3.2.2 Tái tổ hợp di truyền 20 1.3.3 Công nghệ trao đổi chất 20 1.3.4 Công nghệ ribosome 21 1.4 TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT 24 1.4.1 Quá trình gây hiệu ứng sinh học xạ ion hóa 24 1.4.1.1 Các trình xảy sau xạ vào tổ chức sinh học 24 1.4.1.2 Hiệu ứng sinh học gây xạ ion hóa 26 1.4.2 Ứng dụng xạ ion hóa gây tạo đột biến vi sinh vật 27 PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 30 2.1.1 Nguyên vật liệu 30 2.1.2 Hóa chất 30 2.1.3 Thiết bị 31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Bảo quản giữ giống 31 2.2.2 Xử lý chiếu xạ 32 2.2.2.1 Nuôi cấy huyền dịch tế bào 32 2.2.2.2 Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy: 32 2.2.3 Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật 32 2.2.4 Định tính định lƣợng protease 33 2.2.4.1 Phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 33 2.2.4.2 Phƣơng pháp Anson cải tiến 34 2.2.5 Sàng lọc đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis xử lý chiếu xạ 36 2.2.6 Sàng lọc đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh .36 2.2.7 Xác định đột biến 37 2.2.7.1 Thiết kế mồi xử lý số liệu .37 2.2.7.2 Khuếch đại trình tự gen rpoB rpsL12 38 2.2.7.3 Tinh sản phẩm PCR 38 2.2.7.4 Phƣơng pháp điện di DNA 38 2.2.7.5 Giải trình tự 39 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN 40 3.1.1 Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao ổn định .40 3.1.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy tới khả sinh protease chủng Bacillus subtilis 42 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG 44 3.2.1 Đánh giá trình sinh trƣởng chủng Bacillus subtilis .44 3.2.2 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sống sót chủng Bacillus subtilis 45 3.2.3 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sinh protease chủng Bacillus subtilis 47 3.3 XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS 49 3.3.1.1 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả kháng streptomycin chủng Bacillus subtilis 50 3.3.1.2 Sàng lọc khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả sinh protease cao từ chủng kháng xạ kháng streptomycin 51 3.3.2 Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin 55 3.3.2.1 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả kháng rifampicin chủng Bacillus subtilis 55 3.3.2.2 Sàng lọc khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả sinh protease cao từ khuẩn lạc kháng xạ kháng rifampicin 56 3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC GEN rpoB, rpsL Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO HƠN CHỦNG GỐC 59 3.4.1 Khuếch đại gen rpoB rpsL chủng gốc, khuẩn lạc sinh protease cao chủng gốc 59 3.4.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng gốc khuẩn lạc sinh protease cao 59 3.4.2.2 Khuếch đại gen rpoB rpsL từ DNA tổng số phản ứng PCR 61 3.4.2.3.Tinh sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB rpsL để giải trình tự xác định đột biến 61 3.4.2.4 Giải trình tự gen rpoB chủng khuẩn lạc sinh protease vƣợt trội 62 3.4.2.5 Giải trình tự gen rpsL chủng chủng đột biến 66 3.4.2.6 Phân tích so sánh kết kiểu đột biến, vị trí đột biến với khả sinh protease 68 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 81 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí hoạt động phân loại protease Hình Vai trò protease nghiên cứu ung thƣ 10 Hình 1.3 Thị phần sử dụng proteinase nghiên cứu - trị liệu 11 Hình 1.4 Tế bào VK Bacillus subtilis quan sát dƣới kính hiển vi 13 Hình 1.5 Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi 14 Hình 1.6 Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp ribosome 21 Hình 1.7 Cơng nghệ ribosome 22 Hình 1.8 Cấu trúc tiểu phần β RNAP Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae 23 Hình 1.9 Tác dụng trực tiếp gián tiếp xạ ion hóa tới DNA 24 Hình 1.10 Các loại tổn thƣơng tác động xạ ion hóa DNA 26 Hình 2.1 Sơ đồ bƣớc thử hoạt tính protease 34 Hình 3.1 Vòng phân giải casein 09 chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease 40 Hình 3.2 Vòng phân giải casein 05 chủng có khả sinh protease cao 41 Hình 3.3 Hoạt độ protease chủng Bacillus subtilis tuyển chọn 41 Hình 3.4 Kích thƣớc vòng phân giải casein protese chủng Bacillus subtilis tạo thời điểm nuôi cấy khác 42 Hình 3.5 Hoạt tính protease chủng Bacillus subtilis đƣợc kiểm tra sau thu sau bảo quản 48 43 Hình 3.6 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng Bacillus subtilis tiềm 44 Hình 3.7 Mối tƣơng quan số lƣợng VK Bacillus subtilis sống sót dịch ni cấy liều chiếu xạ 46 Hình 3.8 Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml 03 chủng Bacillus subtilis B5, H12 VI liều chiếu xạ khác 50 Hình 3.9 Kích thƣớc vòng phân giải casein chủng Bacillus subtilis B5 khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng chiếu xạ liều 300 Gy 53 Hình 3.10 Kích thƣớc vòng phân giải casein chủng Bacillus subtilis B5 khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng chiếu xạ liều 500 Gy 54 Hinh 3.11 Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml 03 chủng Bacillus subtilis B5, H12 VI liều chiếu xạ khác 55 Hình 3.12 Kích thƣớc vòng phân giải casein chủng Bacillus subtilis B5 khuẩn lạc kháng rifampicin .57 Hình 3.13 Vòng phân giải casein số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng xạ kháng rifampicin 58 Hình 3.14 Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ chủng B.subtilis gel agarose 0,8 % 60 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB (A) gen rpsL (B) từ chủng B.subtilis gel agarose 1,5 % .61 Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm PCR tinh tƣơng ứng với đoạn gen rpoB rpsL gel agarose 1,5 % .62 Hình 3.17 So sánh trnh tự amino acid tiểu phần β – RNA polymerase đƣợc mã hóa từ gen rpoB chủng Bacillus subtilis B5 Bacillus subtilis H12 63 Hình 3.18 So sánh trình tự nucleotide gen rpoB chủng Bacillus subtilis B5 Bacillus subtilis H12 .63 Hình 3.19 Trình tự gen rpoB chủng (B5_rpoB) với chủng đột biến 609 (rpoB-M) 64 Hình 3.20 Trình tự gen rpoB chủng (H12) với chủng đột biến 2, chủng chủng 1379 65 RPOB_19 RPOB_H12 436 RPOB_19 61 RPOB_H12 496 RPOB_19 121 RPOB_H12 556 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTNKRRLSALGPGGLT SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELT+KRRLSALGPGGLT SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLT 60 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG 120 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR 495 555 162 597 *********************************** *** Hình 3.26 So sánh trình tự amino acid tiểu phần β - RNA polymerase chủng H12 chủng đột biến 19-H12 Nhƣ vậy, có hai thay đổi amino acid xảy vị trí 497 dòng 609-B5 vị trí 482 dòng 19-H12 Các đột biến vùng từ vị trí amino acid 410 đến amino acid 600 đƣợc xem đột biến kháng rifampicine (Davati cs, 2013) Đột biến xảy vùng tiểu phần β-RNA polymerase đƣợc xem có liên quan đến khả tăng tổng hợp sản phẩm thứ cấp xạ khuẩn (Wang cs, 2018), tăng khả tổng hợp protease Bacillus (Kurosawa cs, 2006) (Bảng 3.10) Bảng 3.10 Tổng hợp đột biến xuất gen rpoB chủng gây đột biến chọn lọc hoạt tính protease chủng Vị trí đột Đột biến Hoạt độ protease ST Chủng Khuẩn Đột biến dẫn tới (IU/ml) T gốc lạc biến gen rpoB thay đổi aa 301 1556,32±51,91 321 1684,15±55,10 322 1826,42±58,66 528 G487C, G1782C R595C 1518,75±59,97 C488T C1783T Bacillus subtilis 533 G487C G1782C 1735,84±65,40 E497G B5 609 G135A, G1428A, 2017,54±21,35 A197G A1490G 1909 Chƣa rõ 1880,45±74,97 ràng 745,83±19,40 B5 H482N C151A C1444A 1756,73±30,13 10 C151A C1444A 1864,58±65,29 11 19 C151A C1444A 1834,28±29,69 12 1379 C151A C1444A 1772,15±78,44 Bacillus 13 1665 C151A C1444A 1718,66±63,37 subtilis 14 1670 C151A C1444A 1837,12±65,74 H12 15 1713 C151A C1444A 1682,47±61,36 16 1844 C151A C1444A 1841,27±78,41 17 1847 C151A C1444A 1738,56±76,43 18 1904 C151A C1444A 1731,25±66,29 19 C1444 726,67±26,97 H12 69 Kết bảng 3.10 cho thấy rõ chủng đột biến có nguồn gốc từ chủng H12 có đột biến giống xuất gen rpoB thay nucleotide C1444A dẫn tới thay đổi amino acid H482N Các chủng lại có hoạt tính protease giống (khác khơng có ý nghĩa thống kê) cao chủng gốc khoảng 2,4 lần Do vậy, đột biến đột biến có ý nghĩa làm thay đổi khả sinh tổng hợp protease Để kiểm chứng lại vai trò đột biến tách dòng gen đột biến chuyển gen đột biến thay cho gen gốc chủng H12 đánh giá khả sinh tổng hợp protease chủng tái tổ hợp Các chủng đột biến có nguồn gốc từ chủng B5 đa dạng Ngoài chủng 1909 chƣa biết xác đột biến ra, dòng đột biến lại phân thành hai nhóm nhóm có xuất đột biến có ý nghĩa gen rpoB nhóm khơng có đột biến có ý nghĩa gen rpoB (tức chủng khơng có đột biến gen rpoB chủng có đột biến nhƣng không làm thay đổi amino acid) Mặc dù không xuất đột biến có ý nghĩa gen rpoB nhƣng chủng đột biến có hoạt tính protease cao gấp khoảng lần so với chủng gốc sai khác hoạt tính protease chủng khơng có ý nghĩa thống kê Điều rằng, ngồi gen rpoB ra, có đột biến xuất gen mã hóa enzyme/protein quan trọng tham gia vào đƣờng sinh tổng hợp protease mà chƣa khám phá Trong hai dòng đột biến có ý nghĩa gen rpoB sinh tổng hợp protease tốt Chủng 528 mang đột biến R595C sinh tổng hợp protease với hoạt tính tăng gấp lần chủng 609 mang đột biến E497G sinh tổng hợp protease tăng 2,7 lần Giả thiết chủng đột biến mang đột biến gen rpoB dẫn tới làm tăng hoạt tính protease chủng đột biến E497G có vai trò quan trọng đột biến R595C Tuy nhiên, chủng đột biến mang đột biến khác nằm ngồi gen rpoB có vai trò làm thúc đẩy sinh tổng hợp protease gen mã hóa protease bị đột biến dẫn tới làm tăng hoạt tính riêng enzyme 70 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tuyển chọn đƣợc 03/09 chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease cao ổn định sử dụng làm nguyên liệu gây tạo đột biến Đó chủng B subtilis B5, B subtilis H12 B subtilis VI Tần số đột biến kháng streptomycin (20 µg/ml) rifampicin (0,2 µg/ml) 03 chủng vi khuẩn nghiên cứu tăng đáng kể nhờ xử lý chiếu xạ Tần số biến kháng streptomycin lớn 1,61x10-3, 1,68x10-2, 2,22x10-2 tƣơng ứng lần lƣợt với chủng B5, H12 VI gây liều 1000 Gy, tần số đột biến kháng rifampicin chúng đạt giá trị cao liều 2000 Gy Kết hợp chiếu xạ tia gamma xử lý kháng sinh với liều tăng dần chọn đƣợc 17 khuẩn lạc kháng xạ, kháng kháng sinh Kết giải trình tự cho thấy14/17 khuẩn lạc mang đột biến thay gen rpoB khơng có đột biến gen rpsL Đã xác định đƣợc ba đột biến gen rpoB làm thay đổi amino acid R595C (dòng 528-B5), E497G (dòng 609-B5), H482N (dòng 19-H12) beta RNA polymerase Các đột biến nằm vùng qui định tính nhạy cảm với kháng sinh tiểu phần beta RNA polymerase liên quan đến khả tăng tổng hợp protease Bacillus 71 KIẾN NGHỊ: Để kết nghiên cứu đề tài sớm đƣa vào ứng dụng nghiên cứu sản xuất nhóm thực có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu trì tính ổn định đột biến tạo đƣợc nhƣ tối ƣu hóa điều kiện lên men chúng quy mô lớn bổ sung nguồn carbon, nitơ vi lƣợng khác để thu protease tối đa - Phát triển kỹ thuật gây đột biến phóng xạ kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử đại đối tƣợng VSV khác nhau, nhƣ với chất có hoạt tính sinh học khác 72 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Screening potential streptomycin resistant mutations of gamma irradiated Bacillus subtilis B5 for high production of protease Tran Bang Diep1, Nguyen Thi Thom1, Hoang Dang Sang1, Hoang Phuong Thao1, Nguyen Van Binh1, Ta Bich Thuan2, Vo Thuong Lan2, Tran Minh Quynh1, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 32, No 1S 170-176, 2016 Ảnh hƣởng chiếu xạ gamma tới tính kháng streptomycin khả sinh protease chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B5 Hoàng Đăng Sáng, Trần Băng Diệp, Trần Minh Quỳnh, Nguyễn Văn Bính, Nguyễn Thị Thơm, Hồng Phương Thảo Hội nghị khoa học Cơng nghệ hạt nhân cán trẻ ngành lượng nguyên tử lần thứ IV, tr 58,2016 Chọn tạo đột biến Bacillus subtilis triển vọng có khả sinh protease cao phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma kết hợp sàng lọc mơi trƣờng có nồng độ Streptomycin cao Hoàng Đăng Sáng, Trần Băng Diệp, Trần Minh Quỳnh, Nguyễn Văn Bính, Nguyễn Thị Thơm, Hồng Phương Thảo Hội nghị khoa học Cơng nghệ hạt nhân tồn quốc lần thứ 12, tr 205206,2017 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô 2004 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên khả tổng hợp protease Bacillus subtilis Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, số 49 Lê Ngọc Tú , La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng 1989 Enzyme vi sinh vật Tập 2, Nhà xuất Thanh niên Lê Ngọc Tú (chủ biên), La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên 1998 Hóa sinh cơng nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lƣơng Đức Phẩm 2007 Chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Nhà xuất Nông nghiệp Ngô Thị Mai, Nguyễn Thị Dự, Trần Việt Lan, Thái Thị Hào 1995 Nghiên cứu triển khai quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày vào thực tiễn Các công trình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm giai đoạn 1986 – 1995, Viện công nghệ thực phẩm Hà Nội, tr 386 – 391 Nguyễn Đức Lƣợng 2002 Công nghệ vi sinh, tập 2: Vi sinh vật học công nghệ Nhà xuất ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr 216-220, 266-268 Nguyễn Đức Lƣợng 2004 Công nghệ enzyme Nhà xuất ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr 304-317 Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến 1998 Công nghệ enzyme Nhà xuất Nông Nghiệp Phạm Quốc Hùng 2007 Vật lý hạt nhân ứng dụng.Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Phạm Thành Hổ 2003 Di truyền học, Nhà xuất Giáo dục, tr.170-176 11 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa 2006 Công nghệ sinh học, tập 3: Enzyme ứng dụng Nhà xuất Giáo Dục 12 Phạm Thị Trân Châu 1983 Một số đặc tính khả phân giải chất khác proteinase ngoại bào B pumilus Tạp chí Sinh học (1), tr – 13 Trần Ngọc Hùng 2010 Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử dụng chế biến thức ăn gia cầm Luận văn tiến sĩ, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, tr.36 – 42 74 II.Tài liệu tiếng anh 14 Ahn, D H., Kim, H., My, B., 1993 Cleavage of Bacillus subtilis endo-αgluconane by B megaferian.Biotechnology letters GBR 15(2), 127-132 15 Afsharmaesh, H., Ahmadzadeh, M., Javan-Nikkhah, M., Behboudi, K., 2014 Improvement in biocontrol activity of Bacillus subtilis MTB1 against Aspergillus flavus using gamma irradiation Crop Protection 60, 83-92 16 Al-Sudany, G A., Majeed, W Z., Al-Aubeidi, H J., 2010 Detection of gamma radiation effect induced by colbelt-60 on Escherichia coli cells Journal of AlNahrain university Science 13(3), 129-133 17 Aquino, K.A.S., 2012 Sterilization by gamma irradiation In: Gamma radiation, Prof Feriz Adrovic (ed.) In Tech Europe pp 171-206 18 Awan, S D., Tabbasam, N., Ayub, N., Babar, M E., Rahman, M., Ran, S M., Rajoka, M I., 2011 Gamma radiation induced mutagenesis in Aspergillus niger to enhance its microbial fermentation activity for industrial enzyme production Mol Biol Rep 38, 1367-1374 19 Bailey, J E., 1991 Toward a science of metabolic engineering.Science 252, 1668–1675 20 Baltz, R.H., 1998 New genetic approaches to yeild improve secondary metabolite production in Streptomyces.J Ind Microbiol Biotechnology 20,360– 363 21 Barrios, G.J., Fernandez, F.J and Tomasini, A., 2003 Microbial secondary metabolites production and strain improvement Indian Journal of Biotechnology 2, 322–333 22 Bauchinger, M., 1983 Microdosimetric aspects of the induction of chromosome aberrations Radiation induced chromosome damage in Man Mutation research 74, 1-22 23 Beg Gupta, R., Lorenz, Q K P., 2002 Bacterial alkaline protease: molecular approaches and industrial application.Appl Microbiol 59, 15-32 24 Blakely, W F., 2007 Introduction: Chromosome aberration induced by radiation Lecture of Regoninal training course on biological radiation dosimetry, Seoul, Korea 25 Carter, P., Nilsson, B., Burnier, J P., Burdick, D., Wells, J A., 1989 Engineering subtilisin BPN' for site-specific proteolysis Proteins 6(3), 240-8 26 Casqueiro, J., Guti é rrez, S., Ba Buelos, O., Hijarrubia, M.J., Martín, J.F., 1999 Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the lys2 gene leads to penicillin overproduction.J Bacteriol 181, 1181–1188 75 27 Chen, B Y., Janes, H W., 2002 Methods in Molecular Biology, (192) PCR Cloning Protocols, 2nd Edition, Humana Press Inc, Totowa, NJ 28 Davati, N., Najafi, M B H., 2013 Overproduction strategies for microbial secondary metabolites: A review Life Science 3, 23–37 29 De Groot, A., Chapon, V., Servant, P., Christen, R., Fischer-Le Saux, M., 2005 Deinococcus deserti sp nov., a gamma-radiation-tolerant bacterium isolated from the Sahara Desert Int J Syst Evol Microbiol 55, 2441–2446 30 Fenech, M and Morley, A A., 1985 Measurement of micronucle lymphocytes Mutat Res 147, 29-36 in 31 Fox, J W., Shannon, J D., Bjarnason, J B., 1991 Proteinases and their inhibitors in biotechnology Enzymes in biomass conversion ACS Symp Ser 460, 62–79 32 Freije, J.M.P., Fraile, J M and Otin, C.L., 2011 Protease addiction and synthetic lethality in cancer Frontier in Oncology 1,1–7 33 Gonchar, A M and Aulender, V I., 1996 Immobilization of bacterial protease on water solved polymer by means of election beam.Radiation physis and chemis, GBR 48(6), 795-797 34 GuiJun, L., You-ting, M., Su-ling, Y., Fang, B., Hong-zhong, S., 2011 Study on γ-ray irradiation mutation of Bacillus subtilis NCD2 Agricultural Science & Technology 12(11), 1633-1636 35 Gupta, R., Beg, Q.K., Lorenz, P., 2002 Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications Applied Microbiology and Biotechnology 59(1), 15–32 36 Hajati, H., Rezaei, M., 2010 The application of probiotics in poultry production International Journal of Poultry Science 9, 298–304 37 Hersbach, G.J.M., van der Beck, C P & van Dijck, P W M., 1984 The penicillins: Properties, biosynthesis, and fermentation Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme EJ, ed), 45–140 Marcel Dekker, New York 38 Hersbach, G J M., Van der Beck, C P., Van Dijck, P W M., 1984 The penicillins: Properties, biosynthesis, and fermentation Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme EJ, ed), 45–140 Marcel Dekker, New York 39 Hoe, P C K., Rahim, K A and Saud,H M.,2016 A review on microbial mutagenesis through gamma irradiation for agricultural applications.Jurnal Sains Nuklear Malaysia 28(2), 20-29 40 Hosokawa, K., Park, N.H., Inaoka, T., Itoh, Y., Ochi, K., 2002 Streptomycin – resistant (rpsL) of rifampicin – resistant (rpoB) mutation in Pseudomonas putida 76 KH146 – confer enhnced tolerance to organic chemical.Environ Microbiol 4, 703–712 41 Hosoya, Y., Hosaka, J and Ochi, K., 2003 An aberrant protein synthesis activity is linked with antibiotic overproduction in rpsL mutants of Streptomyces coelicolor A3(2).Microbiology 149, 3299–3309 42 Hu, H., Ochi, K., 2000 Novel approach for improving the productivity of antibiotic – producing strain by inducing combined resistant mutations.Applied and Enviromental Microbiology 67, 1885–1892 43 IAEA., 2005 Generic procedures for medical response during a nuclear or radiacal emergency, IAEA in Australia 44 IAEA., 2007 Biodosimetry training course lectures at KIRAM, Seoul, Korea 45 Ichishima, E., Hamamatsu, M., Yamamoto, N., Motai, H., Hayashi, K., 1983 Substrate specificity of alkaline protease from Aspergillus sojae, a soy sauce producing fungus Food Chemistry 11, 187–200 46 Jin, D J and Gros, C.A., 1998 Mapping and sequencing of mutation in the Escherichia colirpoB gene that lead to rifampicin resistance J.Mol Biol 202, 45–58 47 Jong, B C et al., 2010 Effects of gamma rays on an indigenous Bacillus isolate pengaruh sinar gamma pada isolat bacillus 48 Kim, Y K., Bae, J H., Oh, B K., 2002 Enhancement of proteolytic enzyme sctivity excreted from Bacillus stearothermophilus for a thermophilic aerobic digestion process.Bioresource Technology 82, 157-164 49 Ko, K S., Kim, J M., et al., 2003 Identification of Bacillus anthracis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR.J Clin Microbiol 41, 2908–2914 50 Kurosawa, K., Hosaka, T., Tamehiro, N., Inaoka, T and Ochi, K., 2006 Improvement of α – amylase production by modulating the ribosomal component S12 protein in Bacillus subtilis 168.Appl Environ Microbiol 72, 71–77 51 Lai, C., Xu, J., Tozawa, Y., Hosoya, Y., Yao, X., Ochi, K., 2002 Genetic and physiological characterization of rpoB mutations that activate antibiotic production in Streptomyces lividans.Microbiology 148, 3365–3373 52 López-Otín, C and Matrisian, L M., 2007 Emerrging roles of proteinases in tumour suppression Nature Reviews Cancer 7, 800-808 53 Malik, V S., 1979 Genetics of applied microbiology Adv Genet 29, 37–126 77 54 Manczinger, L., Rozs, M., Lgyi, V G and Kevei, F., 2003 Isolation and characterization of a new kerationalytic Bacillus licheniformis strain Word J Microbiol Biotechnol 19, 35-39 55 Mayday,E El., Paquet, D., Ramet, J P and Linden, G., 1986 Proteolutic activity of a Bacillus subtilis neutral protease preparation upon caseins and whey protein of cow‟s milk.Journal of Dairy science 69(2), 305-310 56 Mehrotra, S., Pandey, P K., Gaur, R., Darmwal, N S., 1999 The production of alkaline proteases by Bacillus species isolate Biresource Technol 67, 201-203 57 Moussa et al., 2003 Effect of gamma irradiation on the mosphological characteristic of some pigmented Streptomyces isolated from Egyptiol soil.Isotope and Rad Res.35 (1), 159-177 58 Narumi, I., 2006 Carriers sterilization using γ-irradiation In: Biofertilizer Manual Forum for Nuclear cooperation in Asia (FNCA) Biofertilizer Project Group Asia Cooperation Center, Japan Atomic Industrial Forum (JAIF) Japan 44-48 59 Nascimento, W.C.A and Martin, M.L L., 2004 Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp.Brazilian J Microbiol 35, 91-96 60 Nghiep, T.D., Kojima, T., 1996 An energy-transfer model for radiation dosimetry Communication in Physics (2), 5-12 61 Nghiep, T.D., Minh, D T N., Cong, N T., 2010 Formation and characterization of a hydrophilic polymer hydrogel Journal of Radioanalytical & Nuclear Chemistry 285, 719-721 62 Obe, G and Beck, B., 1984 Human peripheral lymphocytes in mutation research Mutation in man.Springer-Verlag (74), 177-197 63 Ochi, K., 2007 From microbial differentiation to ribosome engineering.Biosci Biotechnol Biochem 71, 1373–1386 64 Ochi, K., Hosaka, T., 2013 New strategies for drug discovery: activation of silent or weakly expressed microbial gene clusters.Appl Microbiol Biotechnol 97, 87– 98 65 Ogino, H., Otsubo, T., Ishikawa, H., 2007 Screening, purification, and characterization of a leather–degrading protease.Biochemical Engineering 38, 234–240 66 Olajuyigbe, F.M and Ajele, J.O., 2005 Production dynamics of extracellular protease from Bacillus species African Journal of Biotechnology 4, 776-779 78 67 Parveen, B., Preston, D L., Doody, M M., Hauptmann, M., Kampa, D., Alexander, B H., Petibone, D., Simon, S L., Weinstock, R M., Bouville, A., Yong, L C., Freedman, D M., Mabuchi, K., Linet, M S., Edwards, A A., Tucker, J D and Sigurdson, A J., 2007 Retrospective Biodosimetry among United States Radiologic Technologists Radiat Res (167), 727–734 68 Protein Hydrolysis Enzymes Market - Global Trends & Forecasts to 2019 Report code: ASDR-104771 Publish date : April 2014 , Pages : 236 69 Raina, S., Murphy, T., De, V.D., Reffatti, P., Keshavarz, T., 2011 Novel strategies for overproduction of microbial products Chemical Engineering Transaction 24, 847–852 70 Ro, D.K., Paradise, E.M., Ouellet, M., Fisher, K.J., Newman, K.L., Ndungu, J.M., Ho, K.A., Eachus, R.A., Ham, T.S., Kirby, J., Chang, M.C., Withers, S.T., Shiba, Y., Sarpong, R., Keasling, J.D., 2006 Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast Nature 440,940–943 71 Romm, H., Oestreicher, U and Kulka, U., 2009 Cytogenetic damage analysed by the dicentric assay Ann Ist Super Sanita 45(3), 251-259 72 Sambrook, J., Russell, D W., 2001.Molecular Cloning-A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition 73 Shafee, N., Aris, S N., Rahman, R.Z.A., Basri, M and Salleh, A.B., 2005 Optimization of Environmental and Nutritional Conditions for the Production of Alkaline Protease by a Newly Isolated Bacterium Bacillus cereus Strain 146 Journal of Applied Sciences Research 1, 1-8 74 Shahbazi, S., Ispareh, K., Karimi, M., Askari, H and Ebrahimi, M.A., 2014 Gamma and UV radiation induced mutagenesis in Trichoderma reesei to enhance cellulases enzyme activity Internat J Farming Allied Sci 3(5), 543-554 75 Simpson, I.N., Caten, C.E., 1979 Induced quantitative variation for penicillin titre in clonal populations of Aspergillus nidulans J Gen Microbiol 110, 1–12 76 Solenberig, P.J., Cantwell, C.A., Tietz, A.J., McGilvray, D., Queener, S.W., Baltz, R.H., 1996 Transposition mutagenesis in Streptomyces fradiae: identification of a neutral site for the stable insertion of DNA by transposon exchange.Gene 168, 62–67 77 Veloorvalappil, N J., Robinson, B S, Pradeep, S., Sreedevi, S., Kizhakkepawothail, N U., et al., 2013 Versatility of microbial proteases Advances in Enzyme Research 1(3), 39-51 78 Voisin, P., Roy, L., Benderitter, M., 2004 Why can‟t we find a better biological indicator of dose? Radiation Protection Dosimetry 112(4), 465-469 79 79 Wang, G., Hosaka, T., Ochi, K., 2008 Dramatic activation of antibiotic production in Streptomyces coelicolorby cumulative drug resistance mutations Appl Environ Microbiol 74, 2834–2840 80 Wayne, L N and Maughan, H., 2002 The Spectrum of Spontaneous Rifampin Resistance Mutations in the rpoB Gene of Bacillus subtilis 168 Spores Differs from That ofVegetative Cells and Resembles That of Mycobacterium tuberculosis J Bacteriol 184(17), 36-40 81 Wilding, C S., Relton, C L., Rees, G S., Tarone, R E., Whitehouse, C A., Tawn, E J., 2005 DNA repair gene polymorphisms in relation to chromosome aberration frequencies in retired radiation workers.Mutat Res 570, 137-45 82 Whiteley, C.G., Lee, D.J., 2006 Enzyme technology and biological remediation Enzyme and Microbial Technology 38, 291–316 83 Yazdi, S., Ardekani, A M., 2012 Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow Biomicrofluidics 6, 104-114 84 Yoon, K H., In-Kyung, S., Kyung, H J., Seung-Hwan, P., 1999 HyperCMCase-Producing mutants of Bacillus sp 79-23 induced by gamma-radiation J Microbiol Biotechnol 9(4), 518- 521 85 Zak, D.R., Pregitzer, K.S., Burton, A.J., Edwards, I.P., Kellner, H., 2011 Microbial responses to a changing enviroment: implication for the future fuctioning of terrestrial ecosystems Fungal Ecology 4, 386–395 III Website 86 http://www.prnewswire.co.uk/news-releases/protease-enzymes-market 87 http://protease.burnham.org 88 http://textbook of bacterialogy.net/Bacillus.html 89 https://www.idtdna.com/https://www.genscript.com/ 90 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 91 http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/ 80 PHỤ LỤC Vòng phân giải casein số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng xạ kháng rifampicin 81 Đƣờng chuẩn Tyrosin xây dựng phƣơng pháp Anson cải tiến Hình thái chủng đột biến Bacillus subtilis - 609 Bacillus subtilis–19 Bacillus subtilis B5 Bacillus subtilis -609 Bacillus subtilis H12 Bacillus subtilis -19 82 83 ... học tập nghiên cứu Đề tài Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả sinh protease cao chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh nhận đƣợc hỗ trợ lớn từ đề tài nghiên cứu khoa... lọc đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis xử lý chiếu xạ 36 2.2.6 Sàng lọc đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh ... subtilis đột biến có khả sinh protease cao chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Sàng lọc số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính sinh protease