HAY

amphipericytic.. Hình 7.2.[r]

Thực vật có hoa

NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2006 Tr 78 – 100.

Từ khoá: Phương pháp phân loại, nhiễm sắc thể, tế bào, izoenzym, giải phẫu.

Tài liệu Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục

đích học tập nghiên cứu cá nhân Nghiêm cấm mọi hình thức chép, in ấn phục vụ mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản tác giả

Mục lục

Chương Các phương pháp phân loại

7.1 Phương pháp phân loại hình thái

7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu

7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì

7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ

7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa

7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 10

7.4.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 10

7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc 16

7.4.3 Kiểu nhân 17

7.5 Phương pháp phân loại izoenzym 18

7.5.1 Định nghĩa izoenzym 18

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym kỹ thuật điện di 19

7.6 Phương pháp phân loại ADN 23

Chương 7. Các phương pháp phân loại

7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR 23

7.6.2 Phân loại dựa kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP 24

7.6.3 Phân loại dựa kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD 24

7.6.4 Phân loại dựa kỹ thuật nhân đoạn AFLP 25

Chương 7

Các phương pháp phân loại

7.1 Phương pháp phân loại hình thái

(Xem chương 10)

7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu

7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì

Biểu bì dấu hiệu có ý nghĩa phân loại nhiều người sử dụng trước hết cấu trúc kiểu tế bào biểu bì ví dụở Vulpa (hình 7.3) hay kiểu lơng bề mặt,

ví dụ Combretum (hình 7.1) Các kiểu lơng tùy theo điều kiện xem

kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2)

Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lơng, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc lớp biểu bì để

xem cấu tạo hệ thống lỗ khí người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt sau bóc để xem cấu tạo tế bào quanh lỗ khí Ba mươi lăm kiểu lỗ khí tìm thấy thực vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn phân loại Những kiểu thường có ý nghĩa

bậc taxơn cao Ví dụ Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, có liên quan

chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm

mạnh dấu hiệu đặc trưng hạn chế Do người ta quan tâm dấu hiệu giải phẫu quan dinh dưỡng tế bào học tế bào biểu bì quan tâm

7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ

Cấu tạo giải phẫu gỗ nghiên cứu cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm tiêu làm mủn Nó có ý nghĩa lớn tiến hóa (hình 7.3 – 7.8) Dụng cụ nghiên cứu kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi vật kính

7.2.2.1 Làm tiêu lát cắt

Theo tính chất gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, gỗ mềm cắt trực tiếp ngay, khơng cần qua bước xử lý Nếu gỗ cứng xử lý glyxerin cồn đun nước sôi để vài tiếng đồng hồ tiến hành cắt Mục đích cho tống hết bọt khí làm cho gỗ mềm tiêu nguyên vẹn

Hình 7.1.

Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974)

A anomocytic, B cycocytic; C amphicyclocytic; D actinocytic, E anisocytic,

F amphianisocytic, G adiacytic, H amphidiacytic, I.paracytic, J amphiparacytic, K brachyparacytic, L amphibrachyparacytic, M hemiparacytic, N paratetracytic,

O amphitetracytic, P brachyparacytic, Q amphibrachyparatetracytic, R

staurocytic,

S anomotetracytic, T parahexacytic-monopolar, U parahexacytic-dipolar,

V brachyparahexacytic-monopolar, W brachyparahexacytic-dipolar, X polocytic, Y copolocytic, Z axillocytic, AA coaxillocytic, BB desmocytic, CC pericytic, DD

copericytic, EE amphipericytic

Hình 7.2

* Khử nước nguyên liệu: Vật mẫu lấy khỏi dung dịch làm mềm phải rửa thật kỹ nước thường ngâm vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai lần thứ ba Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút tùy theo độ dày vật mẫu

* Chuyển vào dung môi trung gian: sau lấy mẫu khỏi cồn tuyệt đối lần thứ ba, chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, lần thứ hai, giai đoạn để - sau

đưa vào xylen lần thứ lần thứ hai, giai đoạn không 30 phút * Chuyển vào parafin: từ môi trường xylen ta chuyển tiếp sau: Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), đểở nhiệt đồ bình thường - Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữở 40o khoảng -

Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 3), giữở 40o khoảng - giờ, sau cho vào parafin nóng chảy tủ sấy nhiệt độ tủ cao không 62oC Thời gian để phụ thuộc vào bề dày mẫu chất mơ, có thểđể từ 10 - 12 giờđến vài ngày Nhiệt độ tủ sấy phải giữđều

Hình 7.3

Các dạng tế bào biểu bì Vulpia alopecuros: A Mặt bụng; B Mặt lưng

V tenuis: C Mặt bụng; D Mặt lưng (theo Cotton

Stace, 1977) Tế bào silic có màu đen * Đúc khối parafin để dựng vật mẫu:

Khi parafin ngấm hồn tồn vào vật mẫu đem đúc thành khối, sau để nguội Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào khối parafin Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau parafin đơng đặc phải dùng kim sắt hơ nóng parafin chảy nóng trở lại

• Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: khối parafin nói thường chứa nhiều vật mẫu phải chia mẫu nằm khối parafin nhỏ riêng Sửa khối parafin mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vng Các cạnh đối diện mặt cắt phải song song với

- Tiến hành cắt: Có thể cắt tay máy cắt Sau gỗ làm mềm tiến hành cắt

theo mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến xuyên tâm

Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa mỏng vừa giữ yếu tố nguyên vẹn Sau

sửa thành mảnh cách cân đối (vuông hay chữ

nhật)

- Loại parafin lát cắt: để nhuộm quan sát vi phẫu, cần loại hết parafin lát cắt

Phương pháp loại parafin sau: chuyển mẫu

qua ống Boren đựng dung dịch

Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút

Xylen (lần thứ hai) Thời gian phút

Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian phút

Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian phút

Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian phút

Cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian phút

Cồn 96o Thời gian phút

Cồn 70o Thời gian phút

Cồn 50o Thời gian phút

Cồn 30o Thời gian phút

Nước cất: Thời gian phút

Sau chuyển tiêu vào chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu

* Nhuộm màu:

Thuốc nhuộm safranin - 9% cồn tuyệt đối, dùng ta phải pha lo•ng gấp đơi

Cách nhuộm: Lấy lát cắt thấm

khô tiến hành nhuộm thuốc nhuộm safranin từ phút đến Sau cố định HCl rửa nước cất cho Chuyển sang giai đoạn loại nước

Loại nước: Để loại cắt ngâm dung dịch cồn từ

nồng độ thấp đến cao Vì cồn tan

nước rút nước Sau

chuyển sang dung dịch cồn + xylen D•y

các dung dịch xylen nồng độ cao dần để

loại hết cồn (do keo canada tan xylen) Cuối chuyển sang dung dịch xylen + cacbon có tác dụng khử trùng Vật mẫu ngâm dung dịch với khoảng thời gian từ 15

đến 30 phút

Hình 7.4

Các giai đoạn tiến hóa phiến rây từ kép

đến đơn (Takhtajan 1964)

Hình 7.5

Lát cắt xuyên tâm gỗ Tetracentro sinensis

* Dán tiêu bản:

Chuẩn bị lamen lam kính Đặt

các lát cắt loại ngâm

dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa

đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada đậy từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất

7.2.2.2 Làm tiêu ngâm mủn

Dựa nguyên tắc số hóa chất có tác dụng phá hủy màng gắn tế bào,

làm cho tế bào tách rời Phương pháp thường dùng để nghiên cứu tế bào

nguyên vẹn mà không làm hư hại chúng

Phương pháp tiến hành sau:

* Làm mủn: Cũng lấy mẫu gỗ ban

đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm,

cho vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3

và sau thêm nước cho ngập gỗ

và đun đèn cồn khoảng 15 - 20

phút Khi thấy que gỗ trắng ra,

dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để

lắng dùng nước cất rửa axit, sau

ngâm cồn khoảng 15 phút Tiến

hành trình nhuộm

* Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm

safranin - 9% cồn Thấm khô mẩu

gỗ mủn giấy thấm, cho vài giọt thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu)

để khoảng phút, cốđịnh HCl, rửa nước sau tiến hành loại nước

• Loại nước: Ngâm dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau q trình rút cồn khỏi tế bào xylen (vì

keo canada tan xylen khơng tan cồn) Q trình tiến hành cách

chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai cuối cacbon xylen tương tự tiêu cắt lát

Hình 7.6

Các giai đoạn tiến hóa thủng lỗ từ kiểu hình thang kiểu trung gian từ kiểu đối tới kiểu cách (Takhtajan 1964)

Hình 7.7

Các giai đoạn tiến hóa thủng lỗ hình thang từ kiểu thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ

• Dán tiêu bản: Sau mẫu

được loại nước thấm xylen lấy

mủn, dùng kim mũi mác dàn lam

kính khô, nhỏ vài giọt keo

canada từ từđậy lamen

7.2.2.3 Quan sát

* Quan sát mắt thường

cấu tạo chung gỗ

* Quan sát kính hiển vi

và mơ tả

* Đo đạc kính hiển vi

dựa trắc vi vật kính trắc vi thị kính yếu tố cần mơ tả

* Chụp ảnh mô tả

7.2.2.4 Đánh giá phân loại

Căn mô tả sơđồ tiến hóa, phân tích,

đánh giá mức độ tiến hóa khác nhau, lập thành khóa xác định

7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa

Phấn hoa dấu hiệu nhiều nhà phân loại sử dụng tính ổn định nó, dễ

lấy mẫu, phương pháp đơn giản, tốn thời gian tiến hành ngắn phù hợp với nghiên cứu phân loại Mặt khác chúng thể mức độ tiến hóa cách rõ ràng qua dấu hiệu hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt đa dạng chúng có mặt rãnh, số lượng rãnh, có mặt lỗ, số lượng chúng rãnh, cấu trúc rãnh (hình 7.10 - 7.12)

A

B

2

9

8

7

Hình 7.8

Sơđồ tiến hóa kiểu tia (A) nhu mơ gỗ

(B) Dị hình hỗn hợp với tần dài; Dị hình hỗn hợp với tận ngắn; Dị hình dãy; Đồng hình hỗn hợp; Đồng hình nhiều dãy; Đồng hình dãy; Nhu mơ phân tán; Khơng dính mạch giải (gian mạch); Nhu mơ quanh bó (Takhtajan 1964)

Hình 7.9

4

Hình 7.10.

Hình thái hạt phấn

1 Hình bầu dục đứng; Hình cầu gai; Hình ngũ giác gai thấp; Hình bầu dục đứng rộng bề mặt mạng lưới (Webster)

Phương pháp tiến hành theo bước sau:

+ Lấy mẫu nghiên cứu: mẫu hạt phấn lấy từ hoa trưởng thành mẫu cho vào túi giấy nhỏ ghi rõ tên khoa học tiêu bản, số hiệu nơi lưu giữ

+ Xử lý mẫu: có nhiều phương pháp để xử lý

mẫu bào tử phấn hoa phương pháp axetolyza

sử dụng phổ biến, nhuộm làm sáng Các bước tiến hành sau:

* Cho mẫu chứa phấn hoa vào ống nghiệm, khẽ

nghiền nhỏ

* Pha hỗn hợp axetoliza: cho vào ống đo 4,5 ml

alhydric, sau cho thêm vào ml H2SO4 đậm đặc

* Đổ hỗn hợp vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hoa, sau đun sơi nồi cách thủy nhiệt độ 70 – 100oC, vừa đun vừa khuấy đũa thủy tinh, đưa ly tâm phút với vận tốc 300 vòng/phút, đổ dịch

đi

* Rửa vật mẫu nhiều lần cách cho hỗn hợp cồn 95o nước cất theo tỷ lệ 3:1 vào ống nghiệm ly tâm

đổ nước đi, cho thêm nước cất vào ống nghiệm, lọc mẫu

* Chia vật mẫu thành phần A,B,C xử lý tiếp

sau:

• Phần A cho thêm vào ống nghiệm hỗn hợp cồn 95o

với nước cất theo tỷ lệ 3:1, ly tâm gạn nước • Phần B nhuộm màu Cho vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hỗn hợp nước cất giọt fusxin, để yên từ - phút; quay ly tâm gạn nước rửa vật mẫu hỗn hợp cồn nước cất ly tâm gạn nước

• Phần C làm mẫu sáng Rửa vật mẫu hỗn hợp cồn nước cất, ly tâm gạn nước

trong Đổ hỗn hợp làm sáng mẫu vào ống nghiệm để yên phút sau ly tâm phút gạn

nước Hỗn hợp làm sáng gồm có: Axit axetic đặc (8ml), NaClO3 30% (12 giọt), HCl

(1ml)

A

B

Hình 7.11.

Ảnh hiển vi cấu trúc bề mặt hạt phấn A: loài họ Cúc -

Compositae; B: loài họ

Đổ phần B phần C vào phần A, cho vào ống nghiệm nước cất khuấy đều, ly tâm phút gạn nước

Rửa vật mẫu cồn 95o nước cất, ly tâm gạn nước Cho vào ống nghiệm glyxerin đặc, khuấy để yên

+ Làm tiêu hiển vi hạt phấn: hút mẫu pipet, nhỏ dịch mẫu lên lam kính để

soi, quan sát (chụp ảnh, mơ tả, đo kích thước tiêu tạm thời với kính hiển vi quang học vật kính *20, *40

+ Phương pháp đo hiển vi: để đo kích thước hạt phấn gồm đo trục xích đạo trục cực hạt phấn dùng thước đo vật kính thước đo thị kính Mỗi số đo 30 mẫu, số đo kích thước xử lý theo phương pháp thống kê để tính kích thước trung bình độ lệch chuẩn mẫu

+ Phương pháp mơ tả: lồi cần có mơ tả Đây phần tư liệu sở

của nghiên cứu, sơ đồ mô tả gồm: Tên khoa học, họ; địa điểm thu mẫu, người thu, số hiệu, nơi lưu giữ Bảo tàng hay phịng mẫu; kiểu hạt phấn, kích thước đặc điểm khác

+ Phương pháp chụp ảnh hiển vi: phương pháp nhằm mục đích minh hoạ cho phần mơ tả hình thái hạt phấn, địi hỏi phải phản ánh xác hình dạng, cấu trúc hạt phấn vị trí khác hai vị trí: cực xích đạo, đơi vị trí nghiêng cần Phải làm rõ cấu trúc phân lớp vỏ hạt phấn ảnh phân tích sáng

Các quan sát để chụp ảnh tiến hành tiêu tạm thời gắn glyxerin với kính hiển vi quang học Hiện với kỹ thuật đại người ta có nhiều cách chụp khác để

thể cách đầy đủ chi tiết đối tượng

+ Đánh giá lập khóa định loại: sở thông số mô tả dấu hiệu liên quan đến tiến hóa để xây dựng khóa phân loại

7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào

7.4.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu hệ thống học tế bào thực vật thể nhiễm sắc tồn

các taxơn thực vật bậc thấp bậc cao Để nghiên cứu thể nhiễm sắc phục vụ cho hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc giai đoạn phân bào nguyên nhiễm cụ thể người ta thường sử dụng mầm non lá, đỉnh sinh trưởng thân,

đỉnh rễ non đỉnh rễ hạt vừa nẩy mầm vùng giai đoạn phân chia mạnh vùng phân chia ở lớp bao quan Bên cạnh

đó người ta tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể

người dùng non họ Lúa (Poaceae) sau hay nhú nụ

hoa lồi khác lúc chưa có màu đặc trưng từ hạt phấn cho nẩy mầm ống nghiệm

Phương pháp thông thường tiện lợi dễ chủđộng gieo hạt đĩa petri nhiệt

với lồi gỗ có hạt to có vỏ cứng tốt lấy trực tiếp từđỉnh sinh trưởng thân hay non trồng thành sau lấy trực tiếp từđỉnh rễ non Trước lấy - từđêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủẩm để kích thích rễ phát triển Thời gian lấy rễ tốt khoảng - 10 sáng tùy mùa, loài sinh sản hành, thân củ hay hom v.v phải đặt hom, củ hay hành cát ướt lọđựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo

Hình 7.12.

Hình thái rãnh bề mặt hạt phấn (Webster)

1., Hạt phấn rãnh, Hạt phấn rãnh; Hạt phấn nhiều rãnh; Hạt phấn rãnh;

6 Hạt phấn rãnh; Hạt phấn rãnh; 8.Hạt phấn không rãnh

7.4.1.1 Xử lý đối tượng trước lúc cố định

Trong số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc thể nhiễm sắc dài trước cốđịnh phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng thân qua số thuốc

- oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen làm lạnh

Đối tượng sau ngắt khỏi thể thực vật phải cho vào dung dịch - oxyquinolin

ở nồng độ 0,002 M nhiệt độ 10-14oC khoảng Trong trường hợp người ta

pha dung dịch sau: dùng 0,58 g - oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm Xử lý

chất để làm tăng độ lớn thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài chúng, đồng thời làm cho eo sơ cấp thứ cấp rõ

Muốn xem thể nhiễm sắc dễ dàng xác trước xử lý đối tượng cần làm lạnh

ở 0oC 24 lúc thể nhiễm sắc co ngắn đáng kể Kagava ngâm dung dịch chloranhydrat 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm sắc sau cho vào nước cất để rửa tiếp tục cho vào buồng ấm - cho vào dung dịch cố định Những năm gần người ta sử dụng dung dịch Consixin 0,01 - 0,05% để xử lý thời gian

trước cố định

Đối với non người ta ngâm dung dịch consixin 0,2% -

Người ta dùng dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc để xử lý rễở nhiệt độ

12 - 16oC - Để có dung dịch lấy - 10 g tinh thể

paradiclorobenzen hòa tan 500 ml nước cất để bình đậy kín đặt vào tủấm nhiệt

độ 60oC 10 - 12

Để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch consixin kết hợp với hỗn hợp

dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 thời

Để nghiên cứu hình thái thể nhiễm sắc đơi trước cố định người ta xử lý theo

trong phương pháp sau:

1 Ngâm vào dung dịch cumarin 2% giờở nhiệt độ 12-16oC

2 Ngâm vào hỗn hợp dung dịch cumarin 2% - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1

trong thời gian giờở nhiệt độ 16oC (Nikolop Daxcalop, 1966)

7.4.1.2 Cố định vật mẫu

Vật mẫu sau xử lý chuyển vào dung dịch cố định khoảng thời gian định tùy thuộc vào dung dịch khác Khi tiến hành cố định cần ý số nguyên tắc:

1 Lượng dung dịch để cố định phải nhiều khối lượng vật mẫu cốđịnh 50 - 100 lần

2 Cố định vật mẫu sau vừa tách vật mẫu khỏi thể cây, khơng tiến hành việc cốđịnh ngồi ánh nắng

3 Đối với vật mẫu lớn phải tách nhỏ bỏ phận không cần thiết trước cố định

4 Trước lấy mẫu khỏi phải tạo điều kiện thuận lợi nhiệt độ, vềđộ ẩm

để thúc đẩy trình phân chia tế bào tưới nước, đểở nhiệt độ 20 - 25oC

5 Phải chuẩn bị ống nghiệm, tốt lọ penicilin hay lọ nút nhám có nh•n đầy

đủ Nh•n lọ phải khớp nh•n đĩa petri, chậu hay đồng ruộng

6 Nếu trồng chậu dùng tay trái lật ngược chậu lên dùng tay phải bỏ chậu Các rễ mọc bám trắng xung quanh bồn đất Dùng kéo cắt rễ non trắng nõn, khoắng vào chậu nước cho đất nhúng vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định Nếu gieo hạt đĩa petri dùng panh kim mũi mác để ngắt rễ Mỗi lần ngắt xong cho vào dung dịch xử lý hay dung dịch cốđịnh

Hiện có nhiều loại dung dịch cốđịnh khác Về nguyên tắc dung dịch có tác dụng làm cho tế bào thực vật chết cách nhanh chóng mà khơng gây ảnh hưởng đến số

lượng hình thái thể nhiễm sắc tế bào Để nghiên cứu thể nhiễm sắc người ta thường dùng dung dịch Navasin Cacnua Tất thuốc cố định pha cồn pha nước Thuốc pha cồn thường ngấm nhanh nên giữ vật mẫu từ 30 phút đến 12 giờ, cịn thuốc pha nước mức độ ngấm vào mơ chậm

đó giữ đến 24 hay lâu

* Dung dịch Navasin 10:4:1

Dung dịch sử dụng phổ biến Thời gian cố định rễ non 24

trong tối

Thành phần:

• Axit cromic 10% : 10 phần

• Foocmalin 16% tức foocmalin thị trường 40% : phần

• Axit axêtic kết băng: phần

* Dung dịch Cacnua : : :

Dung dịch sử dụng phổ biến Thời gian cốđịnh từ - 12 Thành phần:

• Cồn êtylic 96% hay 100%: phần

• Clorơphooc: phần

• Axit axêtic kết băng: phần

* Dung dịch Clac (còn gọi dung dịch Cacnua cải tiến : 1) Thời gian cốđịnh - 12 giờđơi có thểđể lâu hơn, nhiệt độ 0-3oC Thành phần:

• Cồn êtylic 96 độ hay 100 độ : phần

• Axit axêtic kết băng : phần

Ba loại dung dịch sử dụng phổ biến vừa đơn giản, vừa dễ

kiếm Ngoài đối tượng thực vật dùng công thức sau (Sacma, 1965):

1) - Axit propionic: phần

- Cồn êtylic 95 độ: phần

hoặc : - Axit propionic: 100 ml

- Cồn êtylic 95 độ: 100ml

- Hydroxit sắt : 0,4 g

2) - Axit propionic: 1phần

- Clorophooc: phần

- Cồn êtylic 95 độ: phần

3) - Phoocmalin: phần

- Cồn êtylic 95 độ: 15 phần

- Axit propionic: phần

Dung dịch thứ có tác dụng - dùng cho thực vật lẫn động vật

7.4.1.3 Rửa vật mẫu

Sau cố định xong vật mẫu cần rửa thuốc cố định Đối với thuốc pha nước người ta cho vật mẫu lẫn nh•n vào túi vải cuộn lại ngâm vào cốc thủy tinh chứa nước phía đặt vịi nước chảy liên tục Thời gian rửa - mùa

hè, - mùa đông Sau rửa xong phải làm nước cách cho vào dung

dịch cồn êtylic theo mức độ 20%, 40%, 60%, 80% Mỗi lần ngâm thời gian 30

phút mục đích vật mẫu không bị quăn lại làm nước Sau làm nước người ta giữ vật mẫu lâu dài cồn 80%

Đối với thuốc cố định pha cồn vật mẫu sau cố định xong rửa cồn 80% lần - hết mùi axit axêtic Muốn người ta dùng vải bịt lọ

rồi đổ thuốc đổ cồn 80% vào, sau - lại thay cồn lần Vật mẫu rửa

7.4.1.4 Làm mủn vật mẫu

Giai đoạn quan trọng vật mẫu chuẩn bị làm tiêu ép Để làm

mủn người ta dùng axit axêtic 45%, axit propionic 40 - 45%, chloranhydrat, axit chlohydric

1N enzym ởđây giới thiệu phương pháp đơn giản dễ làm sau: Sau rửa vật mẫu nước cất liền cho vật mẫu ngâm vào dung dịch HCl 1N phút (dung dịch HCl 1N chuẩn bị sau: Lấy 82,5 ml HCl tỷ trọng 1,19 cho nước cất vào tới mức 1000 ml) Sau tiếp tục cho vật mẫu vào dung dịch HCl: H2O (tỷ lệ : 1) thời gian 20 phút Rửa vật mẫu nước theo phương pháp

7.4.1.5 Nhuộm vật mẫu

Phương pháp nhuộm vật mẫu để nghiên cứu thể nhiễm sắc có nhiều, ởđây chúng tơi giới thiệu hai phương pháp dễ sử dụng cho kết tốt:

1 Nhuộm axêtôcacmin

Chuẩn bị thuốc nhuộm: lấy g cacmin hòa vào 45 ml axit axêtic kết băng 55 ml

nước cất Việc hịa tan tiến hành bình cầu có thiết bị làm nguội, đặt bình cầu bếp, đun cách thủy thời gian 30 - 60 phút, khơng có thiết bị làm nguội đậy phễu trước đặt lên bếp

Dung dịch axêtocacmin có màu đỏ tối, sau làm lạnh lọc đổ vào lọđậy nút nhám (cặn giấy lọc sử dụng lại cho lần sau)

Theo Snao (1953) chuẩn bị cacmin cồn êtylic có thêm HCl Muốn lấy

4 g cacmin hòa tan vào 15 ml nước nóng cho thêm 1ml HCl để nguội đổ vào 95 ml cồn

85% lọc

Cách nhuộm: Cho vật mẫu vào dung dịch thuốc nhuộm phút, rửa nước chuyển vào dung dịch phèn sắt amơni - 5% hơ nóng bốc

2 Nhuộm hêmatôxylin:

Chuẩn bị thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm hêmatơxylin có nhiều công thức để nghiên cứu thể nhiễm sắc, giới thiệu công thức Gormôri vừa đơn giản vừa dễ làm:

* g hêmatơxylin hịa tan 100 ml nước;

* g phèn crơm hịa tan 100 ml nước;

* ml crômat kali bicrômat kali;

* ml H2S04 5%

Nếu hêmatơxylin có dạng hạt, trước hết hịa tan với cồn sau hịa tan riêng biệt loại ta hỗn hợp lại thứ với theo thứ tự sau: Phèn crôm -

hêmatôxylin - crômat kali - H2S04 dung dịch để yên - ngày sau sử dụng

Thời gian sử dụng thuốc từ - tuần lễ

Cách sử dụng: Vật mẫu sau làm mủn HCl rửa vật mẫu nước cất cho

ngâm vào dung dịch hêmatôxylin để tủấm 60oC thời gian 20 - 30 phút

7.4.1.6 Làm tiêu tạm thời

Sau nhuộm vật mẫu, vớt vật mẫu cho vào lọ nước cất giữ lâu dài nhiệt độ 30oC Vật mẫu vớt lên kính đặt giọt axit axêtic 45% gạt bỏ

đầu kim mũi mác ấn nhẹ làm cho vật mẫu dát mỏng đặn từ từ Nếu vật mẫu cứng khó dát mỏng trước cần hơ qua đèn cồn vật mẫu mềm (chú ý hơ tránh làm khô nước axit axêtic phiến kính) Khi dát xong phiến kính, quan sát từ giác nhỏđến giác lớn để tìm tế bào nhiễm sắc tách rời rõ nhiễm sắc cấu trúc rõ đầy đủ

7.4.1.7 Chuyển tiêu tạm thời thành tiêu cố định

Trong thực tế có nhiều phương pháp chuyển tiêu tạm thời thành tiêu cố định Phương pháp đơn giản dùng khí cacbonic để làm rắn tiêu Quá trình tiến hành

sau: Sau quan sát thấy tiêu tạm thời tốt chuyển sang giai đoạn cố định cách mở van bình khí cacbonic xì vào mặt lưng tiêu bản, nước tiêu bản, kết tinh lại tiêu hóa đá, lấy lưỡi dao cạo râu tách phiến kính khỏi kính, dùng cặp kẹp lấy phiến kính cho kính phiến kính vào lọ cồn 96o - 100o Sau 10 - 30

phút vớt hong khơ khơng khí phịng Vật mẫu dán Euparon Nếu

khơng có Euparon phải dán keo Canada

Cách tiến hành thay đổi sau: Vật mẫu ngâm cồn 96o từ - phút

chuyển sang cồn 100o - phút, cồn 100o Xylen từ - phút, cuối chuyển

vào Xylen, sau dán tiêu keo Canađa

C

Hình 7.13

Hình ảnh NST từ tiêu (A), vẽ lại (B) sơđồ hóa (C) (theo Stace 1996)

7.4.1.8 Xác định vị trí tế bào đo đếm, chụp ảnh thể nhiễm sắc

Sau dán tiêu hong khơ cho tiêu lên kính hiển vi có đầy đủ vật kính Quan sát từ vật kính nhỏđến vật kính lớn để xác định tế bào chứa thể nhiễm sắc rõ thể cấu trúc tốt dựa vào thước đo bàn kính hiển vi đểđánh dấu số hiệu mẫu nghiên cứu số hiệu vị trí tế bào tốt ghi vào nh•n dán vào

đầu kính

Các bước nghiên cứu trước hết tiến hành đếm số lượng thể nhiễm sắc nhiều tế bào tiêu nhiều tiêu để khẳng định cách xác Mỗi lồi cần thu mẫu tiến hành nghiên cứu nhiều địa điểm cách xa nhau, từ địa điểm trở

lên Sau khẳng định xác số lượng thể nhiễm sắc lồi sang bước tiến hành xác định tế bào thể hình thái thể nhiễm sắc tốt tiến hành vẽ hay chụp ảnh

hiệu nằm độ sâu khác mà ảnh chụp không tài thể Ngồi việc vẽ chụp ảnh người ta cịn tiến hành đo kích thước thể nhiễm sắc cách lắp trắc vi vật kích trắc thị kính vào kính hiển vi địi hỏi tiến hành thí nghiệm cần phải thống bước thời gian thu mẫu, thời gian xử lý, thời gian cốđịnh thời gian nhuộm

7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc

Chúng ta quan sát rõ hình thái thể nhiễm sắc pha (metaphase) phân bào giai đoạn hình thái cấu trúc thể thể nhiễm sắc rõ lúc mà thể

nhiễm sắc đơng đặc dễ bắt màu

Thể nhiễm sắc có hình que, hình chữ I hay hình chữ V có chỗ eo gọi eo cấp I chia thể nhiễm sắc thành vai Vị trí tương ứng với vị trí tâm động (centromere) Tuỳ theo vị trí tâm động mà người ta phân biệt thể nhiễm sắc thành kiểu khác Theo

Levan et al (1965, ghi theo Clive A Stace, 1996) đưa thang phân chia loại nhiễm sắc

thể theo tỉ lệ vai dài so với vai ngắn, theo đó:

M (m): - 1,7; Sm: 1,7 - 3; SA: - 7; A: * * T: *

7.4.2.1 Thể nhiễm sắc tâm (Telocentric) kí hiệu T

Là thể nhiễm sắc có tâm động tận cùng, thể nhiễm sắc bao gồm vai Loại gặp thực vật

7.4.2.2 Thể nhiễm sắc tâm mút (Acrocentric) kí hiệu A

Là thể sắc có tâm động gần đầu thể nhiễm sắc gồm vai: vai dài vai ngắn tỷ lệ vai dài vai ngắn từ - ∞

Hình 7.14

Hình thái kiểu nhiễm sắc thể (Levan et al theo Stace 1996)

7.4.2.3 Thể nhiễm sắc tâm cận mút (Subacrocentric) kí hiệu Sa

Là thể sắc có tâm động gần đầu thể nhiễm sắc gồm vai: vai dài vai ngắn tỷ lệ vai dài vai ngắn từ -

7.4.2.4 Thể nhiễm sắc tâm cận lệch (submetacentric) kí hiệu Sm

7.4.2.5 Thể nhiễm sắc tâm (Metacentric) kí hiệu M (m)

Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm khoảng giữa, tỷ lệ vai dài so với vai ngắn khoảng - 1,7 (kí hiệu m), trường hợp tỉ lệđó gọi thể nhiễm sắc tâm cân (M)

Sơđồ hóa hình thái thể nhiễm sắc trình bày hình 7.14 Một số thể nhiễm sắc có thêm eo thứ Eo thường nằm phần cuối vai số khác tận thể nhiễm sắc có mang phần phụ hình cầu hay hình dài gọi thể kèm Thể kèm nối

với phần sợi nhỏ khơng có axit Thymenucleic (sine acido thymonucleico)

trong nên có tên gọi thể nhiễm sắc SAT; thật có ADN phần thể nhiễm sắc (Gây, 1931) Đối với tất tế bào thể thể nhiễm sắc có hình dạng khơng đổi cốđịnh loài chi Vị trí tâm động, chiều dài vai, eo cấp thể kèm qui định đặc tính cá biệt thể nhiễm sắc loài

Bên cạnh thể nhiễm sắc bình thường nhưđã trình bày gọi thể nhiễm sắc A,

một số loài số cá thể loài người ta thấy xuất số thể

nhiễm sắc có kích thước nhỏ nhiều so với thể nhiễm sắc bình thường thường có dạng cầu nhỏ gọi thể nhiễm sắc bổ sung hay gọi thể nhiễm sắc B

7.4.3 Kiểu nhân

ở thể sinh sản hữu tính tế bào sơma nhiễm sắc lưỡng bội (diploide) ký hiệu 2n Bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội tập hợp từ hai đơn bội (haploide) (gặp tế bào sinh dục) ký hiệu n Bộ thể nhiễm sắc khác chất lượng tạo thành thể thống tồn vẹn gọi Jenơm (genom) Do giao tử lồi lưỡng bội có Jenơm cịn tế bào sơma có Jenơm

Số lượng thể thể nhiễm sắc thay đổi từ lồi sang lồi khác q trình tiến hóa Thơng thường số lượng thể nhiễm sắc tăng lên so với số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy Số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy gọi số lượng thể nhiễm sắc ký hiệu X tương ứng với số lượng thể nhiễm sắc giao tử loài lưỡng bội Hiện tượng tăng số lượng thể nhiễm sắc gọi tượng đa bội Các thểđó gọi thể

đa bội (polyploide) loài đa bội chứa nhiều Jenơm Ví dụ giống Lúa mì

(Triticum) có lồi với số lượng thể nhiễm sắc tương ứng 14, 28, 42 số lượng thể

nhiễm sắc đơn bội tương ứng chúng: 7, 14, 21 Số lượng thể nhiễm sắc chúng A = công thức thể nhiễm sắc viết sau:

2n = 2x = 14 (lồi chứa Jenơm);

2n = 4x = 28 (lồi chứa Jenơm);

2n = 6x = 42 (lồi chứa Jenơm)

Trong thiên nhiên số thể xuất q trình thụ tinh gọi đơn tính sinh (apomixic) nên chúng có số lượng thể nhiễm sắc đơn bội Các thểđơn bội

khơng có khả sinh sản đường hữu tính ví dụ Bồ công anh (Taraxacum officinale) thuộc họ Cúc (Asteraceae)

tựu nghiên cứu thể nhiễm sắc góp phần quan trọng để hồn thiện xác hóa sơđồ phân loại có Nhờ giải nhiều vấn đề mà phương pháp so sánh hình thái giải

Hiện khoa học di truyền học ngày thâm nhập vào hệ thống học,

chỉ số số lượng thể nhiễm sắc có chẳng có ý nghĩa hết nhiều lồi họ

thậm chí chi có số lượng thể nhiễm sắc giống nhau, người ta tiến tới sử dụng tiêu

kiểu nhân (caryotype) xây dựng nên sơđồ thể nhiễm sắc (idiogramme) hay biểu đồ nhân

(caryogramme) để so sánh đánh giá

Kiểu nhân tập hợp tất đặc tính số lượng, chất lượng thể nhiễm sắc (Số

lượng, kích thước, hình thái cấu trúc thể nhiễm sắc) Biểu đồ nhân hình ảnh cụ thể thể nhiễm sắc xếp theo thứ tự định đôi tương đồng từ

thể nhiễm sắc tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút cuối vùng thể nhiễm sắc SAT Biểu đồ

nhân dựa vào ảnh chụp dựa vào vẽ xếp theo hai cách: 1/ tất thể

nhiễm sắc đặt mút thể nhiễm sắc nằm đường thẳng 2/ đặt tâm động cặp thể nhiễm sắc nằm đường thẳng Trong hai cách cách thứ

được sử dụng phổ biến

Biểu đồ thể nhiễm sắc hay gọi thể nhiễm sắc đồ dựa vào biểu đồ nhân mơ hình hóa lên đường thẳng có chiều dài, chiều rộng vị trí tâm động tương

ứng với thể nhiễm sắc thực biểu đồ nhân

Ví dụ : Kiểu nhân lồi Cúc (Anthemis ruthenica M.B sau:2 đơi M (Tâm giữa),

đôi Sm (Tâm lệch) đôi A-SAT (Tâm mút với thể kèm) (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1980):

M + Sm + 2A-SAT

7.5 Phương pháp phân loại izoenzym

7.5.1 Định nghĩa izoenzym

Enzym hay izoenzym protein có khả xúc tác cho phản ứng hóa học

trong thể sống ngồi tế bào có đủ điều kiện cho phản ứng xảy Izoenzym thuật ngữ để biến dạng enzym, dạng tồn quần thể tự

nhiên, kết phản ứng gây thay đổi axit amin cấu trúc bậc chuỗi polypeptide Cấu trúc lại trật tự nucleotid gen quy định Chính sử dụng phương pháp điện di gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát biến dạng khác

phân tử enzym

Bởi việc sử dụng dẫn liệu vềđa hình izoenzym khơng hiểu biết gen cá thể mà biết mức độ dị hợp quần thể Mặt khác biến dạng phân tử enzym “marker” gen Vì sử dụng cho lồi Trong nội lồi, việc sử dụng dẫn liệu đa hình thơng qua tần số alen locut tính chất đặc trưng cho vùng phân bố loài Trên sở người ta dùng izoenzym để phân biệt cá thể

thuộc đơn vị phân loại thứ lồi, lồi đồng hình, lồi chị

Phương pháp phân tích tính đa hình izozym phương pháp phân loại mức độ phân tử tiếp cận với sản phẩm trực tiếp trình dịch m• di truyền

Nhờ tính rõ ràng kết sựđa hình hệ enzym sử dụng, kết phân tích mang độ xác cao tin cậy

Nó sử dụng rộng r•i việc nghiên cứu mối quan hệ lồi, góp phần xây dựng mối quan hệ xác thực hệ thống học sinh giới, công cụđắc lực hỗ

trợ cho nhà phân loại trường hợp khóa phân loại hình thái khơng đủ để giải

quyết vấn đề Tất nhiên cần nói rõ phương pháp dù có phản ảnh chất di truyền loài hay taxơn khác khơng thể thay cho phương pháp

phân loại truyền thống Nó giúp cho việc hồn chỉnh làm xác cách phân loại

truyền thống sở dựa vào dấu hiệu hình thái bên ngồi Mỗi thay đổi gen

được thể qua tính đa dạng izoenzym chưa biến đổi di truyền lại cho hệ mai sau Vì phải tìm, phải sàng lọc lựa chọn biến đổi đặc trưng cho loài Đấy điều quan trọng Chính phương pháp cho ta thấy mức độđa dạng gen bên qua giúp cho ta biết mối quan hệ huyết thống taxôn

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di

Phương pháp sử dụng rộng r•i nghiên cứu hệ thống học lý sau: Mẫu cần phân tích nhỏ

2 Một lần phân tích nhiều mẫu

3 Các chất dùng cho chạy điện di không đắt tiền Dụng cụ chạy điện di phổ biến

5 Kết thu phản ảnh gián tiếp có mặt alen thể đối tượng nghiên cứu

Tuy nhiên cần rõ kết trước hết có ý nghĩa lớn đểđánh giá mối quan hệ

họ hàng taxơn, cịn việc sử dụng phương pháp phương pháp phân tích ADN dùng phân loại đơn giản Việc nhận dạng suy luận kết phép phân tích điện di cần phải tuân theo nguyên tắc đặc thù đòi hỏi nhà nghiên cứu phải am hiểu phạm trù phân loại học, am hiểu đối tượng mà nghiên cứu phải có q trình nghiên cứu lâu dài sở lấy phương pháp phân loại hình thái làm sở Về giá trị phân loại hai phương pháp có tính thực nghiên cứu cách đầy đủ trọn vẹn taxơn Trên sởđó tìm marker đặc trưng có ý nghĩa phân loại Nếu phân tích phần taxơn khơng phân tích có tính hệ thống số liệu nói lên tính đa dạng taxơn hay

khỏi phương pháp phân loại hình thái số nhà sinh học phân tửđã làm lại sai lầm chấp nhận

7.5.2.1 Kỹ thuật điện di

Điện di kỹ thuật sắc ký sử dụng rộng r•i để tách hỗn hợp hợp chất có khả ion hóa Điện di gel kết hợp dựa vào điện tích trình tách dựa vào kích thước phân tử đối tượng tham gia điện di Một trình điện di gồm bước sau:

* Chuẩn bị mẫu cho phép điện di: Do xuất hàm lượng izoenzym khác phận thể, trạng thái phát triển, điều kiện môi trường Cần phải nghiên cứu để tìm vật liệu phù hợp cho việc tách mẫu ban đầu Mẫu phải bảo quản điều kiện tránh phân huỷ izoenzym

* Đổ gel: Tùy theo độ giống izoenzym mà chọn nồng độ gel đảm bảo có

độ phân giải cao hệ izoenzym cần nghiên cứu

* Chuẩn bị dung dịch đệm: Dựa vào tài liệu tham khảo kinh nghiệm thực tếđể

chuẩn bị dung dịch đệm có nồng độ giá trị pH phù hợp xác đểđảm bảo kết phân tích lặp lại

* Lựa chọn thơng số dịng điện, nguồn điện di thời gian chạy mẫu

* Cắt lát gel: Trong trường hợp chạy gel tinh bột, người ta cắt lát lớp gel từ gel dày ban đầu Các lớp dùng để nhuộm với chất nhuộm màu đặc hiệu khác

* Nhuộm gel hay gel: Sau phép chạy điện di, izozym chưa thể nhìn thấy mà

phải làm cho chúng phát màu nhờ phản ứng xúc tác enzym Kết

của bước phụ thuộc nhiều vào tính chất hỗn hợp phản ứng điều kiện ủ cho phản

ứng xảy pH, nhiệt độ, chất, tác nhân nhuộm,…

7.5.2.2 Đọc kết nghiên cứu

Để phục vụ cho nghiên cứu phân loại, việc xử lý thông tin sau chạy điện di cần phải dựa kiến thức di truyền học tiến hóa Đây phần quan trọng kết quảđiện di hình ảnh chết người nghiên cứu không hiểu tương quan hệ nội hàm

giữa sản phẩm izoenzym cấu trúc alen hệ gen m• hóa cho sản phẩm

izoenzym Đọc kết quảđiện di hiểu trình xây dựng bảng tương quan vị trí băng điện di số alen quy định izoenzym

Nhiều nghiên cứu cấu trúc khác phân tử enzym biểu

điện di đồ khác Xét số trường hợp cụ thể sau:

a Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc monomer alen locut gen gồm

hai alen điều khiển, cá thểđồng hợp tử trội mang kiểu gen AA đồng hợp tử lặn mang kiểu gen aa có băng (pattern), cịn cá thể dị hợp tử mang kiểu gen Aa có hai băng (hình 7.15a)

b Trong trường hợp phân tử enzym monomer, locut gen chứa ba alen đồng trội

c Trong trường hợp phân tử enzym dimer locut liên quan tới hai sợi polypeptide, giả sử có hai alen A a, alen m• cho chuỗi polypeptide, phân ly kết quảđiện di minh họa hình 7.15c

Trong hình 7.15 ta thấy cá thể dị hợp tử (Aa) mang băng, có băng biểu mức di truyền trung gian, kết kết hợp hai chuỗi polypeptide hai alen khác locut gen kiểm soát

d Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc tetramer, nghĩa phân tử chuỗi

polypeptide tạo thành Trong trường hợp cá thểđồng hợp tử biểu băng, cá thể dị hợp tử biểu băng điện di đồ Ta đặt giả thiết alen A tổng hợp chuỗi polypeptide a gen a tổng hợp chuỗi polypeptide b, cá thể lai biểu băng tương ứng (hình 7.15d)

Trong số trường hợp phân tử enzym locut gen có hai alen kiểm sốt có alen có hoạt tính biểu màu cịn alen thứ hai khơng biểu màu gọi alen khơng (null allele) điện di đồ có dạng kiểu hình, dạng biểu băng nhuộm màu rõ nét, dạng khơng biểu cá thểđồng hợp tử, cịn dạng có băng nhạt màu mảnh cá thể dị hợp tử (hình 7.16)

7.5.2.3 Tính tần số alen

Sau xác định biểu alen ta phân tích tần số chúng đối tượng nghiên cứu theo công thức sau:

Với AA, Aa, aa số cá thể mang kiểu gen tương

ứng, N số cá thể mang phân tích * 25 đảm bảo

thỏa m•n hệ số *2

Khi số alen (A, a, a1), tần số xuất

được tính tương tự

Tính hệ số tương đồng di truyền I hay khoảng cách di truyền D:

Theo tác giả Nei hệ số tương đồng di truyền tính sau:

trong đó:

XA ,YB tần số alen tương ứng Ví dụ: Quần thể muỗi QTx có:

Tần số A = 0,46 Tần số alen a= 0,54

Quần thể muỗi QTx có:

Tần số alen A= 0,88 Tần số alen =

0,12

Từđó ta tính :

Mức độ giống mặt di truyền là: 0,745 Từ hệ số tương đồng trên, khoảng cách di truyền D tính theo cơng thức:

7.5.2.4 Lập chủng loại phát sinh dựa hệ số tương đồng I

Là phương pháp tính tốn mối quan hệ huyết

thống nhóm tham gia trình phân loại Từ

giá trị I thu nhóm khác người ta lập bảng xây dựng chủng loại phát sinh

Nếu I > 0,5 nhóm nghiên cứu thuộc

một loài, khác biệt hệ Izozym mang ý

nghĩa biến dị loài

Nếu I<0,5 sơ kết luận hai lồi riêng biệt

Ví dụ: Có lồi ký hiệu L1, L2, L3, L4, L5

Có hệ số I lồi

Quy thành nhóm sau:

AA Aa aa

Tr−êng hỵp a

AA Aa’ a’a’ Aa a’a aa

Tr−êng hỵp b

AA Aa aa

Tr−êng hỵp c

AA aa Aa

Tr−êng hỵp d

Hình 7.15. Sơđồ kết quảđiện di

AA Aa aa

Hình 7.16

L2 L3 L4 L5 L1 0,48 0,36 0,35 0,27

L2 0,83 0,12 0,03 L3 0,05 0,01

L4 0,53

Ở ta thấy L2 L3 có số lớn (0,83) - có quan hệ gần quy thành nhóm:

L2/3 L4 L5

L1 0,42 0,35 0,27

L2 0,085 0,02

L4 0,53

Để tìm tiếp mối quan hệ L4/5 L1/2/3 ta cần nhóm tiếp sau:

L4/5 L1 0,31

L2/3 0,05 → 0,18

Cây chủng loại phát sinh loài lập sau:

7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN

Từ thập kỷ tám mươi kỷ XIX việc phát triển thị ADN hay gọi dấu phân tửđã tiến hành Đó thị vềđa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP,

Botstein cs, 1980); Đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam cs.1990);

Tiểu vệ tinh (microsatellite, Litt Luty, 1989) hay gọi lặp lại chuỗi đơn giản

(SSR, Jacob cs, 1991) đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (AFLP, Zabeau Vos,

1993)

7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR

Nguyên lý: dùng đoạn gen hay mẫu nhỏ ADN sử dụng kỹ thuật PCR để nhân lên gấp bội dùng nghiên cứu

Các nguyên liệu cần thiết:

* ADN đích hay ADN khuôn

* ADN polymerase bền nhiệt (Taq, Vent, Pfu…)

* Một hay nhiều đoạn mồi (primer) nghèo nucleotid

* Bốn loại Didesoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

* Đệm phản ứng chứa MgCl2

* Biến tính: dùng nhiệt độ 90 - 95oC 30 giây đến vài phút để tách ADN khuôn thành sợi đơn

* Lai hay bắt cặp mồi: nhiệt độ hạ xuống 50 - 70oC 30 giây đến vài phút mồi nghèo nucleotid bắt cặp với sợi đơn trình tự bổ sung

* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC 30 giây đến vài phút ADN

polymerase bền nhiệt tổng hợp sợi theo nguyên tắc bổ sung

Chu kỳ thường lặp lại 25 - 30 lần lúc số lượng tăng lên 106 lần số lượng ban đầu

Từ phương pháp người ta bổ sung, cải tiến tạo nhiều phương pháp khác gọi dấu hiệu thị (marker)

7.6.2 Phân loại dựa kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP

Đây kỹ thuật sử dụng enzym cắt hạn chế, cắt ADN thành đoạn nhỏ có độ dài khác Khi hai nhiều cá thểđược so sánh với đoạn dị RFLP có

khác vềđộ dài đoạn cắt Sự khác gọi sựđa hình Các đoạn di truyền sử dụng dấu phân tử Dựa số đoạn ADN tương đồng băng điện di để xác định giống hay mối quan hệ họ hàng gần gũi

Phương pháp tiến hành: * Tách ADN

* Cắt ADN thành đoạn nhỏ nhờ enzym giới hạn * Phân tích đoạn ADN điện di gel

* Chuyển đoạn ADN sang màng lọc

* Hiển thị đoạn ADN công cụ thăm dị hay đánh dấu phóng xạ

* Phân tích kết

Thuận lợi phương pháp này: kết có khả thực giữ phịng thí nghiệm; thị RFLP thường kế thừa tương đồng dị hợp tử nhận từđồng hợp tử; có khả phân biệt mức độ loài, quần thể hay cá thể phương pháp

đơn giản

Tuy nhiên áp dụng phương pháp có số hạn chế: tốn nhiều thời gian, chi phí cao; hầu hết cơng việc phân tích cần đến đánh dấu phóng xạ nên bị phụ thuộc nơi tiến hành công việc

7.6.3 Phân loại dựa kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD

Phương pháp dựa phản ứng PCR, sử dụng hay hai đoạn mồi tự ý ngắn 6-10 bazơ để nhân đoạn ADN gi•n xoắn phân tách hiển thị điện di gel

Quá trình thực máy PCR, PTC-100 (MJ Research Inc Mỹ) Các phản ứng

được thực thể tích 25 *l chứa 10 - 25 ng ADN genom, 2,5 *l đệm PCR có nồng độ

gấp 10 lần (đệm PCR x 10), 0,2 mM mồi, 200 mM dNTP, 1,5mM MgCl2 0,5 đơn vị Taq

Phản ứng thực theo bước:

* Biến tính ADN 94oC - phút

* Lai: hạ nhiệt xuống 35oC phút

* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC - phút

Các sản phẩm RAPD phân tích điện di gen agaroza 1% Kết cho

băn khác Từđó tiến hành đánh giá mối quan hệ hai taxơn

Kỹ thuật có ưu điểm phát nhanh chóng dấu hiệu; kỹ thuật đơn giản, không liên quan đến phương pháp lai chụp ảnh phóng xạ; cần lượng cực nhỏ ADN chi phí thấp

7.6.4 Phân loại dựa kỹ thuật nhân đoạn AFLP

Kỹ thuật AFLP kết hợp kỹ thuật RAPD nhân đoạn PCR tiến hành theo bước sau:

* Cắt ADN genom enzim cắt giới hạn EcoR1 Msel: Để làm việc này, lấy 0,3

mg ADN ủ giờở 37oC với đơn vị EcoR1 and đơn vị Msel, ml dung dịch điện có nồng

độ gấp lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc)

* Gắn đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng để gắn (1ml

đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM

ATP, 1ml T4 ADN ligase ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN cắt Phản

ứng gắn thực 20oC Sau gắn tiếp hợp, ADN làm lo•ng 10 lần giữở -20oC

* Nhân đoạn bước đầu: Trước nhân chọn lọc đoạn ADN gắn tiếp hợp

được nhân bước đầu với mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) Msel

(5’GATGAGTCCTGAGTAA3’) Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN gắn

tiếp hợp pha lo•ng 10 lần 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100

ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2

ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml đơn vị/ml Taq ADN polymerase, 18,3 ml nước cất vô trùng)

Phản ứng nhân thực 30 chu kỳ, chu kỳ gồm 30 giây 94oC, phút

56oC, phút 72oC

* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc đoạn ADN gắn tiếp hợp nhân bước

đầu tiến hành với việc sử dụng mồi có nucleotide chọn lọc

Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung 5GACTGCGTACCAATT3’ cịn

các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’ Các mồi

chọn lọc khác chỗ ngồi chuỗi nucleotide chung chúng có từ đến nucleotide chọn

lọc Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC

Nhân chọn lọc thực 12ml dung dịch gồm ml hỗn hợp phản ứng (1,25

ml 10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml mM dNTP, 0,5 ml loại mồi chọn lọc,

0,1 ml đơn vị Taq ADN polymerase ml nước cất vô trùng) Phản ứng nhân chọn lọc

được thực 36 chu kỳ sau: chu kỳ gồm gi•n xoắn 94oC 30 giây, gắn mồi 65oC phút kéo dài mồi 72oC phút; 12 chu kỳ với nhiệt

Các sản phẩm nhân chọn lọc phân lập điện di gel polyacrylamide biến tính 5% Điện di tiến hành với dịng điện cơng suất ổn định 75W Sau điện di gel nhuộm nitrate bạc

Ưu điểm kỹ thuật là: Độ nhạy cao; tái thực hiện; ứng dụng rộng r•i; phân biệt

được dị hợp tử Tuy nhiên có số hạn chế: chi phí cao; yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt phải sử dụng chất phóng xạ

7.6.5 Phân loại dựa kỹ thuật tiểu vệ tinh đoạn ADN ngắn có một số

lượng chuỗi nucleotid lặp lại - SSR

Kỹ thuật SSR thực phản ứng PCR ADN genom với mồi SSR Các chuỗi lặp lại thường có đến sáu nucleotid SSR khám phá sử dụng

đầu tiên người, dùng để lập đồ phân tử người, động vật số thực vật SSR sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền động vật thực vật, mối quan hệ quần thể cá thể loài Các alen SSR thường số nucleotit xác định nên điện di đồng thời sản phẩm nhân bốn locut đường chạy, nhờđó tiết kiệm thời gian chi phí

Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có tính lặp lại cao… Đây công cụ