Nghiên cứu này đã tuyển chọn một số tác nhân vi sinh vật có hiệu quả ức chế nấm C. casiicola gây bệnh vàng rụng lá trên cao su... Từ 50 mẫu đất và cây cao su thu từ Bình Phước, Đồng Nai, Phú Tho và Lai Châu đã chọn được 8 dòng Trichoderma sp , 4 dòng vi khuẩn nội sinh. Trong điều kiện in vitro các dòng nấm Trichoderma tuyển chọn có hiệu quả ức chê sự phát triển của nấm C. casiicola từ 79,07-89,53%, dòng vi khuẩn nội sinh TS1 Bacillus amyloliquefaciens cho hiệu quả ức chế nấm cao nhất đạt 58,6%...
H i th o Qu c gia v Khoa h c Cây tr ng l n th hai TUY N CH N VI SINH V T I KHÁNG N M CORYNESPORA CASSIICOLA GÂY B NH VÀNG R NG LÁ CÂY CAO SU Nguy n Th Bích Ng c1, Ngơ V nh Vi n, Hà Vi t C ng2, Ph m Th Dung1, Lê Mai Nh t1, Ngô Th Thanh H ng1, Nguy n Nam D ng1, Duy H ng1 ( Vi n B o v th c v t, H c vi n Nông Nghi p Vi t Nam) TÓM T T Bi n pháp sinh h c đóng vai trị quan tr ng phịng tr t ng h p b nh h i tr ng theo h ng thân thi n v i môi tr ng nh m h n ch l m d ng thu c BVTV Nghiên c u n ch n m t s tác nhân vi sinh v t có hi u qu c ch n m C casiicola gây b nh vàng r ng cao su T 50 m u đ t cao su thu t Bình Ph c, ng Nai, Phú Tho Lai Châu ch n đ c dòng Trichoderma sp., dòng vi khu n n i sinh Trong u ki n in vitro dòng n m Trichoderma n ch n có hi u qu c chê s phát tri n c a n m C casiicola t 79,07 – 89,53%, dòng vi khu n n i sinh TS1 Bacillus amyloliquefaciens cho hi u qu c ch n m cao nh t đ t 58,6% T khóa: Vi khu n n i sinh, B amyloliquefaciens, C.cassiicola I TV N Cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) tr ng có giá tr kinh t cao, hi n đ c phát tri n v i quy mô l n nhi u n i th gi i có Vi t Nam M g cao su nguyên li u r t c n thi t cho nhi u ngành công nghi p hi n Ngồi cao su cịn có tác d ng b o v môi tr ng sinh thái c i thi n u ki n kinh t xã h i, t o công n vi c làm n đ nh đ c bi t vùng mi n núi Trong nh ng n m g n đây, b nh vàng r ng cao su n m Corynespora cassiicola gây tr thành d ch h i nguy hi m cho nhi u v n cao su c a n c ta, nh h ng nghiêm tr ng t i n ng su t Hi n b nh tr nên nghiêm tr ng c v m c đ , ph m vi gây b nh s l ng dịng vơ tính (dvt) cao su cao s n nhi m b nh ngày t ng N m có kh n ng gây b nh quanh n m m i giai đo n sinh tr ng c a cây, không nh ng gây b nh mà gây b nh c cu ng ch i Trên v n kinh doanh, b nh n ng có th làm cho b ch t gi m s n l ng m t 20 – 25% (Jacob, 2006) n c ta, b nh xu t hi n l n đ u vào tháng n m 1999 t i tr i Th c nghi m cao su Lai Khê thu c Vi n Nghiên c u cao su Vi t Nam V n cao su nhi m b nh s b r ng nhi u đ t gây ch m sinh tr ng ch t v n cao su ki n thi t c b n gi m s n l ng đ i v i v n khai thác, nhi u h ph i ng ng c o hoàn toàn b i nhi u v n tr i lá, m c o Hi n nhi u nghiên c u cao su t p trung vào ch n gi ng tr ng kháng b nh s d ng thu c hóa h c đ phòng tr b nh Trong b i c nh Vi t Nam m t thành viên c a t ch c Th ng m i Th gi i (WTO) vi c s d ng thu c hóa h c q nhi u đ phịng tr b nh gây nh h ng l n đ n ch t l ng, s c kh e c a ng i s n xu t tiêu dùng, làm t ng d l ng thu c s n ph m Vì v y vi c u tiên áp d ng bi n pháp canh tác sinh h c qu n lý chúng có ý ngh a to l n vi c đáp ng yêu c u s n xu t nông s n hàng hóa an tồn ph c v n i đ a xu t kh u n c ta Bài báo cung c p k t qu n ch n vi sinh v t (vsv) có ti m n ng đ i kháng v i n m b nh vàng r ng cao su, nh m ph c v cho nghiên c u s n xu t ch ph m sinh h c phòng tr b nh đ ng ru ng II V T LI U VÀ PH NGHIÊN C U NG PHÁP 2.1 V t li u nghiên c u - N m C cassiicola đ c phân l p làm thu n t gi ng cao su RRIV b nhi m b nh - Ngu n VSV có ích đ c thu th p phân l p t m u đ t, m u lá, thân c a gi ng: Cao su th c sinh, DK4, PB 260, GT1, RRIV 4, RIMM 600, LH t v n cao su kh e vùng d ch b nh t i Bình Ph c, ng Nai, Phú Th Lai Châu 941 VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM - a m th i gian nghiên c u: Vi n BVTV, n m 2014 – 2015 2.2 Ph ng pháp nghiên c u - Thu th p m u đ t: M u đ t đ c x lý tr c phân l p b ng cách ph i khô nhi t đ phịng 2-3 ngày, sau sang qua rây đ lo i b t p ch t, cho vào túi đ phân l p VSV - Phân l p n m đ i kháng: Các m u đ t r vùng r c a cao su thu th p đ ng ru ng M u r đ c r a s ch d i vòi n c kh trùng b m t b ng c n 95o 30 giây sau r a b ng c n 75o phút, cu i r a s ch l i l n b ng n c c t kh trùng c y vào môi tr ng WA PDA M u đ t đ c pha lỗng c y mơi tr ng TME PDA Các m u c y đ c 28oC sau đ c tách thu n môi tr ng PDA qua c n 70º phút, hypochloride 1% phút, c n 70º 30s r a l i qua l n n c vô trùng Nghi n m u c i s v i 5ml n c kh trùng, sau hút 100 µl vào đ a petri có ch a mơi tr ng 10% TSA 1,5 g/l Tripton, 0,5 g/l pepton, 1,5g/l NaCl, 15g/l agar, pH 7.3) 28oC 15 ngày M u m u nh c l i l n, ki m tra quan sát mô t khu n l c môi tr ng Ti n hành tách dòng cho đ n đ c isolate thu n môi tr ng King’B đ ti p t c đ a vào th kh n ng đ i kháng - Phân l p vi khu n đ i kháng: Theo Chung et al., 2011; Araujo et al., 2002 - Kh n ng đ i kháng c a n m Trichoderma sp v i n m C cassiicola: đ c đánh giá theo ph ng pháp c a Vi n B o v th c v t: theo ph ng pháp c y đ i x ng bên: Trên đ a môi tr ng PDA, c y m n m b nh C cassiicola cách mép đ a 3cm, đ ng th i c y m n m đ i kháng qua tâm đ a petri nhi t đ phòng M u lá, thân đ c r a s ch d i vòi c máy C t nh m u r i ti n hành kh trùng + Ch tiêu theo dõi: đ ng kính t n n m, T l c ch (%) theo Vincent (1947) n Hi u qu Dc: c ch (%) ng kính t n n m = (Dc – Dt) × 100 Dc cơng th c đ i ch ng; Dt: - Kh n ng đ i kháng c a vi khu n có ích v i n m C cassiicola: theo Chung et al., 2011 tiêu chu n ngành (10TCN: 867-2006) N m C cassiicola đ c chu n b m t đ 106 bào t /ml C y n m gi a đ a D ch vi khu n đ c chu n b 108 cfu/ml sau c y m đ u quanh đ a petri M i lo i nh c l i l n, công th c đ i ch ng (ch c y n m Corynespora cassicola) t đ nh ôn 30ºC, đo đ ng kính vịng vơ n m o đ ng kính t n n m hi u qu c ch n m theo ph ng pháp c a Chung c ng s (2011) tiêu chu n ngành (10TCN: 867-2006) - Ph ng pháp hóa sinh xác đ nh đ c tính sinh hóa c a vsv có ti m n ng đ i kháng: Theo ph ng pháp c a i h c Qu c gia, 2000 - Ph ng pháp phân lo i, đ nh danh vsv có ti m n ng đ i kháng 942 ng kính t n n m cơng th c x lý - Tính tốn s li u: S li u thí nghi m đ c thu th p x lý b ng excel, s d ng ph n m m IRRISTAT 4.0 III K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Thu th p phân l p n m đ i kháng Trichoderma sp H u h t m u đ t đem phân l p đ u th y s hi n di n c a n m Trichoderma sp ã thu th p đ c 92 ch ng Trichoderma ký hi u t Tr1 đ n Tr92 Trong 80/92 ch ng n m th hi n ho t tính đ i kháng v i n m C cassiicola, có ch ng n m có m c đ i kháng cao chi m t l 8,7%, 23 ch ng th hi n m c đ i kháng trung bình chi m 25,0%, m c đ i kháng y u có s l ng cao 41 ch ng, chi m t l 44,6% không đ i kháng 20 ch ng (21,7%) H i th o Qu c gia v Khoa h c Cây tr ng l n th B ng Ngu n n m Trichoderma sp có tri n v ng thu th p đ c Xu t x ngu n n m đ i kháng cao t tr ng cao su gi ng RRIV4 ng Xồi – Bình Ph c t tr ng cao su gi ng PB 260 Nông tr ng Tân L i – Bình Ph t tr ng cao su gi ng LH90/952 ng Xồi – Bình Ph c STT Ký hi u ngu n TR4 TR54 TR80 TR75 TR61 V n tr ng cao su gi ng GT Xìn H - Lai Châu TR13 V n tr ng cao su gi ng GT Xìn H - Lai Châu TR16 TR34 V V n tr ng cao su gi ng IR Xìn H - Lai Châu n tr ng cao su gi ng RRIM 600 Phú Th t tr ng cao su gi ng DK4 ch ng n m đ i kháng Trichoderma có ho t tính đ i kháng m nh đ c ti p t c n ch n ch ng n m Trichoderma hazzianum Trichoderma viride đ c s d ng s n xu t ch ph m t i B môn B nh đánh giá hi u l c c ch n m C ng Xoài – Bình Ph hai c c cassiicola K t qu b ng cho th y, ch ng Trichoderma đ c n ch n có hi u l c c ch t 79,07 – 89,53% ch ng n m Trichoderma hazianum c a B môn B nh có hi u qu c ch 100%, B ng Kh n ng đ i kháng c a ch ng n m đ i kháng v i n m C cassiicola (2014-2015) Ch ng n m đ i kháng Hi u qu Trichoderma viride ng kính t n n m C cassiicola b c ch (mm) sau ngày 0,0 17,7 TR4 9,1 89,65 TR54 17,2 80,45 TR80 15,2 82,72 TR75 9,0 89,77 TR61 11,2 87,27 TR13 10,3 88,29 TR16 13,1 85,11 TR34 18,4 79,09 88,0 00,00 Trichoderma hazianum i ch ng Qua theo dõi cho th y sau ngày c y truy n c lo i n m đ i kháng n m b nh đ u phát tri n lan nhanh môi tr ng, gi a vùng n m gây b nh n m đ i kháng hình thành m t đ ng gianh gi i rõ T ngày th sau c y tr đi, riêng n m Trichoderma ký sinh s i n m Corynespora làm cho n m teo d n ch t hoàn toàn K t qu b ng ch c ch (%) 100,00 79,89 sau ngày vùng n m gây b nh có đ ng kính t n n m 0,0 – 18,4 cm công th c đ i ch ng (khơng có n m đ i kháng) n m C cassiicola sinh tr ng phát tri n t t sau ngày đ t đ ng kính t i đa Các dòng Trichoderma cho hi u qu c ch n m cao t 79,07-100% u ki n invitro 943 VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM A B C Hình1: Kh n ng đ i kháng c a n m Trichoderma sp đ i v i n m Corynespora cassiicola (A: T hazianum; B: T viride; C: Trichoderma sp.) 3.2 Phân l p vi khu n đ i kháng K t qu phân l p vi khu n n i sinh t gi ng cao su tr ng ph bi n t i Bình Ph c thu đ c 52 ch ng vi khu n đ i kháng 51,92% đ c phân l p t ph n thân, 34,61% đ c phân l p t ph n cu ng 13,46% ch ng đ c phân l p t (b ng 3) Trong ch ng có kh n ng đ i kháng m nh (đ ng kính vơ n m ( KVN)≥20mm) chi m 7,7%; 19 ch ng có kh n ng đ i kháng trung bình chi m 36,5%; ch ng có kh n ng đ i kháng y u chi m 15,4%, cịn l i khơng đ i kháng B ng Phân l p vi khu n n i sinh t gi ng cao su tr ng t i Bình Ph Gi ng cao su Cây th c sinh RRIV K4 Lai hoa T ng c (Vi n BVTV, 2015) Kh n ng đ i kháng +++ ++ 2 B ph n S ch ng phân l p đ c Thân Cu ng Lá Thân Cu ng Lá Thân Cu ng 0 Lá 0 Thân 1 Cu ng Lá 1 52 19 + Ghi chú:+++ đ i kháng m nh ( KVN ≥ 20mm); ++ đ i kháng trung bình ( KVN - 19mm); + đ i kháng y u KVN - 5mm) ch ng vi khu n n i sinh có kh n ng đ i kháng m nh ký hi u TS1, TS2, G2.8, LH ch ng vi khu n B subtilis, x khu n Steptomycetes ký hi u P9.1; B 5.3; A 2.1; P 12.12 đ c phân l p t tr ng khác nh h tiêu, cà phê dùng s n xu t ch ph m B môn B nh đ c đ a vào đánh giá kh n ng đ i kháng v i n m C cassiicola 944 K t qu b ng cho th y, dòng vi khu n n ch n có đ ng kính vịng vơ n m bi n đ ng kho ng 20,01 – 22,80mm Trong dòng TS1 m c đ đ i kháng cao nh t vịng vơ n m đ t 22,80mm, hi u qu c ch đ t 58,01% Sau dịng G2.8, LH TS2 vịng vơ n m đ t 20,09 – 21,00mm, hi u qu c ch 46,27 – 54,58 Dòng vi khu n x H i th o Qu c gia v Khoa h c Cây tr ng l n th khu n l y t b mơn b nh có dịng P9.1 B subtilis cho đ ng kính t n n m 20,11mm, hi u qu c ch 48,09% Các dòng B 5.3; A 2.1; P 12.12 cho hi u qu – 35,11% (b ng 4) hai c ch t 27,86 B ng ánh giá kh n ng đ i kháng c a vi khu n, x khu n v i n m C cassiicola u ki n invitro (Vi n BVTV, 2015) TT KH ngu n Gi ng VSV TS1 TS2 LH G 2.8 P 9.1 B subtilis B 5.3 B subtilis VK VK VK VK VK VK A 2.1 Acomycetes P 12.12 Ascomycetes i ch ng XK XK - ng kính vịng M c đ vơ n m (mm) kháng 22,80 a +++ 20,09 b +++ 20,58 b +++ 21,00 ab +++ 20,11 b +++ 17,33 c ++ 9,22 d 8,17 d 0,00 + + - ng kính t n n m (mm) 36,7 48,7 42,7 39,7 45,3 56,3 63,0 56,7 87,3 Hi u qu c ch (%) 58,01 a 46,27 e 51,14 b 54,58 b 48,09c 34,50 g 27,86 f 35,11 g 0,00 1,2 1,8 CV% 5,0 Ghi chú:+++ đ i kháng m nh ( KVN ≥ 20mm); ++ đ i kháng trung bình ( KVN - 19mm);+ đ i kháng y u KVN - 5mm) Hình Kh n ng đ i kháng c a x khu n, vi khu n đ i v i n m Corynespora cassiicola 945 VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM c m sinh lý, sinh hóa c a vi khu n đ i kháng 3.3 c m sinh lý sinh hóa c a vi khu n n ch n đ c mô t b ng c m sinh lý c a m t s ch ng vi khu n n i sinh n ch n (Vi n BVTV,2015) B ng Ch ng M cđ đ i kháng TS1 +++ TS2 +++ LH +++ G2.8 +++ Khu n l c màu tr ng đ c, d ng b t đ nh, mép nh n, có nh ng g n l i, nh n nheo Khu n l c màu tr ng đ c, s n sùi, mép nh n nheo, có vịng trịn l i gi a Khu n l c màu tr ng h i vàng hình trịn, s n sùi, khơ, mép nh n T o vòng tròn nh gi a Khu n l c màu tr ng đ c, hình trịn nh , mép nh n T o vòng tròn r ng t mép ngoài, bên lõm 3.4 K t qu xác đ nh đ c tính sinh hóa c a VSV có ti m n ng đ i kháng K t qu th đ c tính kh nitrat, phân gi i ngu n cacbon, tính y m khí c a vsv đ i kháng cho th y c ch ng phân l p đ c đ u có kh n ng đ ng hóa ngu n cacbon nh D-glucose; vsv đ u s ng đ c B ng Tím, + Tím, + Tím, + Tím, + mơi tr ng y m khí Các ch ng đ u sinh tr ng t t nh t 30oC, có kh n ng ch u m n, phát tri n t t nh t n ng đ mu i 3-5%, ch có dịng LH có kh n ng phát tri n n ng đ mu i 7%, nhiên phát tri n v s l ng kích th c khu n l c c tính sinh lý sinh hóa c a dịng vi khu n n ch n (Vi n BVTV, 2015) Dòng vi Vi khu n khu n đ i y m khí kháng (k khí) TS1 TS2 LH G 2.8 Nhu m Gram c m khu n l c y y y y m khí m khí m khí m khí Kh n ng ch u m i Kh n ng Kh n ng đ ng hóa C Kh n ng kh Nitrat th y phân NaCl NaCl NaCl Glucose Saccarose tinh b t 3% 5% 7% +++ +++ + + + + +++ +++ + + + + +++ +++ + + + + + +++ +++ + + + + + 3.5 K t qu gi i trình t gen 16S m t s vi sinh v t tri n v ng D a trình t thu đ c, k t qu tìm ki m ngân hàng gen phân tích ph h xác đ nh ch ng TS1 thu c nhóm VSV n i sinh có ích lá, thân Bacillus amyloliquefaciens có đo n đ c trình t 938bps, ch ng TS2 B amyloliquefaciens có đo n đ c trình t 931 G28 có đo n đ c trình t 512 B ng K t qu đ nh danh vi khu n đ i kháng (Vi n BVTV, 2015) Tên m u TS1 M i ki m tra 16S TS2 LH G28 16S 16S 16S 946 nh danh Bacillus velezensis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens Kerstersia gyiorum Bacillus amyloliquefaciens Bacillus velezensis Trình t t ng đ ng 100% KX155818.1 100% KX345794.1 99% KU321525.1 100% KT366030.1 100% KX078078.1 100% KX129843.1 hai H i th o Qu c gia v Khoa h c Cây tr ng l n th IV K T LU N ã phân l p đ c ch ng n m Trichoderma sp ch ng vi khu n n i sinh t thân cao su t i Bình Ph c, Phú Th , Lai Châu, ng Nai Gi i mã trình t vùng 16S c a ngu n VSV phân l p t thân ch n đ c ch ng TS1, TS2, G28 thu c nhóm VSV n i sinh có ích, Bacillus amyloliquefaciens Các ch ng n m Trichoderma sp có hi u qu c ch n m t 67 – 100%, ch ng vi khu n n i sinh có hi u qu c ch t 44,2 – 58,6%, đ ng kính vịng vơ n m t 20,09 – 22,68 mm L IC M N Nhóm tác gi trân tr ng c m n B Khoa h c Công ngh c p kinh phí th c hi n đ tài mã s 35/2011/H - T L “Nghiên c u gi i pháp khoa h c công ngh t ng h p đ qu n lý b nh vàng r ng cao su t i ông Nam b ” TÀI LI U THAM KH O Nguy n Lân D ng cs, 1972 Ph nghiên c u vi sinh v t h c ng pháp ng V Th Thanh, Hà Minh Trung, 1997 Ph ng pháp u tra b nh h i tr ng nông nghi p Ph ng pháp nghiên c u BVTV, Quy n 1, 1997 Tuy n t p Tiêu chu n nông nghi p Vi t Nam phân bón t p III, 2001 Tiêu chu n ngành 10 TCN 579:2003 ánh giá hi u l c phịng tr b nh ch y gơm có múi Wen - Chuan Chung, Rey - Shung Wu, ChiaPing Hsu, Hung-Chang Huang and Jenn-Wen Huang, 2011 Application of antagonistic rhizobacteria for control of Fusarium seedling blight and basal rot of lily Australasian Plant pathology Vol 40, 3: 269-276 ABSTRACT Study on antagonistic agents to Corynespora cassiicola, which causes yellow leaf fall on rubber Nguyen Thi Bich Ngoc1, Ngo Vinh Vien, Ha Viet C ong2, Pham Thi Dung1, Le Mai Nhat1, Ngo Thi Thanh Huong1Nguyen Nam Duong1, Do Duy Hung1 Biological control offers an environmentally friendly alternative to the use of fungicides for control plant disease This study is to select some antagonistic agents that are capable to countervail Corynespora cassiicola, a fungus causes yellow leaf fall disease on rubber plant From 50 different soil and rubber plant samples in Binh Phuoc, Dong Nai, Phu Tho and Lai Chau, a total of strains of Trichoderma sp and endophytic bacterial strains viz TS1, TS2, G28, LH were isolated and purified In vitro tests indicated that Trichoderma sp against the C cassiicola fungus was 79.07 – 89.53% Endobacteria isolate No TS1 Bacillus amyloliquefaciens expressed the highest ability to decrease the rate of C cassiicola mycelial growth at 58.6% Keywords: Corynespora cassiicola, endobacteria, rubber leaf, Trichoderma Ng i ph n bi n: PGS TS Nguy n V n Vi t 947 ... NÔNG NGHI P VI T NAM c m sinh lý, sinh hóa c a vi khu n đ i kháng 3.3 c m sinh lý sinh hóa c a vi khu n n ch n đ c mô t b ng c m sinh lý c a m t s ch ng vi khu n n i sinh n ch n (Vi n BVTV,2015)... i sinh t gi ng cao su tr ng t i Bình Ph Gi ng cao su Cây th c sinh RRIV K4 Lai hoa T ng c (Vi n BVTV, 2015) Kh n ng đ i kháng +++ ++ 2 B ph n S ch ng phân l p đ c Thân Cu ng Lá Thân Cu ng Lá. .. TR13 V n tr ng cao su gi ng GT Xìn H - Lai Châu TR16 TR34 V V n tr ng cao su gi ng IR Xìn H - Lai Châu n tr ng cao su gi ng RRIM 600 Phú Th t tr ng cao su gi ng DK4 ch ng n m đ i kháng Trichoderma