Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) để khảo sát tình hình nhiễm virut Laem-Singh (LSNV) trên tôm sú giống và thương phẩm tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa. 13 mẫu (16,25%) trong tổng số 80 mẫu tôm (thu ngẫu nhiên từ 11/2011 - 5/2012 tại các chợ, các trại nuôi tôm ở khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa, Cam Ranh và Nha Trang - tỉnh Khánh Hòa) được xác định nhiễm LSNV. Trong đó, tôm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV là 36,67% (11/30). 8% (2/25) tôm sú thương phẩm nhiễm LSNV tuy bề ngoài không có biểu hiện chậm lớn. Nghiên cứu chưa phát hiện có sự hiện diện của LSNV trên tôm sú giống (0 /25 mẫu tôm giống).
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2013 THÔNG BÁO KHOA HỌC ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUT LAEM SINGH BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR TRÊN TÔM SÚ NI (Penaeus monodon) Ở KHÁNH HỊA SURVEY ON LAEM SINGH VIRUS IN FARMED BLACK TIGER SHIRMP (Penaeus monodon) IN KHANH HOA PROVINCE USING RT-PCR Đặng Thúy Bình1, Nguyễn Viết Dũng2, Nguyễn Thị Anh Thư3, Văn Hồng Cầm4 Ngày nhận bài: 10/01/2013; Ngày phản biện thông qua: 20/5/2013; Ngày duyệt đăng: 10/9/2013 TĨM TẮT Trong nghiên cứu chúng tơi sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) để khảo sát tình hình nhiễm virut Laem-Singh (LSNV) tơm sú giống thương phẩm địa bàn tỉnh Khánh Hịa 13 mẫu (16,25%) tổng số 80 mẫu tơm (thu ngẫu nhiên từ 11/2011 - 5/2012 chợ, trại nuôi tôm khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa, Cam Ranh Nha Trang - tỉnh Khánh Hịa) xác định nhiễm LSNV Trong đó, tơm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV 36,67% (11/30) 8% (2/25) tôm sú thương phẩm nhiễm LSNV bề ngồi khơng có biểu chậm lớn Nghiên cứu chưa phát có diện LSNV tôm sú giống (0 /25 mẫu tôm giống) Từ khóa: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hịa ABSTRACT In this research, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) method was used to identify the proportion of Laem-Singh virus infection in post-larvae and marketed shrimp in Khanh Hoa province A survey of 80 P monodon collected from 11/2011 to 5/2012 from markets, farms around Van Ninh, Ninh Hoa, Cam Ranh and Nha Trang (all belonged to Khanh Hoa Province) revealed that 16.25% (13 of 80) was infected by Laem-Singh virus (LSNV) Among these, 36,67% market shrimps with slow growth syndrome gave positive result with LSNV In addition, 8% (2/25) commercial shrimp got LSNV infection without signal associated with disease or slow growth There was no evidence of LSNV infection in post-larvae Keywords: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hòa I ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Laem-Singh (LSNV) lần phát tơm sú Penaeus monodon có dấu hiệu chậm lớn tỉnh Laem Singh, Thái Lan năm 2003 Sittidilokratna cs (2009) điều tra tình hình nhiễm LSNV tôm sú thu từ 1998 đến 2007 Kết cho thấy có đến 46/81 mẫu bị nhiễm LSNV Andhra Prades Ấn Độ; Malaysia Indonesia có 1/6 mẫu nhiễm LSNV; Việt Nam 2/6 Thái Lan 39/40 mẫu tôm sú nuôi nhiễm LSNV Theo Nguyễn Viết Dũng cs (2011) tần xuất bắt gặp diện LSNV mẫu tơm có biểu chậm lớn mẫu thu tỉnh Sóc Trăng (7/2008) Kiên Giang (3/2008) cao chiếm 63% số mẫu phân tích Tơm bệnh MSGS có số đặc điểm sau: tôm tối sậm màu bất thường, ăn, hoạt động yếu; có đốm vàng sáng bất thường thân tôm, đốt bụng tôm có dạng thân đốt tre; râu tơm dễ bị đứt gãy; tốc độ tăng trưởng trung bình < 0,1g/ngày tháng làm kéo dài vụ thu hoạch ao tôm nuôi Nghiên cứu áp dụng phương pháp RT-PCR bước để xác định diện LSNV tơm sú khu vực tỉnh Khánh Hịa nhằm bước đầu khảo sát tình hình nhiễm LSNV địa bàn tỉnh TS Đặng Thuý Bình, Nguyễn Viết Dũng, Nguyễn Thị Anh Thư, Văn Hồng Cầm: Viện Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng phương pháp thu mẫu Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) gồm: 25 mẫu tôm giống, 30 mẫu tôm thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn (Monodon Slow Growth Syndrome MSGS) 25 mẫu tôm thương phẩm khỏe mạnh thu ngẫu nhiên chợ thành phố Nha Trang, trại ni khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hịa thành phố Cam Ranh - tỉnh Khánh Hòa, từ tháng 11/2011 tới tháng 5/2012 Mẫu tôm thu sống bảo quản thùng đá, vận chuyển nhanh phịng thí nghiệm bảo quản -400C Tơm có dấu hiệu chậm lớn thu giai đoạn từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình 5,5 ± 0,3g chiều dài trung bình 5,5 ± 0,5cm, n = 30) Những mẫu tơm có dấu hiệu giảm lượng tiêu thụ thức ăn, bơi vào bờ bất thường Tơm phát triển bình thường thu giai đoạn từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình 6,8 ± 0,3g chiều dài trung bình 7,4 ± 0,5cm, n = 25) Mẫu chứng dương LSNV cung cấp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (RIA2) Tách chiết RNA tổng số RNA tổng số tôm sú P monodon tách chiết dựa phương pháp Chomczynski Sacchi (2011) Mẫu tôm (100-150mg từ mang tôm thương phẩm 30-50 cá thể tôm giống nghiền nhuyễn với tác nhân biến tính mạnh (Guanidine 14M phenol) Sau bổ sung dung dịch: phenol chloroform, ly tâm để loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu đồng thời để tách RNA hòa tan pha nước khỏi pha phenol Tiếp đó, RNA kết tủa isopropanol rửa hai lần với ethanol 75% Cuối hịa tan RNA với 100µl nước tinh khiết (DEPC-Diethyl pyrocarbonate) Trước tiến hành phản ứng RT-PCR, dung dịch RNA tổng số biến tính 700C 10 phút làm lạnh nhanh đá Phát virut LSNV phương pháp RT-PCR Phản ứng RT-PCR phát virut LSNV tiến hành theo Sritunyalucksana cs (2006) hiệu chỉnh Nguyễn Viết Dũng cs (2011) Dung dịch tách chiết ARN biến tính dùng cho phản ứng RT-PCR bước để khuếch đại đoạn gen RdRp (RNA dependent RNA polymerase) sử dụng cặp mồi 20AF (5’- TTGCCTTCTCCCGAGTGGTC - 3’) 20AR (5’- CCGGCTGAGGTAGCTGCTTG - 3’) (Sritunyalucksana cs, 2006) Phản ứng tiến hành với tổng thể tích 25µl (gồm 2µl khn ARN, 35pmol mồi), • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2013 đệm Colorless GoTaq® Flexi 1X, 0,2 mM dNTPs, 2mM MgCl2, 5U AMV Reverse trancriptase, 1,25U Gotaq® Hotstart Polymerase (Promega, Mỹ) Phản ứng chạy máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ: Bước tổng hợp cDNA 440C 40 phút; là bước biến tính DNA 950C phút, sau 35 chu kỳ tổng hợp DNA bắt đầu 940C 40 giây, 600C 20 giây, 720C 30 giây, cuối bước kéo dài 720C 10 phút Sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide Kết ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc phần mềm Quantity One (Bio-rad) III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Dấu hiệu bệnh lí Mẫu tơm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn (30 mẫu), 8/30 có dấu hiệu lỏng vỏ (LSS - loose shell syndrome); 5/30 mẫu tôm bị bệnh đốm trắng (WSSV - White Spot Syndrome Virus); 3/30 mẫu tôm bị bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mô (IHHNV - Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus) Tơm khỏe mạnh có trọng lượng chiều dài trung bình lớn tơm có dấu hiệu chậm lớn (Trọng lượng tôm khỏe mạnh: 7,4 ± 0,5cm trọng lượng tôm chậm lớn: 6,8 ± 0,3g, n = 25; Chiều dài tôm khỏe mạnh: 5,5 ± 0,5cm chiều dài tôm chậm lớn: 5,5 ± 0,3g, n = 30) Dấu hiệu bệnh lý khác biệt kích thước mơ tả hình Hình Tôm sú thả nuôi sau 104 ngày thu từ ao nuôi tôm xã Vạn Thạnh, huyện Vạn Ninh A Tơm khỏe mạnh; B Tơm có dấu hiệu chậm lớn; C Tơm có dấu hiệu chậm lớn lỏng vỏ Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2013 Khuếch đại sản phẩm PCR Sản phẩm PCR khuếch đại mồi 20AF 20AR có kích thước 197 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết (hình 2) Kết phù hợp với nghiên cứu Sritunyalucksana cs (2006) Nguyễn Viết Dũng cs (2011) Hình Kết điện di sản phẩm quy trình RT-PCR chẩn đốn bệnh LSNV tôm sú Giếng M: thang chuẩn DNA 100bp (GeneRulerTM); giếng 1, 2: Mẫu dương tính LSNV tơm khỏe mạnh; giếng 3, 4: mẫu dương tính LSNV tơm MSGS; giếng 5, 6: mẫu dương tính LSNV tơm có dấu hiệu lỏng vỏ; giếng 7, 8: mẫu dương tính LSNV tơm bị bệnh đốm trắng; giếng 9, 10: Mẫu dương tính với LSNV tơm bị bệnh IHHNV; giếng 11, 12: Mẫu âm tính tơm giống; giếng 13: Đối chứng âm; giếng 14: Đối chứng dương Tình hình nhiễm LSNV Khánh Hịa Kết phân tích cho thấy có 13/80 mẫu tơm sú thương phẩm bị nhiễm virus LSNV, không phát mẫu tơm giống nhiễm LSNV Kết phân tích tỷ lệ nhiễm mẫu tôm sú thu thập thể bảng Bảng Kết khảo sát nhiễm LSNV mẫu tôm sú giống nuôi thương phẩm khu vực tỉnh Khánh Hịa Tơm giống Mẫu dương tính Tơm thương phẩm MSGS Số mẫu Tỷ lệ 0/25 0% Tổng Kết nghiên cứu khơng phát có diện LSNV tôm giống (0/25 mẫu nghiên cứu) Ở Việt Nam phát tôm sú giống bị nhiễm LSNV chiếm tỷ lệ 1% Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Viết Dũng cs (2011), điều cho thấy xác xuất phát bệnh LSNV tôm giống thấp Tần suất bắt gặp virus LSNV tơm sú có dấu hiệu chậm lớn khu vực ni tỉnh Khánh Hịa 36,67% Tơm thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn thu chợ đìa Nha Trang, Ninh Hịa Cam Ranh Trong đó, 3/8 mẫu tơm có dấu hiệu chậm lớn lỏng vỏ (LSS); 3/5 mẫu tơm có dấu hiệu chậm lớn dương tính với bệnh đốm trắng (WSSV); 2/3 mẫu tơm có dấu hiệu chậm lớn dương tính với bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mơ (IHHNV) phát dương tính với LSNV Ở Thái Lan năm 2007, 39/40 mẫu tôm sú có dấu hiệu chậm lớn phát có nhiễm virus LSNV Ở Việt Nam, 63% mẫu phân tích từ tơm có dấu hiệu chậm lớn phát có diện LSNV tỉnh Sóc Trăng Kết nghiên cứu cho thấy mẫu tơm có dấu hiệu Số mẫu 11/30 Tơm thương phẩm phát triển bình thường Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ 36,67% 2/25 8% 13/80 (16,25%) chậm lớn khu vực tỉnh có tỉ lệ nhiễm LSNV thấp so với mẫu Sóc Trăng - Việt Nam mẫu Thái Lan, nhiên tần suất 36,67% nhiễm LSNV địa bàn tỉnh số đáng báo động Nghiên cứu Prakasha cs (2007) phát mẫu dương tính với LSNV có dấu hiệu lỏng vỏ (LSS); mẫu khác dương tính với LSNV nhiễm virus đốm trắng (WSSV) virus gây bệnh còi (MBV) Rõ ràng nhiễm LSNV quần thể tơm có dấu hiệu chậm lớn có tỷ lệ cao, điều cho thấy có mối quan hệ tơm có dấu hiệu chậm lớn (MSGS) nhiễm LSNV, tốc độ tăng trưởng chậm ảnh hưởng bệnh lý khác (như LSS, WSSV, MBV, IHHNV hay HPV…) Các mẫu tôm sú phát triển bình thường địa bàn tỉnh bị nhiễm LSNV 8% Sự xuất virus LSNV tơm có dấu hiệu chậm lớn tơm phát triển bình thường ghi nhận trước Ở Ấn Độ, tỉ lệ nhiễm virus LSNV ao nuôi công nghiệp 5,4% 56 mẫu phân tích ngẫu nhiên Năm 2007 Ấn Độ tỷ lệ nhiễm LSNV tơm khơng có dấu hiệu chậm lớn ghi nhận cao (56% 81 mẫu TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản nghiên cứu) Trong đó, tỷ lệ nhiễm LSNV mẫu tôm thu ngẫu nhiên khu vực đồng sông Cửu Long 10,6% Kết nghiên cứu ghi nhận diện virus LSNV hệ thống tôm nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa Kết khảo sát cho thấy tỷ lệ nhiễm LSNV tơm sú có dấu hiệu chậm lớn (36,67%) cao tơm sú phát triển bình thường (8%) Điều chứng tỏ có mối liên hệ virus LSNV tượng tôm chậm lớn tôm nuôi Việt Nam đồng thời phù hợp với kết luận Panphut cs (2011), virus LSNV điều kiện cần chưa phải điều kiện đủ để gây bệnh chậm lớn tôm sú Do virus LSNV xác định diện tôm sú có khả lây nhiễm lồi giáp xác quanh khu vực nuôi (Kumar cs, 2011) nên ảnh hưởng đến lan truyền đến hệ thống canh Số 3/2013 tác, mặt khác LSNV liên quan đến bệnh chậm lớn kéo dài thời gian nuôi làm giảm suất, gây thiệt hại cho người ni phải kéo dài thời gian chăm sóc, phát sinh thêm chi phí thức ăn thuốc men cho tơm Vì vậy, việc áp dụng phương pháp RT- PCR để giám sát virus LSNV cần thiết để nâng cao chất lượng tôm sú khu vực tỉnh Khánh Hòa IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Virus LSNV diện hệ thống nuôi tôm sú tỉnh Khánh Hịa Tỷ lệ tơm sú ni thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV cao tơm sú phát triển bình thường Chưa phát tơm giống nhiễm LSNV Vì vậy, cần xây dựng hệ thống kiểm soát bệnh LSNV để cảnh báo cho người nuôi tôm nhằm nâng cao chất lượng tôm sú thương phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Viết Dũng, Trần Thị Phương Tú, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Văn Hảo Phát virus Laem singh kỹ thuật RT- PCR tôm sú nuôi (Penaeus monodon) đồng sông Cửu Long Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, ISSN 0866-7020, 2011: 86-90 Chomczynski P and Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Analytical Biochemistry, 1987 162(1): 156-159 Krishnan P, Makesh M, Chaudhari A, Purushothaman CS and Rajendran KV Natural host-range and experimental transmission of Laem-Singh virus (LSNV) Diseases of Aquatic Organisms, 2011 96(1): 21-27 Panphut W, Senapin SS, Sriurairatana SS, Withyachumnarnkul B and Flegel TW A novel integrase-containing element may interact with Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp BMC Veterinary Research, 2011 7(1): 18 Prakasha BK, Ramakrishna RP, Karunasagar I and Karunasagar I Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured Penaeus monodon from India Diseases of Aquatic Organisms, 2007 77(1): 83-86 Pratoomthai B, Sakaew W, Sriurairatana S, Wongprasert K and Withyachumnarnkul B Retinopathy in stunted black tiger shrimp Penaeus monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV) Aquaculture, 2008 284(1–4): 53-58 Pratoomthai B, Wongprasert K, Flegel WT and Withyachumnarnkul B Infection by Laem-Singh Virus in the fasciculated zone and organ of Bellonci of the eyes of small Penaeus monodon from Monodon slow-growth syndrome pond Asian-Pacific Aquaculture, 2007 199 Sittidilokratna N, Dangtip S, Sritunyalucksana K, Babu R, Pradeep B, Mohan CV, Gudkovs N and Walker PJ Detection of Laem-Singh virus in cultured Penaeus monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacific region Diseases of Aquatic Organisms, 2009 84(3): 195-200 Sritunyalucksana K, Apisawetakan S, Bono-nat A, Withyachumnarnkul B and Flegel TW A new RNA virus found in black tiger shrimp Penaeus monodon from Thailand Virus Research, 2006 118(1–2): 31-38 Tiếng Anh 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ... chất lượng tôm sú khu vực tỉnh Khánh Hòa IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Virus LSNV diện hệ thống nuôi tôm sú tỉnh Khánh Hịa Tỷ lệ tơm sú ni thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV cao tơm sú phát... chứng dương Tình hình nhiễm LSNV Khánh Hịa Kết phân tích cho thấy có 13/80 mẫu tơm sú thương phẩm bị nhiễm virus LSNV, không phát mẫu tơm giống nhiễm LSNV Kết phân tích tỷ lệ nhiễm mẫu tôm sú thu... tôm nuôi Việt Nam đồng thời phù hợp với kết luận Panphut cs (2011), virus LSNV điều kiện cần chưa phải điều kiện đủ để gây bệnh chậm lớn tôm sú Do virus LSNV xác định diện tôm sú có khả lây nhiễm