Nấm men bia thải sau khi xử lý được tối ưu hóa các điều kiện tự phân theo thiết kế Box-Behnken. Hàm số kì vọng đơn Deringer được sử dụng để tối ưu hóa các yếu tố đầu ra. Kết quả cho thấy, khả năng phân giải bã men bia phụ thuộc nhiều vào yếu tố đơn lẻ, quan trọng nhất là nhiệt độ, thời gian và pH.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Biological characterization of HT1 strain of Streptomyces with potential antimicrobial activity against Streptococcus agalactiae causing disease on tilapia Nguyen Van Giang, Chu Duc Ha, Nguyen Thi Thu Abstract The article presents the biological characteristics and antimicrobial activity of actinomyces strain HT1 against Streptococcus agalactiae causing disease on tilapia The ‘HT1’ colonies were observed to be circular, diameter - mm, dried surface with grayish white color, aerial hyphae are long, straight branching with a chain of spherical spore on ISP medium after 21 day of cultivation The favourable conditions for growth and antimicrobial activity of the strain HT1 were established: temperature of 30oC, pH (6 - 8), shaking speed of 200 rpm, the inoculums size of 3% (v/v), volume of medium in shaking flask of 10% (v/v) Our results also revealed that ‘HT1’ strain could grow well on the media containing xylose (C resource), peptone and KNO3 (N resource) with clear zone of inhibition against S agalactiae 23, 24 and 24.67 mm, respectively Key words: Antimicrobial activity, biological characteristics, Streptococcus agalactiae, actinomyces, tilapia Ngày nhận bài: 10/6/2017 Ngày phản biện: 20/6/2017 Người phản biện: TS Đinh Trường Sơn Ngày duyệt đăng: 25/6/2017 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TỰ PHÂN TẾ BÀO NẤM MEN BIA THẢI Nguyễn Thị Thanh Thủy1, Hồ Tuấn Anh2 TÓM TẮT Nấm men bia thải sau xử lý tối ưu hóa điều kiện tự phân theo thiết kế Box-Behnken Hàm số kì vọng đơn Deringer sử dụng để tối ưu hoá yếu tố đầu Kết cho thấy, khả phân giải bã men bia phụ thuộc nhiều vào yếu tố đơn lẻ, quan trọng nhiệt độ, thời gian pH Sự kết hợp yếu tố với khơng làm thay đổi kết mức ý nghĩa ngoại trừ tương tác pH với thời gian gây giảm chất hòa tan Với điều kiện tối ưu bã nấm men : nước : 3, tốc độ khuấy 30 vòng/phút, nhiệt độ tự phân 52oC, pH 5,8, thời gian tự phân 22h, tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng amin tự 41,3%, tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hịa tan 73,6%, tỷ lệ chuyển hóa chất khơ từ sinh khối vào dịch chiết nấm men 52,1% Giá trị kỳ vọng đạt cho ba hàm mục tiêu 94,3% Từ khóa: Nấm men bia, tối ưu hóa, tự phân, mơ hình tốn học, thiết kế thí nghiệm I ĐẶT VẤN ĐỀ Tự phân (autolysis) trình xảy tự nhiên, tế bào kết thúc chu kỳ phát triển chuyển sang pha suy vong, lúc enzyme nội bào tiết phân hủy tế bào (Hasan and Huseyin, 2007) Mặc dù tạo sản phẩm với hiệu suất thu hồi cao, phương pháp phân giải tế bào acid sử dụng rộng rãi chi phí đầu tư ban đầu cao, ngồi có khả tạo sản phẩm phụ gây độc mono dichloropropanol (Chae et al., 2001) Cho đến việc sử dụng enzyme glucanase, protease, nuclease deaminase để phân giải nấm men phổ biến (Chung et al., 1999; Chae et al., 2001; Kim et al., 2001) Tuy nhiên, kinh phí sử dụng cho phương pháp cao Phân giải tế bào nấm men bia thải ứng dụng sản xuất thức ăn chăn ni tự phân kinh tế nhất, có tính khả thi cao áp dụng quy mô công nghiệp Theo tài liệu cơng bố kết nghiên cứu nhóm đề tài, trình tự phân nấm men bia thải chịu ảnh hưởng nhiệt độ, pH, thời gian, tốc độ khuấy, tỷ lệ phối trộn sinh khối nấm men với nước (Kenji, 2002; Иванова et al., 1989) Quá trình tự phân nấm men không chịu ảnh hưởng đơn yếu tố mà kết hợp yếu tố với Việc thực tối ưu hóa điều kiện tự phân nấm men nhằm xác định mức độ yếu tố ảnh hưởng tương tác yếu tố với cần thiết để nâng cao hiệu q trình tự phân Khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Kinh tế Kỹ thuật Công nghiệp 73 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nấm men bia thải thu từ Công ty TNHH Một thành viên Bia Rượu Eresson, khu công nghiệp Quang Minh, Mê Linh, Hà Nội Trong trình tiền xử lý, nấm men thải rửa tách đắng nước, dung dịch H3PO4 0,01N NaCl 0,05% với tỷ lệ 3: so với sinh khối, nhiệt độ - 50C, thời gian lắng 50 phút Dịch nấm men đưa qua sàng loại bỏ cặn thô, lọc vắt nhằm loại bỏ nước tự để thu nấm men dạng đặc, màu kem đồng nhất, tỷ lệ tế bào sống 92 - 95%, (Hồ Tuấn Anh, 2016) Nấm men vắt có hàm lượng chất khơ tuyệt đối 20,50%, hàm lượng protein thành phần chứa nitơ chiếm 54,72% so với chất khơ tuyệt đối Tỷ lệ protein chuyển hóa đến FAN 4,1%, tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hòa tan 14,2% 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện tự phân nấm men bia thải Để xác định điều kiện tối ưu cho trình tự phân nấm men, nghiên cứu yếu tố xác định tỷ lệ bã nấm men : nước (X1); tốc độ khuấy (vòng/ phút) (X2); nhiệt độ tự phân (oC) (X3); pH (X4); thời gian tự phân (giờ) (X5) Giá trị biến thiên yếu tố xác định dựa nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố đến trình tự phân nấm men, cụ thể sau: Tỷ lệ sinh khối nấm men : nước: : 2; : 3; : 4, tốc độ khuấy: 25; 30; 35 vòng /phút, nhiệt độ tự phân: 42; 47; 52oC, pH: 5,0; 5,4; 5,8, thời gian tự phân: 14; 18; 22 h Các điều kiện tự phân trước sau mã hóa bố trí theo thiết kế Box-Behnken (Bảng 1) Mơ hình tốn học sử dụng để xác định giá trị tối ưu cho yếu tố có dạng sau: Yi = fi(X1, X2,…., Xk) hay Y = Bo + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B4X4 + B5X5+ B6X1X2 + B7X1X3 + B8X1X4 + B9X1X5 + B10X2X3 + B11X2X4 + B12X2X5 + B13X3X4 + B14X3X5 + B15X4X5 + B16X12 + B17X22 + B18X32 + B19X42 + B20X52 Trong đó: Bo, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B19, B20 : hệ số hồi quy X1, X2, X3, X4, X5: yếu tố thí nghiệm cần tối ưu Yi: Là hàm mục tiêu bao gồm: tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng amin tự (FAN) (y1), tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hịa tan khơng kết tủa sau ly tâm (y2), tỷ lệ chuyển hóa chất khô từ sinh khối vào dịch chiết nấm men (y3) 74 Hàm số kì vọng đơn Deringer sử dụng để tối ưu hoá yếu tố đầu (tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng amin tự (FAN), tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hịa tan không kết tủa sau ly tâm, tỷ lệ chuyển hóa chất khơ từ sinh khối vào dịch chiết nấm men) Hàm số kì vọng thay đổi phụ thuộc vào điểm kì vọng, dao động từ (khơng mong muốn) đến (mong muốn), hàm đạt giá trị lớn nhỏ nhất, tuỳ thuộc vào mục đích thí nghiệm Phương trình hàm số kì vọng có dạng sau: Trong y i,min y i,max mức tối thiểu, mức tối đa tương ứng biến độc lập, giá trị nhỏ lớn điểm ưa thích cho tiêu chất lượng Các điểm kỳ vọng đơn sau kết hợp với tạo thành kỳ vọng tổng thể (D) tính theo cơng thức dưới, ri thể hệ số trọng lượng cho tiêu Trong nghiên cứu ri cố định 2.2.2 Phương pháp phân tích Xác định hàm lượng chất khô phương pháp sấy đối lưu 60ºC đến khối lượng không đổi Xác định hàm lượng FAN dịch chiết nấm men theo phương pháp ninhydrin Wylie & Johnson, đo màu bước sóng 570 nm, mô tả mục 8.10 EBC (Analitica - EBC, 2005) Xác định hàm lượng protein tổng số protein hịa tan theo phương pháp Kjeldahl, mơ tả 8.9.1 EBC (Analitica - EBC, 2005) 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu nhận xử lý phần mềm Excel 2010 JMP version 13 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng năm 2016 đến tháng năm 2017 Khoa Công nghệ thực phẩm - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Bảng Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa q trình tự phân Cơng thức 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Trước mã hóa Tỷ lệ bã nấm men:nước 1:3 1:2 1:3 1:4 1:2 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3 1:4 1:2 1:4 1:3 1:3 1:2 1:3 1:3 1:2 1:3 1:3 1:3 1:3 1:2 1:4 1:3 1:4 1:3 1:3 1:4 1:2 1:3 1:3 1:2 1:4 1:3 1:3 1:3 1:4 1:3 1:3 Tốc độ khuấy (vòng/ phút) 30 25 30 30 35 35 30 25 30 35 35 30 35 30 30 25 30 30 25 25 30 30 30 30 35 30 30 25 30 35 30 30 30 30 30 30 30 30 35 30 25 30 25 Sau mã hóa Nhiệt độ tự phân (oC) pH 42 47 47 47 47 52 52 42 52 47 47 42 47 47 47 47 47 47 47 47 42 47 42 47 42 52 52 52 42 47 47 47 47 47 52 47 47 42 47 52 47 47 47 5,4 5,4 5,4 5,0 5,4 5,4 5,4 5,4 5,8 5,0 5,4 5,8 5,4 5,4 5,4 5,8 5,0 5,8 5,4 5,4 5,4 5,8 5,4 5,0 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,8 5,4 5,8 5,0 5,4 5,0 5,4 5,4 5,0 5,4 5,4 5,4 5,8 5,0 Thời gian tự phân (h) 14 18 18 18 18 18 14 18 18 18 22 18 18 22 14 18 22 18 22 14 18 14 22 14 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 14 22 18 14 22 18 22 18 X1 X2 X3 X4 X5 -1 -1 0 0 0 -1 0 -1 0 -1 0 0 -1 1 0 -1 0 -1 0 0 -1 0 1 -1 1 0 -1 0 -1 -1 0 0 0 -1 0 0 0 0 -1 -1 -1 0 0 1 -1 0 -1 0 0 0 0 -1 -1 -1 1 -1 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0 0 -1 0 -1 0 -1 0 0 1 -1 -1 0 -1 0 -1 -1 0 0 -1 0 0 -1 1 -1 -1 -1 0 0 0 0 0 -1 -1 1 75 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau có bảng mã hóa cơng thức, tiến hành bố trí thí nghiệm thiết kế mơ hình, kết thu bảng Kết cho thấy: hàm y1, tỷ lệ protein chuyển hóa đến FAN dao động khoảng 39,6 41,2%; hàm y2, tỷ lệ protein chuyển hóa tới dạng hịa tan thu khoảng 70,7 - 73,5%; hàm y3, tỉ lệ chất khơ chuyển hóa vào dạng hịa tan thu khoảng 49,0 - 51,8% Tuy nhiên, để tìm phương trình tốn học cho hàm mong đợi, lựa chọn điểm tối ưu theo mong muốn, số liệu có xử lý tối ưu phần mềm JMP Bảng Hiệu tự phân tế bào nấm men điều kiện khác Công thức 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 y1 (%) 39,7 40,3 40,4 39,9 40,5 40,7 39,9 40,1 41,1 40,0 41,2 40,9 40,6 40,9 39,9 40,8 40,7 40,9 40,8 39,6 40,2 39,7 y2 (%) 70,9 71,8 72,1 71,9 71,8 73,0 72,5 71,2 73,5 71,6 72,6 71,9 72,2 72,1 72,1 72,6 72,3 72,3 72,4 71,6 70,9 70,9 y3 Công y1 y2 y3 (%) thức (%) (%) (%) 49,0 23 40,4 72,3 50,4 50,1 24 40,9 71,7 50,2 50,4 25 39,2 71,1 49,2 50,2 26 40,5 71,4 49,8 50,2 27 40,4 72,5 50,8 51,4 28 40,6 73,3 51,6 50,6 29 40,3 72,8 51,0 49,4 30 40,2 71,6 50,2 51,8 31 41,2 72,8 51,2 50,0 32 40,4 72,0 50,3 51,0 33 41,1 73,1 51,4 50,2 34 39,7 71,1 49,4 50,6 35 40,4 72,1 50,4 50,6 36 39,9 72,3 50,6 50,2 37 39,7 71,3 49,4 50,8 38 41,1 72,9 51,4 50,8 39 39,7 70,7 49,0 50,6 40 40,0 71,8 49,8 50,8 41 41,1 73,3 51,8 49,6 42 40,3 72,4 50,6 49,2 43 40,9 72,6 51,1 49,0 Với yếu tố đầu vào tỷ lệ bã nấm men : nước (X1), tốc độ khuấy (vòng/ phút) (X2), nhiệt độ tự phân (oC) (X3), pH (X4), thời gian tự phân (X5), yếu tố đầu tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng amin tự (FAN) (y1), tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hịa tan không kết tủa sau ly tâm (y2), tỷ lệ chuyển hóa chất khơ từ sinh khối vào dịch chiết nấm men 76 (y3) phần mềm cho thấy mức độ ảnh hưởng yếu tố đầu vào tới chất lượng dịch tự phân nấm men Kết thể bảng Từ bảng thấy q trình tự phân nấm men chịu ảnh hưởng yếu tố đầu vào Tuy nhiên ảnh hưởng lớn nhiệt độ tự phân với mức quan trọng 17,8; tiếp đến thời gian tự phân pH mơi trường tự phân có tầm ảnh hưởng gần tương tự với mức quan trọng 14,8 14,2 Tốc độ khuấy ảnh hưởng yếu mức quan trọng 10,5 Tỷ lệ nấm men : nước yếu tố có mức độ ảnh hưởng nhỏ đến chất lượng dịch sau tự phân mức quan trọng có 5,6 Bên cạnh ảnh hưởng đơn yếu tố, hiệu tự phân nấm men chịu tác động tương tác pH thời gian tự phân, nhiên mức độ tương đối nhẹ thể mức quan trọng dừng lại 3,5 Để thấy rõ tương tác yếu tố đến hàm mục tiêu, kết phân tích hệ số hồi quy yếu tố thí nghiệm thể bảng Từ kết ước lượng hệ số hồi quy, phương trình mơ tả mối tương quan tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng amin tự (FAN) yếu tố thí nghiệm là: y1 = 40,4 + 0,06875X1 + 0,18125X2 + 0,1125X3 + 0,5375X4 + 0,575X5 - 0,25X4X5 Phương trình mơ tả mối tương quan tỷ lệ protein chuyển hóa đến dạng hịa tan khơng kết tủa sau ly tâm yếu tố thí nghiệm là: y2 = 70,566667 + 0,35625X1 + 0,0625X2 + 0,80625X3 + 0,54375X4 + 0,39375X5 - 0,225X4X5 Phương trình mơ tả mối tương quan tỷ lệ chuyển hóa chất khơ từ sinh khối vào dịch chiết nấm men yếu tố thí nghiệm sau: y3 = 48,866667 + 0,36875X1 + 0,13125X2 + 0,7875X3 + 0,54375X4 + 0,59375X5 _ 0,225X4X5 Với kết bảng 4, ảnh hưởng đơn yếu tố, từ X1 đến X5 đến hàm mục tiêu có ý nghĩa với P