Đang tải... (xem toàn văn)
Năm 1988, đã biến nạp thành công ty thể của nấm men Saccharomyces cerevisiae và ty thể của tảo xanh Chlamydomonas. Thiết bị đầu tiên để chuyển gen là súng bắn gen. Máy hiện đại sử dụng khí helium nén làm đạt đến vận tốc bắn tối ưu và thao tác an toàn (Hình 1.10). Tốc độ bắn đạt 1300 m/s (so sánh với vận tốc âm thanh trong không khí 343 m/s).
cả ty thể lạp thể (Bảng 1.3) Năm 1988, biến nạp thành công ty thể nấm men Saccharomyces cerevisiae ty thể tảo xanh Chlamydomonas Thiết bị để chuyển gen súng bắn gen Máy đại sử dụng khí helium nén làm đạt đến vận tốc bắn tối ưu thao tác an tồn (Hình 1.10) Tốc độ bắn đạt 1300 m/s (so sánh với vận tốc âm khơng khí 343 m/s) Tỷ lệ biến nạp hiệu phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: lượng DNA/hạt vàng wolfram, tốc độ hạt, số lượng hạt, độ lớn loại tế bào mật độ tế bào mô sử dụng Bảng 1.3 Một số gen chuyển vào ty thể thực vật bậc cao Gen biến nạp Chức Gen -endotoxin Bacillus thuringensis Kháng côn trùng 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase Kháng up) -Glucuronidase glyphosate-(Round Gen thị (phản ứng tạo màu) Neomycin-phosphotransferase Kháng kanamycin Nòng súng Đĩa nhựa mang vi đạn vàng có bọc DNA Đĩa nhựa chặn lại lưới Các vi đạn vàng bọc DNA Tế bào đích thực vật Hình 1.10 Sơ đồ súng bắn gen (gene gun, bombardment) Công nghệ gen nông nghiệp 13 Biến nạp phi sinh học đạt biểu tạm thời (transient) gen hành, đậu tương, lúa ngô Sự biểu tạm thời có nghĩa gen biến nạp ban đầu hoạt động thời sau biểu bị cản trở methyl hóa DNA sau phiên mã Chỉ số biến nạp bền vững mô tả thực tế phương pháp có ý nghĩa lớn ngũ cốc Tuy nhiên cịn số khó khăn: Hiệu phương pháp thấp, khoảng 0,05% đỉnh sinh trưởng đậu tương tái sinh sau biến nạp + DNA biến nạp luôn bền vững DNA nhân tế bào nên thường biểu tạm thời Thường số tế bào mơ biến nạp khơng phải lúc tái sinh thay đổi gen đồng + Phần lớn phải sử dụng mô phân sinh để biến nạp, ví dụ phơi lúa dung dịch tế bào ngô 1.1.3 Chuyển gen tế bào trần Trừ tảo sinh vật đơn bào, tế bào thực vật tồn dạng mô Sự gắn giữ tế bào thực qua carbohydrate cao phân tử pectin Chúng tạo nên gọi mỏng trung tâm gắn tế bào lân cận lại với Để tạo nên tế bào trần từ mô trước hết cần phải phân giải pectin nhờ enzyme pectinase Bước thành tế bào, phần lớn gồm cellulose, phải phân giải nhờ enzyme cellulase Kết xuất tế bào trịn, khơng có thành (Hình 1.11), để bền vững chúng phải giữ dung dịch đồng thẩm thấu Công nghệ gen nông nghiệp 14 30 µm Hình 1.11 Tế bào trần thuốc kính hiển vi Vector sử dụng cho biến nạp tế bào trần giống vector biến nạp phi sinh học (Hình 1.9) DNA biến nạp vào tế bào trần thực hai cách: + Thứ nhất, sử dụng chất polyethyleneglycol, có mặt chất tế bào trần hòa lẫn vào với qua phân tử DNA tiếp nhận + Thứ hai, biến nạp thực sốc điện, gọi xung điện Sốc điện dẫn đến không phân cực ngắn màng tế bào trần, qua DNA tiếp nhận DNA vào nhân kết hợp hoàn toàn ngẫu nhiên vào vị trí vào DNA nhân thực vật Về nguyên tắc thực vật biến nạp phương pháp Tuy nhiên việc tái sinh hồn chỉnh thường khó khăn, việc sử dụng biến nạp tế bào trần bị hạn chế 1.2 Hệ thống chọn lọc thị Nói chung, tất hệ thống biến nạp tỷ lệ tiếp nhận DNA bền vững thấp Vì vậy, người ta phải có phương pháp để phân biệt số biến nạp từ lượng lớn không biến nạp Để xác định biến nạp người ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc Đặc biệt ưa thích hệ thống chọn lọc trội, có nghĩa biến đổi gen tái sinh phát triển Ngược lại, hệ thống thị đơn giản hệ thống thị GUS, không biến nạp tái sinh Dĩ nhiên Công nghệ gen nông nghiệp 15 phương pháp khơng hiệu quả, ln ln có phần nhỏ tế bào thực vật biến nạp Một ưu điểm thứ hai quan trọng thao tác hệ thống chọn lọc đơn giản để phân tích nhanh số lượng lớn Trong nhiều trường hợp người ta sử dụng kháng sinh kanamycin cho chọn lọc trội Tuy nhiên, nồng độ cao độc phần lớn thực vật Điển hình cho kháng sinh nhóm aminoalcohol gắn với gốc đường chứa nhóm amine (Hình 1.12) Bên cạnh kanamycin thu từ Streptomyces kanamyceticus cịn có gentamycin (từ Micromonospora purpurea), neomycin (từ Streptomyces fradiae) streptomycin (từ Streptomyces griseus) thuộc nhóm Người ta sử dụng gen kháng khác, ví dụ gen neomycinphosphotransferase (nptII) mã hóa cho phosphotransferase, sản phẩm gen làm bất hoạt kháng sinh aminoglycosid (ví dụ: kanamycin) gắn thêm nhóm phosphate (phosphoryl hóa) Gen mã hóa cho neomycinphosphotransferase có nguồn gốc từ vi khuẩn thường khơng có thực vật Với promoter terminator tương ứng, gen sử dụng thực vật NH2 CH2 O OH HO HO O NH2 HO CH2O O O NH2 OH HO NH2 HO Hình 1.12 Cơng thức cấu tạo kanamycin Bên cạnh gen kháng kanamycin có loạt hệ thống chọn lọc khác sử dụng giới thiệu bảng 1.3 Các gen kháng trội, ngồi Cơng nghệ gen nơng nghiệp 16 neomycin phosphotransferase, cịn có hygromycin B phospho-transferase 3-enolpyruvyl shikimate 5-phosphatsynthetase (EPSP-synthetase) Ngoài gen chọn lọc, gen thị (reporter gene) sử dụng để chọn lọc thể biến nạp Gen thị không chọn lọc trội, sản phẩm gen chứng minh dễ dàng phương pháp hóa sinh, hóa học mơ, kính hiển vi quang kế Ví dụ: người ta chứng minh chức promoter đặc hiệu mô biến nạp loại tế bào định để kiểm tra gen xác định có hoạt động hay khơng Trong thực vật bậc cao sử dụng nhiều -D-glucuronidase, luciferase green fluorescent protein (GFP) Việc xác nhận thực nhờ biến đổi chất đặc hiệu (glucuronid luciferin, hình 1.13) phát sản phẩm xúc tác quang tử trường hợp luciferse Ngược lại GTP-protein chứng minh kính hiển vi huỳnh quang protein sau kích thích với ánh sáng có độ dài bước sóng phù hợp Ở phương pháp không cần chất đặc hiệu Bảng 1.4 Hệ thống gen chọn lọc thị cho thực vật Chọn lọc Xác nhận tính trội đơn giản Có Khơng Có Khơng Khơng Có Luciferase vi khuẩn Có Khơng Bromxynilnitrilase Có Có Chloramphenicol-acetyltransferase Có Có Dihydro-folatreductase (Tetrahydrofolatedehydrogenase) Có Có Khơng Có Green fluorescent protein Có Có Hygromycin-phosphotransferase Có Có Hoạt tính enzyme 3-Enolpyruvylshikimate-5phosphatsynthase Acetollactatsynthase Gentamycin-acetyltransferase Cơng nghệ gen nơng nghiệp 17 Luciferase trùng chiếu sáng Có Có Neomycin-phosphotransferase (Kanamycinkinase) Khơng Có Nopalinsynthase Khơng Có Octopinsynthase Có Có Khơng Có Có Có Có Có Phosphinothricin-acetyltransferase -D-glucuronidase Streptomycin-phosphotransferase Threonindehydratase Ánh sáng (562 nm) a Con đom đóm Luciferase O2 + Luciferin Oxyluciferin + CO2 ATP AMP + PPi b COOH HO O OH Cl Br Chất màu Indigo O N H HO -Glucuronidase HO COOH O OH OH + HO OH Cl Br N H Công nghệ gen nơng nghiệp Sự oxy hóa khơng khí Cl O O Br Cl Br N H N H 18 Hình 1.13 Xác nhận biểu gen thị a: Xác nhận biểu luciferase, chất luciferin, phản ứng phụ thuộc vào ATP Ánh sáng tạo nên từ phản ứng định lượng máy b: Xác nhận biểu -D-glucuronidase, chất nhân tạo 5-bromo-4-chlor-3-indoyl-glucuronid (X-GlcA), chất thủy phân nhờ glucuronidase Bằng oxy hóa xuất chất indigo màu xanh Người ta sử dụng chất khác thay X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân chất màu phát quang 1.3 Tái sinh hoàn chỉnh So sánh với sinh vật đơn bào vi khuẩn, nấm men tảo biến nạp vào thực vật bậc cao khó khăn hơn, khơng phải đưa DNA vào tế bào mà phải tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào mơ phân lập Điều thực phần lớn tế bào thực vật có tính tồn tế bào tái sinh thành hồn chỉnh (Hình 1.14) Khác với động vật, thực vật tái sinh từ tế bào soma bình thường từ thu trực tiếp hạt biến đổi gen Tuy nhiên, tất loại tế bào mơ phù hợp cho mục đích Vì vậy, thực vật phải thử nghiệm nhiều để tìm nguyên liệu sử dụng ban đầu phù hợp Điều quan trọng tìm mơi trường phù hợp để kích thích tế bào phân chia Bên cạnh chất khống vơ cơ, cần chất hữu khác nhau, đặc biệt đường nguồn carbon lượng, chất điều hoà sinh trưởng Auxin cytokinin có ý nghĩa lớn ni cấy mơ tế bào Đôi amino acid nước dừa sử dụng Cũng tác dụng phytohormone phức tạp chức đặc hiệu Tuy nhiên nói rằng, lượng cytokinin cao kích thích tạo chồi, nồng độ auxin cao, phụ thuộc với hàm lượng cytokinin, kích thích tạo callus rễ Callus khối tế bào khơng màu, có kích thước lớn, khơng phân hóa chứa khơng bào Khi bổ sung cytokinin vào mơi trường ni cấy callus phát triển chồi rễ kích thích trở lại Điều kiện xác cho tái sinh thành cơng phải thử nghiệm cho lồi Ví dụ: để tạo callus chồi từ mảnh thuốc cần bổ sung 0,2 mg/l -NAA 1,0 mg/l BAP (Hình 1.14) Từ tế bào trần tái sinh hồn chỉnh, thành cơng bước tạo thành tế bào phân chia tế bào Tuy nhiên, nhiều thực vật q trình Cơng nghệ gen nơng nghiệp 19 tái sinh khó khăn Dĩ nhiên, tái sinh có biến đổi lớn kiểu hình nguyên nhân bất thường phân bào nguyên nhiễm đột biến, gọi biến dị soma Như nêu tất thực vật tái sinh dễ dàng từ tế bào trần, tế bào mơ Những lồi đại diện họ cà, cải cay, cam, táo cà rốt tái sinh dễ dàng Ở thực vật khác thành công với số giống định (như củ cải đường) Đặc biệt khó khăn ngũ cốc Trong thực tế thí nghiệm biến nạp, tái sinh chọn lọc thường tiến hành đồng thời 1.4 Xác nhận thay đổi gen Thực tế sau biến nạp sinh trưởng môi trường chọn lọc chưa đủ sở để nói biến nạp thành cơng, tính kháng xuất tự nhiên đột biến vật chất di truyền thực vật Hơn tỷ lệ biến nạp thấp, nằm độ lớn đột biến tự nhiên với tần suất 10-6 đến 10-8 Vì phải thực thí nghiệm bổ sung, Southern blot PCR thí nghiệm khác để chứng minh sản phẩm gen Phát triển rễ Môi trường không chứa hormone Lá Phát triển chồi Callus nhiều tế bào Môi trường đặc chứa cytokinin Môi trường đặc chứa auxin Lát cắt ngang Mảnh Xử lý pectinase Dòng nhiều tế bào Tế bào phân chia lần thứ Chuyển sang dung dịch lỏng Tái sinh thành tế bào Công nghệ gen nông nghiệp Các tế bào riêng rẽ Xử lý cellulose Tế bào trần 20 Hình 1.14 Sơ đồ biểu diễn tạo tế bào trần tái sinh hoàn chỉnh Những sinh vật biến đổi gen chứng minh việc phân tích thành phần chất thay đổi, đặc biệt đặc tính (ví dụ: kháng tác nhân gây bệnh đó), protein thay đổi, xuất protein việc xác định DNA lạ biến nạp Để chứng minh DNA biến nạp vào thực vật phương pháp Southern PCR sử dụng hai phương pháp nhạy cảm Ở trình tạo biến đổi gen, bước cần phải chứng minh, tế bào thực vật biến nạp Phản ứng lai Southern blot ưa thích, nhạy cảm với lẫn tạp DNA khác đồng thời người ta nhận thông tin số lượng copy, nghĩa số lượng phân tử DNA ngoại lai đựợc gắn vào hệ gen Để thực phương pháp cần vài g DNA (1 g = 1/1000 mg), mà người ta dễ dàng tách từ Một ví dụ chứng minh cho DNA biến nạp đưa hình 1.15 Hình 1.15 Phóng xạ tự ghi kết lai Southern Sinh vật biến đổi gen cắt enzyme giới hạn XhoI đọan DNA tách điện di Sau thực Southern blot lai với mẫu dị DNA đánh dấu phóng xạ Các đường 1, 5: nguyên liệu không biến nạp Công nghệ gen nông nghiệp 21 Mẫu giếng 2, 4, 7: thể sinh vật biến đổi gen, xuất tín hiệu lai rõ rệt Khi có nhiều mẫu khác có lượng DNA, chí DNA từ thực phẩm biến đổi gen chip khoai tây phân lập, khuếch đại PCR phương pháp lựa chọn Phương pháp đặc biệt phù hợp cho mục đích kiểm tra xác định thay đổi gen trồng thực phẩm Sự chứng minh DNA sản phẩm trồng thành công hay không, phụ thuộc vào phương pháp sử dụng Ví dụ: xác định DNA sản phẩm khoai tây đông lạnh, dầu đậu tương khơng có DNA - 828 bp - 226 bp Amp R bar 35S bar cryIA M T ĐC SM Hình 1.16 Xác nhận thay đổi gen ngô biến đổi gen Agarose gel với đoạn DNA phân tách sau thực phản ứng PCR Năm cặp primer sử dụng (AmpR: gen kháng ampicillin, bar: kháng thuốc diệt cỏ, 35S bar: promoter kháng thuốc diệt cỏ, cryIA: gen tạo độc tố Bt ivrl: gen mã hóa invertase ngơ) M: DNA từ ngơ bình thường, T: DNA từ ngơ biến đổi gen Bên phải marker chuẩn (SM) để xác định kích thước đoạn PCR Cơng nghệ gen nơng nghiệp 22 Một ví dụ sử dụng PCR để xác định biến đổi gen minh họa hình 1.16 Từ thí nghiệm rút kết luận sau: + Đối chứng (không biến nạp gen) khơng có băng DNA Có nghĩa thí nghiệm thực xác + Gen mã hóa cho invertase (ivr1) có tất giống ngơ tự nhiên tìm thấy ngô không biến đổi gen (M) lẫn ngô biến đổi gen (T) nhờ cặp primer đặc hiệu gen ivrl Điều có nghĩa DNA tồn hai loại ngô + Với tham gia cặp primer (oligonucleotide) khác chúng khuếch đại đoạn khác vector, đoạn DNA tạo ngơ biến đổi gen (chỉ có T) Điều có nghĩa cặp nucleotide đặc hiệu với DNA biến nạp qua cho phép xác định chắn giống ngơ biến đổi gen Nói chung, phản ứng lai DNA khuếch đại PCR đòi hỏi phải có thơng tin định DNA biến nạp, cần có mẫu dị nucleotide đặc hiệu Một phương pháp khác biểu gen thị, sản phẩm dễ dàng chứng minh Tuy nhiên, phương pháp thường sử dụng cho mục đích nghiên cứu Ở đây, người ta sử dụng vector biểu D-glucuronidase, hoạt động chứng minh dễ dàng tạo nên chất indigo màu xanh (Hình 1.13) Sự xác nhận di truyền gen biến nạp hệ sau nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhiên vấn đề gặp nhiều khó khăn chuyển gen có vòng đời dài (cây lâu năm) Mặc dù yêu cầu cần thiết, hệ sau biến nạp xảy bất hoạt gen biến nạp Cũng có phương pháp chứng minh có mặt protein đặc hiệu biến đổi gen Đối với đậu tương biến đổi gen công ty Strategic Diagnostic Inc hợp tác với công ty Monsanto sản xuất bột hóa chất chuẩn GMO Soya Test KitTM; với kháng thể đặc hiệu, protein EPSP-synthetase chứng minh có mặt đậu tương biến đổi gen 1.5 Biểu DNA ngoại lai Công nghệ gen nơng nghiệp 23 Thực vật bậc cao có ba quan (rễ, chồi lá) số mơ đặc hiệu mơ bảo vệ (ví dụ biểu bì), mơ trì (ví dụ mơ phân sinh) mơ dày (collenchym) Ngồi cịn có trăm loại tế bào khác Một gen lạ biểu tất tế bào (DNA lạ biến nạp vào nhiều vị trí khác hệ gen) số loại tế bào mô định Ở đây, người ta sử dụng trình tự khởi động phiên mã gọi promoter Mỗi gen promoter điều khiển biểu gen Trong số promoter hoạt động phần lớn tế bào, số khác có tính chuyên hóa cao loại tế bào định (Bảng 1.4) Trong tế bào có nhiều quan nhân, ty thể, lạp thể Nhờ promoter thích hợp mà gen biến nạp biểu vị trí xác mong muốn Ngồi ra, biểu antisense đề cập, với phương pháp biểu gen riêng lẽ bị ức chế Bảng 1.5 Một số promoter đặc hiệu cho mô tế bào thực vật Loại tế bào mô Thực vật Promoter/tên gen Phloem rễ Asus1 Arabidopsis Hoa đầu rễ CHS15 Đậu Mơ phân sinh Cyc07 Arabidopsis Tế bào kèm khí khổng Khoai tây Phloem Đoạn 0,3 kp AGPase Hạt phấn Đoạn RTBV Thuốc Giao tử đực PLAT4912 Lúa mỳ Tế bào tapetum Puroindolin-b Thuốc Lúa TA29 1.5.1 Biểu gen ngoại lai nhiều vị trí Trong thực tế phần lớn promoter 35S từ virus khảm hoa súp-lơ (cauliflower mosaic virus, viết tắt CaMV 35S) sử dụng cho biểu Công nghệ gen nông nghiệp 24 gen biến nạp tất loại mơ tế bào Promoter có nguồn gốc virus nên có hiệu phiên mã gen sau khởi động Promoter CaMV 35S đặc biệt phù hợp cho biểu gen đánh dấu gen thị tạo nên kháng thuốc diệt cỏ Tuy nhiên, để nghiên cứu chức trao đổi chất thực vật promoter khơng phù hợp, thay đổi đường hướng trao đổi chất định đòi hỏi biểu gen tế bào mô đặc hiệu 1.5.2 Biểu gen tế bào mô đặc hiệu Trong thực vật nhiều trình trao đổi chất xảy vị trí định, nên việc vận chuyển chất quan sử dụng quan sản xuất cần thiết Sản phẩm quang hợp tạo phần lớn xanh (nguồn) phải vận chuyển qua phloem bó mạch đến quan sử dụng hoa rễ (đích) Ví dụ làm rõ cần thiết cho biểu gen biến nạp Trong năm qua, nhiều promoter phát để tăng cường biểu gen Những gen biến nạp biểu đặc hiệu củ khoai tây, chí tế bào riêng lẽ hạt phấn Các promoter đặc hiệu xác định qua thực nghiệm cách phân lập phân tử RNA tồn mô mong muốn Tiếp theo gen promoter xác định Tính đặc hiệu promoter kiểm tra gen thị Ở promoter tạo dòng trước gen thị biến nạp vào thực vật, sau vị trí biểu gen chứng minh, ví dụ hình 1.17 Chắc chắn năm tới nhiều promoter đặc hiệu khác xác định dự án xác định trình tự genome, thời gian không xa promoter đặc hiệu sử dụng cho tất loại tế bào loại mô Công nghệ gen nông nghiệp 25 Hình 1.17 Xác định biểu gen nhờ gen thị Sự biểu glucuronidase (vùng tối) điểu khiển promoter tương ứng thể vùng bị thương 1.5.3 Biểu antisense Năm 1988, lần người ta nhận thấy thực vật sắc tố hoa bị ức chế biểu RNA antisense Phương pháp có giá trị lớn khơng nghiên cứu mà ứng dụng Antisense -Gen Phân giải nhờ RNase Gắn với antisense Antisense - RNA mRNA Phiên mã Phiên mã mRNA Protein Ribosome Công nghệ gen nông nghiệp Gắn với Ribosome Dịch mã 26 ... gen tạo độc tố Bt ivrl: gen mã hóa invertase ngơ) M: DNA từ ngơ bình thường, T: DNA từ ngơ biến đổi gen Bên phải marker chuẩn (SM) để xác định kích thước đoạn PCR Công nghệ gen nông nghiệp 22 ... biểu Công nghệ gen nông nghiệp 24 gen biến nạp tất loại mơ tế bào Promoter có nguồn gốc virus nên có hiệu phiên mã gen sau khởi động Promoter CaMV 35S đặc biệt phù hợp cho biểu gen đánh dấu gen. .. định dự án xác định trình tự genome, thời gian không xa promoter đặc hiệu sử dụng cho tất loại tế bào loại mô Công nghệ gen nông nghiệp 25 Hình 1.17 Xác định biểu gen nhờ gen thị Sự biểu glucuronidase