Trong quá trình này vật chủ biểu hiện bệnh đậu mùa và kháng nguyên tái tổ hợp và hy vọng tăng phản ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể với chúng. Ðây là phương pháp sản xuất vaccine đa trị (polyvalent vaccine). Trong ví dụ mang tính chất lý thuyết nêu trên, sự tiêm chủng một vaccine tái tổ hợp chứa các epitope tạo dòng này có thể làm cho vật chủ miễn dịch với bệnh đậu mùa, viêm gan B, cúm và Plasmodium...
genome tái tổ hợp Trong trình vật chủ biểu bệnh đậu mùa kháng nguyên tái tổ hợp hy vọng tăng phản ứng miễn dịch bảo vệ thể với chúng Ðây phương pháp sản xuất vaccine đa trị (polyvalent vaccine) Trong ví dụ mang tính chất lý thuyết nêu trên, tiêm chủng vaccine tái tổ hợp chứa epitope tạo dòng làm cho vật chủ miễn dịch với bệnh đậu mùa, viêm gan B, cúm Plasmodium 3.4 Sản xuất kháng thể đơn dòng Phản ứng hệ thống miễn dịch với kháng thể nào, kháng thể đơn giản nhất, đa dòng (polyclonal antibody) Cho dù tách chiết tế bào tiết kháng thể riêng lẻ đưa vào môi trường ni cấy, chết sau vài hệ khả sinh trưởng giới hạn tất tế bào soma bình thường Vấn đề giải Kohler Milstein phát minh kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng vào năm 1975 cơng trình trao giải thưởng Nobel vào năm 1984 Tế bào B có khả tổng hợp kháng thể khơng có khả phân chia Ngược lại tế bào u tủy có khả tăng sinh khơng kiểm sốt khơng tạo thành kháng thể Kohler Milstein tìm cách kết hợp khả sinh trưởng không giới hạn tế bào u tủy với tính đặc trưng kháng thể xác định trước tế bào lách miễn dịch bình thường Họ tiến hành dung hợp tế bào u tủy với tế bào B hoạt hóa để tạo tế bào lai Trộn tế bào lách chuột gây miễn dịch kháng nguyên mong muốn với tế bào u tủy Sử dụng tác nhân để màng sinh chất kề sát dễ dàng dung hợp Tuy nhiên tỷ lệ thành cơng q thấp Vì vậy, người ta sử dụng tế bào u tủy khả tổng hợp hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HGPRT) khả tổng hợp kháng thể Enzyme HGPRT giúp tế bào tổng hợp purine cách sử dụng nguồn hypoxanthine ngoại bào Bình thường vắng mặt HGPRT khơng có vấn đề tế bào u tủy chúng có đường thứ hai sử dụng để tổng hợp purine Tuy nhiên, tế bào có mặt aminopterin, chúng sử dụng đường thứ hai lúc phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT để tồn - Chuyển hỗn hợp tế bào dung hợp vào môi trường nuôi cấy nhân tạo HAT (chứa hypoxanthine, aminopterin thymidine) Các tế bào u tủy Công nghệ gen nông nghiệp 96 sinh trưởng thiếu HGPRT Các tế bào lách bình thường khơng thể sinh trưởng vơ hạn thời gian sống giới hạn chúng Các tế bào lai sinh trưởng vô hạn tế bào lách cung cấp HGPRT tế bào u tủy - Kiểm tra dịch môi trường nuôi cấy để tìm mơi trường tạo kháng thể mong muốn - Bởi mơi trường ni cấy gốc bắt đầu với hai nhiều tế bào lai nên phải tách tế bào riêng lẻ từ mơi trường có kháng thể dương tính ni cấy lại chúng - Lại tiến hành kiểm tra dịch kháng thể mong muốn Mỗi môi trường ni cấy lại dương tính tế bào riêng lẻ tương ứng với dòng kháng thể chúng kháng thể đơn dịng Ðiều có nghĩa mơi trường ni cấy tạo loại kháng thể riêng biệt chống lại trực tiếp yếu tố xác định riêng lẻ với kháng nguyên chọn trước - Tăng lượng nuôi cấy dịng thành cơng Kháng ngun Tế bào u tủy Tế bào lách Dung hợp Ni cấy mơi trường HAT Tạo dịng tế bào dương tính Kiểm tra kháng thể bề mặt Kiểm tra kháng thể bề mặt Phát triển dịng dương tính In vitro Nhân lên In vivo Thu nhận kháng thể đơn dòng Cơng nghệ gen nơng nghiệp 97 Hình 3.10 Mơ hình sản xuất kháng thể đơn dịng Ni cấy tế bào lai được tiến hành hai đường: + In vitro: ni cấy bình Sản lượng tăng từ 10-60 g/ml + In vivo: nuôi cấy thể chuột Nồng độ kháng thể huyết dịch khác thể đạt tới 1-10 mg/ml Kháng thể đơn dịng sử dụng cách rộng rãi thuốc thử chữa bệnh nghiên cứu Hiện nay, kháng thể đơn dòng dùng để chống thụ thai, triệt sinh gia súc, chẩn đốn có thai, lao, hủi, cịn dùng để chẩn đốn di ung thư có gắn thêm đồng vị phóng xạ Gần nhất, kháng thể đơn dòng dùng để phát AIDS Sử dụng kháng thể đợn dòng nhanh chóng thay đần cho số phương pháp miễn dịch huyết thông thường để phát kháng nguyên chưa biết bề mặt tế bào, xác định mức hormone để đánh giá chức tuyến nội tiết, xác định định loại vi sinh vật, phát số protein có ý nghĩa chẩn đoán ung thư, ức chế phản ứng loại thải ghép quan 3.5 Sản xuất protein đơn bào Protein đơn bào (single cell protein-SCP) thuật ngữ nói đến độc canh (monoculture) tế bào vi khuẩn protein tổng số tách chiết từ tế bào ni cấy tinh khiết mà sử dụng làm nguồn protein bổ sung cho người động vật SCP thích hợp tiêu thụ người động vật, xem thức ăn cải tiến Sử dụng sinh khối vi khuẩn làm nguồn thức ăn hướng nghiên cứu quan trọng lượng thức ăn giới khơng đủ để cung cấp hàm lượng protein phần lớn vi sinh vật cao (xấp xỉ 60-80% khối lượng khô tế bào) Mặt khác, hàm lượng methionine, lysine, vitamin chất khoáng cao nên SCP nhiều dinh dưỡng số thức ăn thực vật động vật Tuy nhiên, có số hạn chế việc sử dụng phổ biến SCP: hàm lượng nucleic acid SCP cao nguy hiểm sức khỏe số thể với rối loạn định; việc có chất độc tiết từ chất sinh trưởng (ví dụ kim loại nặng) tạo vi sinh vật (ví dụ xạ khuẩn) địi hỏi phải phân tích kiểm tra chất lượng tốn kém; Công nghệ gen nông nghiệp 98 tiêu hóa chậm tế bào vi khuẩn ống tiêu hóa gây phản ứng không tiêu dị ứng số cá thể; giá SCP đắt so với nguồn protein khác bột đậu tương Nhiều loại vi sinh vật khác bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm, tảo, xạ khuẩn nhiều chất khác sử dụng để sản xuất SCP (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Các chất vi sinh vật sử dụng để sản xuất SCP Vật liệu thô Vi sinh vật Loại sinh vật Carbon dioxide Spirulina maxima Cyanobacterium Nước sữa (lactosse) Kluyvecomyces fragilis Nấm men Alkane dầu mỏ Candida lipolyrica Nấm men Rác cellulose Chaetomium cellulolyticum Nấm Methane (Methanol) Methylophilus methylptrophus Vi khuẩn Sản xuất SCP có ý nghĩa thực Ðức chiến tranh giới lần thứ Nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh trưởng nước rỉ đường (nguồn carbon) muối ammonium (nguồn nitrogen), sử dụng để làm đặc súp xúc xích Đến năm 1973, dầu mỏ xem nguồn tài nguyên dồi rẻ, số công ty dầu lớn bắt đầu dự án sản xuất SCP sử dụng dầu mỏ sản phẩm tinh luyện từ dầu mỏ làm môi trường sinh trưởng Tuy nhiên, quan tâm dự án bị giảm sút giá dầu mỏ tăng lên Ở thập niên 1970, ngành cơng nghiệp hóa học Hồng gia Anh (ICI) phát triển thành cơng trình lên men methanol liên tục để sản xuất SCP thương mại từ vi khuẩn Methylophilus methylptrophus (được gọi Prutten) M methylptrophus sử dụng methanol làm chất sinh trưởng, thực tiễn methane bị biến đổi thành methanol methanol sử dụng làm chất Năm 1979, ICI xây dựng nhà máy có khả sản xuất 50.000 SCP/năm Tuy nhiên, ICI đầu tư lớn (200 triệu USD) thành tựu kỹ thuật đáng kể Công nghệ gen nông nghiệp 99 cơng nghệ sinh học, đến khoảng năm 1987 SCP không sản xuất nhà máy khơng mang lại hiệu kinh tế Gần đây, người ta quan tâm phục hồi lại việc sản xuất SCP cách sử dụng vật liệu rác, thức ăn thừa (ví dụ cellulosics nước sữa) Một số dự án sử dụng vi sinh vật tự nhiên, dự án khác lại sử dụng vi sinh vật biến đổi di truyền Tuy nhiên, bất chấp chất vi sinh vật nào, xem xét góc độ kinh tế yếu tố thành cơng hay thất bại Có lẽ q trình mang tính kinh tế phát triển để sản xuất SCP từ sản phẩm việc xử lý rác 3.6 Sản xuất hormone sinh trưởng Escherichia coli Tế bào bị Hình 3.11 Sơ đồ sản xuất hormone sinh trưởng bò kỹ thuật DNA tái tổ hợp 1: Cắt plasmid enzyme hạn chế 2: Gen somatotropin bò tách chiết từ tế bào 3: Gen somatotropin chèn vào plasmid 4: Plasmid tái tổ hợp lại đưa vào tế bào vi khuẩn 5: Vi khuẩn sản xuất Cơng nghệ gen nơng nghiệp 100 somatotropin bị sinh trưởng bình lên men 6: Thu nhận somatotropin từ vi khuẩn tinh 7: Somatotropin bò đưa vào để tăng sản lượng sữa Hormone sinh trưởng (GH) protein tiết từ thùy trước tuyến yên động vật có xương sống Ở động vật có vú, GH cần thiết cho sinh trưởng phát triển Trước đây, cần sử dụng người ta phải tách chiết GH trực tiếp từ tuyến yên, chi phí q đắt, giá thành q cao Nhờ thành tựu lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp, người ta sản xuất đưa thị trường nhiều loại hormone sinh trưởng phục vụ cho chăn ni thú y hormone sinh trưởng bị (bGH), hormone sinh trưởng lợn (pGH) Gen mã hóa hormone sinh trưởng somatotropin gen hormone sinh trưởng tạo dịng thành cơng Vào năm 1994, Monsanto sản xuất thương mại somatotropin tái tổ hợp bị (bovine somatotropin-BST) Các nơng gia sản xuất bơ sữa bắt đầu bổ sung hormone sinh trưởng vào chế độ ăn hàng ngày bò để tăng khả cho sữa chúng (Hình 3.11) Somatotropin tái tổ hợp thử nghiệm phương pháp để tăng trọng lượng gia súc lợn điều trị rối loạn người nhược tuyến yên gây Câu hỏi Hãy trình bày bước qui trình tạo động vật chuyển gen? Tại nói Cơng nghệ tạo động vật chuyển gen hướng công nghệ cao Công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống? Công nghệ sinh sản động vật ứng dụng chúng? Các phương pháp sản xuất vaccin thú y tái tổ hợp? Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng? Cơng nghệ gen nơng nghiệp 101 Chương Những lợi ích thách thức trồng chuyển gen Cây trồng chuyển gen (transgenic crops) hay gọi trồng biến đổi gen (genetically modified crops) (Hình 4.1 4.2) vấn đề giới tranh luận Song phủ nhận hiệu sản xuất lợi ích kinh tế lớn mang lại Hiện nay, cơng nghệ sinh học giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng nơng nghiệp có 60 triệu gieo trồng giống biến đổi gen như: ngô, lúa, đậu tương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đu đủ Cây trồng chuyển gen với suất chất lượng cao đem lại lợi ích khổng lồ cho quốc gia có công nghệ sinh học tiên tiến Đồng thời giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu-phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài nguyên thiên nhiên phá vỡ cân sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàn cầu Những nghiên cứu cho phép tạo loại lương thực “thế hệ đầu tiên” có khả chống lại stress mơi trường hạn hán, thay đổi nhiệt độ đột ngột hay đất nhiễm mặn Các nhà khoa học giới nghiên cứu “thế hệ thứ hai” sản phẩm công nghệ sinh học-những sản phẩm mang lại lợi ích trực tiếp cho người tiêu dùng Chẳng hạn, “lúa vàng” có hàm lượng β-carotein cao, giống khoai tây cơng nghệ sinh học có hàm lượng protein cao giống bình thường Cây trồng tạo loại vaccine thực phẩm (edible vaccine), đem lại loại thuốc có chi phí sản xuất bảo quản thấp Đây nhiều nghiên cứu mũi nhọn nhằm thúc đẩy phát triển ngành lương thực dược phẩm giới Những triển vọng mà chuyển gen mang lại vô to lớn Hiện nay, mặt trái mà người ta đề cập công nghệ sinh học nông nghiệp cịn dừng lại khía cạnh lý thuyết khả Cịn ưu điểm loại cơng nghệ thực tế chứng minh kiểm nghiệm Công nghệ gen nơng nghiệp 102 Vị trí nhân dịng Gen NPTII để chọn dòng Kan R T-DNA Marker nhận biết cho Agrobacterium pBR32 Gen cần chèn Gắn vào vị trí nhân dịng Chuyển vào E coli, chọn R khuẩn lạc Amp T-DNA Ti-plasmid Agrobacterium Ghép đôi với Agrobacterium Agrobacterium E coli T-DNA plasmid chèn vào Ti-plasmid tái tổ hợp tương đồng Agrobacterium tái tổ hợp Gây nhiễm vào Hình 4.1 Sơ đồ chuyển gen thơng qua Agrobacterium tumefaciens Công nghệ gen nông nghiệp 103 Promoter cho biểu gen thực vật Gen nhân dịng Các trình tự vi khuẩn μm Kết tủa DNA thành tiểu thể Vi đạn tungsten Đưa vào súng bắn gen Kim hỏa Tiểu thể Lỗ thông Tấm chắn giữ viên đạn lớn lại Buồng nạp Viên đạn lớn thuốc súng (đạn nhựa) Mẫu (mô hay tế bào) Khoang chân không chứa mô Không bào Bắn tiểu thể vào mô Tế bào chất Dàn lên màng lọc bên tế bào nuôi dưỡng Vi đạn xâm Nhân nhập vào tế bào Thành tế bào Tái sinh Hình 4.2 Sơ đồ chuyển gen súng bắn gen 4.1 Sử dụng trồng chuyển gen Hiện nay, sản phẩm lương thực-thực phẩm cơng nghệ sinh học tạo có mặt thị trường Những trồng biến đổi gen giống trồng truyền thống chúng có thêm số đặc điểm cải thiện Chúng có lợi cho nơng dân mà cịn cho người tiêu dùng Người nông dân gặt hái vụ mùa bội thu, người tiêu dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn Cơng nghệ gen nơng nghiệp 104 Ngồi ra, giống tạo cơng nghệ sinh học cịn có tiềm bảo vệ mơi trường Trên thị trường nay, có số loại trồng cơng nghệ sinh học cải thiện tình trạng chất lượng như: - Có khả chống chịu bệnh - Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu - Tăng thành phần dinh dưỡng - Tăng thời gian bảo quản (Bảng 4.1) Bảng 4.1 Một số trồng công nghệ sinh học chủ yếu Cây trồng Đặc điểm Cải dầu Kháng thuốc diệt cỏ Cải dầu Hàm lượng laurate cao Cải dầu Hàm lượng oleic acid cao Ngô Kháng thuốc diệt cỏ Ngô Kháng côn trùng Bông Kháng thuốc diệt cỏ Bông Kháng côn trùng Đu đủ Kháng virus Khoai tây Kháng côn trùng Khoai tây Kháng virus Đậu tương Kháng thuốc diệt cỏ Đậu tương Hàm lượng oleic acid cao Bí Kháng virus Cà chua Chín chậm Cà chua Kháng virus Chú thích - Thuốc diệt cỏ (herbicide): Các chất hóa học thường xuyên sử dụng nơng nghiệp để kiểm sốt cỏ dại vốn gây ảnh hưởng tới nước, ánh sáng chất dinh dưỡng đất Công nghệ gen nông nghiệp 105 - Laurate: Muối lauric acid, acid béo quan trọng có xà phịng chất tẩy, có nguồn gốc chủ yếu từ dầu dừa dầu cọ Loại dầu cải dùng cơng nghiệp thực phẩm để làm lớp phủ ngồi kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ, chí cịn sử dụng công nghiệp mỹ phẩm - Oleic acid: Đây acid béo có liên kết khơng no Về góc độ dinh dưỡng chất béo không no xem tốt so với chất béo no có thịt bị, lợn, phomát số thức ăn thường ngày khác - Ngô kháng côn trùng (sâu đục thân): Là loại ngô chuyển gen sản xuất loại protein tinh thể (crystal protein) có nguồn gốc từ vi khuẩn đất tự nhiên (Bt-Bacillus thuringiensis) Protein cho phép ngơ bơng có khả kháng ổn định sâu đục thân Ngô Bt làm giảm nhiễm độc nấm vết thương hở (Hình 4.3) Hình 4.3 Ngơ chuyển gen kháng trùng Mexico - Đu đủ kháng virus: Đu đủ mang gen virus mã hóa cho protein vỏ (coat protein: thành phần virus, chức protein vỏ bảo vệ thông tin di truyền virus) virus đốm vòng đu đủ (PRSV) Protein tạo cho đu đủ khả tự bảo vệ chống lại PRSV Một gen từ nguồn bệnh sử dụng để kháng lại (Hình 4.4) - Khoai tây kháng côn trùng: Khoai tây mang gen sản xuất protein kháng sâu tạo cho khả tự bảo vệ trước bọ khoai tây Colorado (Hình 4.5) - Khoai tây kháng virus: Đã có vài giống khoai tây chuyển gen nhằm kháng virus xoăn khoai tây (PLRV) virus khoai tây Y (PVY) Loại khoai tây chuyển gen virus để tự kháng lại virus Công nghệ gen nông nghiệp 106 - Bí kháng virus: Có khả kháng virus khảm vàng zucchini Phương pháp công nghệ sinh học tiết kiệm chi phí chống rệp (vector mang virus) từ giảm hạn chế hồn tồn việc sử dụng thuốc trừ sâu (Hình 4.6) - Cà chua chín chậm: Là loại thực phẩm chuyển gen sản xuất nước phát triển Giống cà chua có thời gian lưu quầy bán hàng dài Nó mang gen làm chậm q trình trình mềm tự nhiên chín Loại giữ lâu so với giống khác, bảo quản tươi lâu Hơn nữa, thời gian lưu giữ quầy bán hàng dài tăng giá trị thương mại sau thu hoạch bảo quản, giảm giá thành sản phẩm A B Hình 4.4 Cây đu đủ trồng Thailand Bên phải hình A chuyển gen kháng virus đốm vịng bên trái hình A khơng chuyển gen (bên trái hình A) Hình B giới thiệu đu đủ chuyển gen phát triển khỏe mạnh Hình 4.5 Khoai tây chuyển gen kháng trùng Công nghệ gen nông nghiệp 107 A B Hình 4.6 Bí chuyển gen kháng virus khảm vàng zucchini A: Ruộng bí chuyển gen B: Quả bí khơng chuyển gen bị nhiễm virus (bên trái) bí chuyển gen phát triển bình thường Nhìn chung, việc sử dụng giống trồng chuyển gen đem lại lợi nhuận đáng kể cho nước phát triển “Thế hệ đầu tiên” giống chứng minh khả tăng suất trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp góp phần bảo vệ mơi trường Hiện nay, nghiên cứu hướng đến trồng biến đổi gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng khả chế biến Các giống trồng khẳng định giá trị chúng quốc gia có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm Tuy nhiên, liệu thực phẩm cơng nghệ sinh học có an tồn hay không thảo luận phần sau Hình 4.7 Đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Công nghệ gen nông nghiệp 108 A B Hình 4.8 Cà chua chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột CMV (cucumber mosaic virus) A: Cây không chuyển gen bị nhiễm CMV B: Cây chuyển gen sinh trưởng bình thường 4.2 Các nghiên cứu an toàn chuyển gen 4.2.1 Xác nhận chuyển gen hạt phấn Cho đến nay, khơng có hạt phấn loại trồng chuyển gen hạn chế khả phát tán Điều có nghĩa tương lai cần phải xác định quản lý dịch chuyển hạt hạt phấn Các phương thức quản lý cách ly không gian thời gian sử dụng để hạn chế lưu chuyển gen (gene flow) trồng, hạn chế hạt sót lại đất sót lại sau thu hoạch Việc sử dụng vùng cách ly, rào cản trồng rào cản thực vật khác nguồn tạo nơi nhận hạt phấn làm giảm mức độ phát tán hạt phấn Thời gian hạt phấn khơng khí dài, phát tán đến khoảng cách xa Nghiên cứu Reheul (1987) ghi lại phát tán hạt phấn nhờ gió có khoảng cách 1000 m Tuy nhiên, điều kiện thời tiết môi trường thay đổi gây phát tán khoảng cách xa Các biện pháp cách ly sinh học phát triển để xác định liệu sinh sản trồng kiểm sốt hay không để tránh giao lưu gen qua hạt hạt phấn Đặc biệt giống dịng có bất dục đực, xảy tượng lai xa với giống biến đổi gen hữu thụ với tần số cao khoảng cách xa so với giống truyền thống Sự tích lũy gen (gene stacking) Công nghệ gen nông nghiệp 109 ... Câu hỏi Hãy trình bày bước qui trình tạo động vật chuyển gen? Tại nói Cơng nghệ tạo động vật chuyển gen hướng công nghệ cao Công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống? Công nghệ sinh sản... liệu thực phẩm công nghệ sinh học có an tồn hay khơng thảo luận phần sau Hình 4.7 Đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Công nghệ gen nông nghiệp 1 08 A B Hình 4 .8 Cà chua chuyển gen kháng virus... Gây nhiễm vào Hình 4.1 Sơ đồ chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens Công nghệ gen nông nghiệp 103 Promoter cho biểu gen thực vật Gen nhân dịng Các trình tự vi khuẩn μm Kết tủa DNA thành