Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu bù ốc leo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  - - NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f) Benth ex Hook.f., họ Thiên lý (Asclepiadaceae)) KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  - - NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f) Benth ex Hook.f., họ Thiên lý Asclepiadaceae)) KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2015Y Người hướng dẫn: PGS.TS ĐỖ THỊ HÀ TS VŨ ĐỨC LỢI HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Em là Nguyễn Thị Ngọc Liên, sinh viên K4 Dược học Lời em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt năm qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS Đỗ Thị Hà, TS Vũ Đức Lợi, người ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS Phạm Thị Thúy, DS Vũ Thị Diệp, người chị, người thầy đồng hành và giúp đỡ em rất nhiều q trình làm khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến cán nghiên cứu cùng anh chị, bạn ở Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu giúp đỡ em q trình thực hiện khóa luận Em xin gửi lời cám ơn Nghị định thư Việt - Hàn "Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư điều hịa miễn dịch số thuốc Việt Nam" hỗ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân ln quan tâm, động viên giúp em hồn thành khóa luận Dù rất cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy để khố luận thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Liên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ DĐVN V Dược điển Việt Nam V EtOH Ethanol SD Độ lệch chuẩn Rf Hệ số di chuyển TCCS Tiêu chuẩn sở TT Thuốc thử TLC Thin layer chromatography UV Ánh sáng tử ngoại v/v Tỉ lệ thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của Bù ốc leo Bảng Kết định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phản ứng ống nghiệm 23 Bảng Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo 26 Bảng 3 Tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo 26 Bảng Tỷ lệ tro không tan acid của dược liệu Bù ốc leo 27 Bảng Hàm lượng chất chiết được nước 27 Bảng Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% 27 Bảng Hàm lượng saponin tổng số dược liệu Bù ốc leo 28 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1 Hình ảnh loài Dregea volubilis (L f) Benth ex Hook.f [6] Hình Các hợp chất polyhydroxy pregnanes phân lập được từ Bù ốc leo Hình Các hợp chất polyoxypregnan glycoside phân lập được từ Bù ốc leo Hình Các hợp chất flavonoid phân lập được từ Bù ốc leo [12, 16, 23, 29] Hình Các hợp chất phenolic phân lập được từ Bù ốc leo [12] 10 Hình Hợp chất pentacyclic triterpenoid phân lập được từ Bù ớc leo [14] 10 Hình Các hợp chất sterol và carbohydrate phân lập được từ Bù ớc leo [14] 10 Hình Hình ảnh dược liệu Bù ớc leo 20 Hình Hình ảnh vi phẫu thân Bù ớc leo 21 Hình 3 Hình ảnh vi phẫu lá Bù ớc leo 22 Hình Đặc điểm bột dược liệu Bù ốc leo 23 Hình Sắc ký đờ TLC định tính dược liệu Bù ốc leo 25 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Dregea 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật .2 1.1.3 Phân bố 1.2 Tổng quan về loài Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f 1.2.1 Danh pháp 1.2.2 Đặc điểm thực vật .3 1.2.3 Phân bố và sinh thái 1.2.4 Tính vị, cơng năng, tác dụng .4 1.2.5 Thành phần hóa học 1.2.6 Tác dụng dược lý 11 1.3 Tổng quan về tiêu chuẩn sở 11 1.3.1 Tình hình sử dụng dược liệu 11 1.3.2 Xây dựng TCCS 11 1.3.3 Phương thức xây dựng TCCS 11 1.3.4 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở của dược liệu 12 1.3.5 Tiêu chuẩn công bố về dược liệu Bù ốc leo .12 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, máy móc, thiết bị 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.1.2 Dung mơi, hóa chất, thiết bị 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Mô tả .15 2.2.2 Vi phẫu 15 2.2.3 Soi bột .15 2.2.4 Định tính 15 2.2.5 Độ ẩm 17 2.2.6 Tro toàn phần 17 2.2.7 Tro không tan acid 17 2.2.8 Xác định hàm lượng chất chiết được 18 2.2.9 Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân .18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 20 3.1 Kết khảo sát xác định chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo 20 3.1.1 Kết mô tả đặc điểm dược liệu 20 3.1.2 Kết xác định đặc điểm vi phẫu 20 3.1.3 Kết xác định đặc điểm bột dược liệu 22 3.1.4 Kết định tính .23 3.1.5 Kết xác định độ ẩm 26 3.1.6 Kết xác định tro toàn phần .26 3.1.7 Kết xác định tro không tan acid 26 3.1.8 Hàm lượng chất chiết được dược liệu 27 3.1.9 Kết định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân 28 3.2 Kết xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo 28 3.2.1 Yêu cầu kỹ thuật 28 3.2.2 Phương pháp thử .29 3.2.3 Đóng gói và bảo quản .31 3.3 Bàn luận 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu của người về sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng càng cao Bên cạnh đó, xu hướng nghiên cứu sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ nguồn động thực vật cũng rất được quan tâm Các nhà khoa học ở Việt Nam cũng tham gia vào tìm kiếm, phát triển lĩnh vực này Là đất nước có ng̀n thực vật phong phú, có tiềm rất lớn về tài nguyên thuốc Đây là tiền đề tốt để nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu Cây Bù ốc leo là thuốc phổ biến ở Ấn Độ Ở Việt Nam, có mặt ở vùng Lai Châu, Ninh Bình, Ninh Thuận, TP Hờ Chí Minh, … Toàn có tác dụng nhiệt, tiêu viêm, chỉ thống, chỉ thổ Dân gian dùng phận mặt đất của để trị mụn nhọt, rắn cắn, đau dày, bệnh về mắt [6] Cũng có tài liệu cho thấy, nhân dân còn dùng rễ, thân mềm vị thuốc gây nôn, long đờm [16] Trên giới có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của Bù ốc leo, đáng ý là: chống ung thư [21], chống viêm [23] Cũng có nhiều nghiên cứu khác chỉ tác dụng chống đái tháo đường [16], trị giun sán [22], chống mất trí nhớ [35] Ở Việt Nam, Bù ốc leo chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, tác dụng sinh học cũng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng Do đó, nghiên cứu về sẽ là tiền đề để góp phần xây dựng sở liệu về Bù ốc leo, tạo nền tảng cho việc dần đưa thuốc vào thực tế sử dụng cách khoa học Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f., họ Thiên lý Asclepiadaceae)” được thực hiện với mục tiêu: Xác định được chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo Xây dựng được tiêu chuẩn sở của dược liệu Bù ốc leo CHƯƠNG 1: TỞNG QUAN 1.1 Tởng quan chi Dregea 1.1.1 Vị trí phân loại Theo Thực vật học [10], [9], vị trí phân loại của chi Bù ốc (Dregea) giới thực vật sau: Giới (Kingdom) Thực vật (Planta) Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) Hai mầm (Magnoliopsida) Phân lớp (Subclass) Bộ (Order) Bạc hà (Lamiidae) Long đởm (Gentianales) Họ (Family) Chi (Genus) Thiên lý (Asclepiadaceae) Bù ốc (Dregea) 1.1.2 Đặc điểm thực vật Chi Dregea gồm loài thường bụi trườn, leo hay cỏ bị, khơng có rễ phụ phát triển thân Lá mọc đối Cụm hoa xim hình tán Thùy đài nhỏ, hình trứng nhọn đầu đơi tù; gốc đài khơng có hoặc có tuyến Tràng hình bánh xe; tràng khơng dính thành ống đứng, cánh hoa vặn, phủ bên phải Tràng phụ đơn, gờm vảy nạc, hình cầu, dính với cột nhị-nhụy Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ơ; trung đới kéo dài thành phần phụ; hạt phấn dính thành khối phấn có sáp bao bên ngồi vách khối phấn, khối phấn khơng có mỏm ở đỉnh; quan trùn phấn có gót đính và chi; khối phấn hướng lên; chỉ có khối phấn phấn Đầu nhụy hình nón hay gờ ghề; đỉnh bầu khơng thót lại thành hình vịi nhụy Quả nang dày, có khía lời dạng cánh [6] Hạt có mào lông [26] 1.1.3 Phân bố Trên giới: chi Dregea có khoảng 12 lồi, phân bố ở châu Á châu Phi [6, 26, 42] Ở Việt Nam: chi Dregea chi nhỏ của họ Thiên lý Theo thống kê Thực vật chí Việt Nam tập 15 - Họ Thiên lý (Asclepiadaceae), tính đến năm 2017, chi Dregea ở Việt Nam có lồi Bù ốc leo (Dregea volubilis (L f.) Benth & Hook.) Bù ốc Đà Lạt (Dregea cuneifolia Tsiang & P T Li) [6] Tuy nhiên, năm 2011, 1, 2, 3: mẫu dược liệu Bù ốc leo; A: Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm; B: Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm; C: Phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, quan sát ánh sáng thường 3.1.5 Kết quả xác định độ ẩm Tiến hành mô tả ở mục 2.5, thu được kết tình bày ở bảng 3.2: Bảng Độ ẩm dược liệu Bù ốc leo Khối lượng dược liệu Khối lượng dược Độ ẩm M ± SD trước sấy (g) liệu sau sấy (g) (%) (%) 1,014 0,8841 12,81 1,023 0,8922 12,79 1,007 0,8778 12,83 Lần thí nghiệm 12,81 ± 0,02 Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 12.79% đến 12.83% Như vậy, dự kiến độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo không 13% 3.1.6 Kết quả xác định tro toàn phần Tiến hành mô tả ở mục 2.6., kết xác định tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.3: Bảng 3 Tro toàn phần dược liệu Bù ốc leo Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng tro (g) Tỷ lệ tro toàn phần (%) 1,011 0,0583 5,77 1,013 0,0594 5,86 1,004 0,0576 5,74 Lần thí nghiệm M ± SD (%) 5,79 ± 0,07 Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 5,74% đến 5,86% Như vậy, dự kiến giới hạn tro toàn phần không 6% 3.1.7 Kết quả xác định tro không tan acid Tiến hành theo mô tả ở mục 2.7., kết thu được bảng 3.4: 26 Bảng Tỷ lệ tro không tan acid dược liệu Bù ốc leo Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng tro không tan acid (g) Tỷ lệ tro không tan acid (%) 1,011 0,0214 2,12 1,013 0,0223 2,20 1,004 0,0211 2,10 Lần thí nghiệm M ± SD (%) 2,14 ± 0,05 Tỉ lệ tro không tan acid của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 2,10% đến 2,20% Như vậy, dự kiến giới hạn tro không tan acid không 2,5% 3.1.8 Hàm lượng chất chiết được dược liệu Sau tiến hành mô tả ở mục 2.8., kết xác định hàm lượng chất chiết được EtOH 70% và nước của Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.5 3.6: Bảng Hàm lượng chất chiết được nước Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g) Chất chiết được nước (%) 12,81 1,999 0,1425 16,35 12,79 2,003 0,1404 16,07 12,83 2,002 0,1434 16,43 Lần thí nghiệm M ± SD (%) 16,29 ± 0,15 Hàm lượng chất chiết được nước của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,07% đến 16,43% Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được nước của dược liệu Bù ốc leo khơng 16% Bảng Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g) Chất chiết được EtOH 70% (%) 12,81 2,000 0,1463 16,78 12,79 2,000 0,1470 16,86 12,83 1,999 0,1461 16,77 Lần thí nghiệm M ± SD (%) 16,80 ± 0,04 Hàm lượng chất chiết được EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,77% đến 16,86% Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo khơng 16% 27 3.1.9 Kết quả định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân Sau tiến hành mô tả ở mục 2.9., kết xác định hàm lượng saponin tổng số của dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.7: Bảng Hàm lượng saponin tổng số dược liệu Bù ốc leo Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) 12,81 1,000 0,0524 6,01 12,79 0,997 0,0521 5,99 12,83 1,001 0,0532 6,10 Lần thí nghiệm Khối lượng cắn Hàm lượng saponin saponin (g) toàn phần (%) M ± SD (%) 6,03 ± 0,05 Hàm lượng saponin tổng số dược liệu Bù ốc leo xác định bằng phương pháp cân khoảng từ 5,99% đến 6,10% Như vậy, dự kiến hàm lượng saponin dược liệu khơng 6,0% 3.2 Kết xây dựng TCCS dược liệu Bù ốc leo 3.2.1 Yêu cầu kỹ thuật 3.2.1.1 Mô tả Dược liệu có mùi hăng, phần thân khơ có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp Phần có màu xám Lá tươi Bù ốc leo có hình trứng tròn, mũ nhọn, gốc hình tim nơng 3.2.1.2 Vi phẫu Vi phẫu thân: Vi phẫu dược liệu có thiết diện hình trịn, từ ngoài vào có đặc điểm: vỏ ngoài có lơng che chở; libe gỗ và mạch gỗ rất phát triển; mô mềm ruột và vỏ chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai Vi phẫu lá: Vi phẫu đối xứng, gân phía và gân phía đều lời, gân phía lời nhiều hơn, vỏ ngoài có lơng che chở 3.2.1.3 Soi bợt Bột dược liệu có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị đắng Quan sát bằng kính hiển vi thấy đặc điểm: mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat, bó sợi, tế bào sợi, tinh thể calci oxalat nằm rải rác 3.2.1.4 Đợ ẩm Khơng q 13,0% 3.2.1.5 Tro tồn phần Không 6,0% 28 3.2.1.6 Tro không tan acid Không 2,5% 3.2.1.7 Chất chiết được dược liệu Chất chiết được dược liệu nước không 16% Chất chiết được dược liệu ethanol 70% khơng 16% 3.2.1.8 Định tính: Dược liệu phải thể hiện phép thử định tính của saponin flavonoid 3.2.1.9 Định lượng: Hàm lượng saponin tổng số xác định bằng phương pháp cân không được 6,0% tính theo dược liệu khơ kiệt 3.2.2 Phương pháp thử 3.3.2.1 Mơ tả: Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo trực tiếp, dược liệu phải đạt yêu cầu nêu ở 3.2.2.2 Vi phẫu: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và chế phẩm bằng kính hiển vi Dược liệu được cắt thành lát cắt ngang, nhuộm kép và quan sát kính hiển vi, phải thấy đặc điểm mô tả 3.2.2.3 Bột: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và chế phẩm bằng kính hiển vi Nghiền dược liệu khơ thành bột mịn rời quan sát kính hiển vi giọt dung dịch soi, phải thấy đặc điểm mô tả 3.2.2.4 Độ ẩm: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105oC, giờ 3.2.2.5 Tro toàn phần: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8 3.2.2.6 Tro không tan acid: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.7 3.2.2.7 Chất chiết được dược liệu Cân xác khoảng 2,000 g bột dược liệu, cho vào bình nón 250 ml Thêm xác 50,0 ml dung mơi, đậy kín, cân xác định khối lượng, để n giờ, sau đun hời lưu cách thủy sơi nhẹ giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 25 ml dịch lọc cho vào cốc thuỷ tinh cân bì trước, cách thủy đến cắn khô Sấy cắn ở 105ºC 29 giờ, lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau sấy × 𝑎 × 100 × 100% 𝑏 × (100 − 𝑥) Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được EtOH 70% hoặc nước (%) a: khối lượng cắn (g) b: khối lượng dược liệu (g) 𝑋(%) = x: độ ẩm của dược liệu (%) 3.2.2.8 Định tính a Định tính bằng phản ứng ống nghiệm Định tính saponin: - Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón g dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90% đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, bốc dịch lọc đến cắn Hòa tan cắn ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách Định tính flavonoid: - Phản ứng với kiềm cho ml dịch chiết EtOH vào ống nghiệm, cho thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, màu vàng đậm phản ứng dương tính - Phản ứng Cyanidin cho ml dịch chiết EtOH vào ống nghiệm, thêm bột magie kim loại, rời thêm – giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ phản ứng dương tính - Phản ứng với FeCl3 cho ml dịch chiết EtOH vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh đen phản ứng dương tính b Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V, phụ lục 5.4)  Thuốc thử, dụng cụ: Bản mỏng: mỏng silica gel 60 F254 (Merck), mỏng silical gel 60 RP – 18 F254S (Merck), hoạt hóa ở 105℃ 30 phút Hệ dung môi khai triển: + Hệ 1: dicloromethan - methanol (9:1, v/v); + Hệ 2: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) + Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v) Thuốc thử vết: Dung dịch acid sulfuric 10% ethanol  Cách thử: 30 Dung dịch thử: mẫu dịch chiết dược liệu Bù ốc leo bằng EtOH 70% giờ Cách tiến hành: chấm riêng biệt 10 l dung dịch mẫu thử lên mỏng, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4 Sau khai triển hệ dung môi được cm, lấy mỏng ra, để khơ ở nhiệt độ phịng rời phun thuốc thử hiện vết Sấy mỏng ở 105℃ hiện rõ vết, quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 3.2.2.9 Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân Cân xác khoảng 1,000 g bột dược liệu, chiết hồi lưu ở 70oC lần, lần 50 ml EtOH 70% giờ Lọc thu dịch chiết Cất thu hồi dung môi đến cắn Hòa tan cắn với 50 ml nước cất Sau chiết lỏng - lỏng với khoảng n-hexan lần, lần 50 ml để loại chất béo Dịch chiết nước sau chiết với n–hexan tiếp tục chiết lỏng – lỏng với n-butanol lần, lần 50 ml Gộp dịch chiết n-butanol, cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu được cắn Hòa tan cắn bằng 20 ml EtOH 70% rời chuyển sang cốc có mỏ xác định khối lượng Cô cách thủy thu được cắn Sấy khô cắn ở 105oC đến khối lượng khơng đởi × 𝑎 × 100 𝑋(%) = × 100% 𝑏 × (100 − 𝑥) Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được EtOH 70% hoặc nước (%) a: khối lượng cắn (g) b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%) 3.2.3 Đóng gói và bảo quản - Dược liệu được bảo quản túi nilong kín, có nhãn rõ ràng, quy chế - Bảo quản ở nơi khơ ráo, thống mát 3.3 Bàn luận  Về khảo sát chỉ tiêu chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo Nghiên cứu tiến hành khảo sát chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu Bù ốc leo theo tiêu chí chung được quy định DĐVN V, bao gồm: mô tả, vi phẫu, soi bột, tro tồn phần, tro khơng tan acid, chất chiết được EtOH 70%, chất chiết được nước, định tính nhóm chất flavonoid saponin bằng phản ứng ống nghiệm, định tính bằng TLC, hàm lượng saponin tổng số Dược liệu Bù ốc leo chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá chất lượng, cũng chưa có chuyên luận riêng 31 Dược điển Do đó, kết của nghiên cứu góp phần tạo sở liệu cho việc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu Độ ẩm là hàm lượng ẩm dược liệu sau phơi hoặc sấy khô Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 12,81% Kết này tương đồng với kết xác định của Purushoth Prabhu T và cộng thực hiện, độ ẩm của dược liệu là 11,25% Tro toàn phần dùng để đánh giá tạp chất lẫn dược liệu Tạp chất có ng̀n gốc chất vơ có sẵn tế bào thực vật hoặc tạp chất ngoại lai đất, cát bề mặt dược liệu bị lẫn vào Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 5,79% Dược điển Việt Nam V không quy định về giới hạn cho chỉ tiêu này Đối chiếu với nghiên cứu về tiêu chuẩn Bù ốc leo được Purushoth Prabhu T và cộng thực hiện, tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo thu hái ở Tamil Nadu, Ấn Độ là 18% Có thể thấy tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo sử dụng nghiên cứu thấp hơn, chứng tỏ thành phần tạp chất vô dược liệu được lấy ở Lai Châu, Việt Nam thấp mẫu dược liệu được lấy ở Tamil Nadu, Ấn Độ Tạp chất dược liệu gồm chất vô có sẵn tế bào thực vật, hoặc tạp đất cát dính dược liệu trước được xay nhỏ Chỉ tiêu tro không tan acid đánh giá tạp Silic và đất cát dính dược liệu Tỉ lệ tro không tan acid của mẫu dược liệu Bù ốc leo sử dụng nghiên cứu là 2,14% Đối chiếu với đánh giá Purushoth Prabhu T và cộng thực hiện, kết xác định tỉ lệ tro không tan acid của mẫu dược liệu Bù ốc leo thu hái ở Tamil Nadu, Ấn Độ là 0,75% Có thể thấy mẫu Bù ốc leo được lấy ở Lai Châu, Việt Nam có nhiều tạp Silic và đất cát mẫu ở Tamil Nadu, Ấn Độ Tuy nhiên, nhiều dược liệu khác cũng có tỉ lệ tro không tan acid khoảng 2% Hàm lượng chất chiết được dược liệu Bù ốc leo được tiến hành với hai dung môi nước và EtOH 70% Kết cho thấy hàm lượng chất chiết được nước là 16,29% và EtOH 70% là 16,80% Có thể thấy hàm lượng chất chiết được nước EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo khơng có khác biệt đáng kể Nghiên cứu này cũng xác định được đặc điểm đặc trưng của vi phẫu thân, vi phẫu và đặc điểm bột của dược liệu Bù ốc leo, góp phần tạo sở liệu phục vụ công tác kiểm nghiệm, giúp phân biệt và xác định tính của dược liệu Bằng phản ứng hóa học đặc trưng, đề tài xác định được nhóm chất saponin và flavonoid dược liệu 32 Về kết định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phương pháp TLC, nghiên cứu tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác và xác định được hệ cho hiệu phân tách tốt Với hệ pha động diclomethan – methanol (9:1, v/v), phun thuốc thử thấy sắc ký đồ xuất hiện vết, với tách rõ ràng Với hệ pha động cloroform : ethyl acetat : methanol : nước (2:4:2:1, v/v/v/v), sau phun thuốc thử sắc ký đồ xuất hiện 10 vết Với hệ pha động aceton – nước (3:1, v/v), sau phun thuốc thử thấy sắc ký đồ có vết Có thể thấy, triển khai sắc ký bằng hệ dung môi này, vết chất xuất hiện sắc ký đồ dịch chiết dược liệu Bù ốc leo đều gọn phân tách rõ ràng Như vậy, nghiên cứu khảo sát và xác định được hệ dung môi phù hợp, hiệu việc định tính và xác định dấu vân tay hóa học của dược liệu Bù ốc leo Về định lượng, nghiên cứu xác định được hàm lượng saponin tổng số dược liệu Bù ốc leo bằng phương pháp cân Kết thấy rằng hàm lượng saponin tổng số dược liệu Bù ốc leo khoảng 6,03%  Về hạn chế khóa luận Do số nguyên nhân chủ quan và khách quan, đề tài hạn chế Trong nghiên cứu này, chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo chưa được khảo sát nhiều mẫu nghiên cứu Các mẫu nguyên liệu chưa lấy được ở nhiều vùng để đảm bảo tính đại diện, chưa cùng thời điểm để loại bỏ ảnh hưởng của thời điểm thu hái thời gian bảo quản đến chất lượng của dược liệu Nghiên cứu cũng chưa đưa được số chỉ tiêu chưa thực hiện được tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, … Những nghiên cứu cần khắc phục hạn chế này để tạo được sở liệu đầy đủ, góp phần xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng được tiêu chuẩn sở dược liệu Bù ốc leo sau: Mô tả Dược liệu có mùi hăng, phần thân khơ có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp Phần có màu xám Lá tươi Bù ốc leo có hình trứng tròn, mũ nhọn, gốc hình tim nơng Vi phẫu Vi phẫu thân: Vi phẫu dược liệu có thiết diện hình trịn, từ ngoài vào có đặc điểm: vỏ ngoài có lơng che chở; libe gỗ và mạch gỗ rất phát triển; mô mềm ruột và vỏ chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai Vi phẫu lá: Vi phẫu đối xứng, gân phía và gân phía đều lời, gân phía lời nhiều hơn, vỏ ngoài có lơng che chở Soi bột Bột dược liệu có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị đắng Quan sát bằng kính hiển vi thấy đặc điểm: mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat, bó sợi, tế bào sợi, tinh thể calci oxalat nằm rải rác Độ ẩm Không 13,0% Tro tồn phần Khơng q 6,0% Tro khơng tan acid Không 2,5% Chất chiết được dược liệu Chất chiết được dược liệu nước khơng 16,0% Chất chiết được dược liệu ethanol 70% khơng 16,0% Định tính Dược liệu phải thể hiện phép thử định tính của saponin flavonoid Định lượng Hàm lượng saponin tổng số xác định bằng phương pháp cân không được 6,0% tính theo dược liệu khơ kiệt Kiến nghị 34 - Do thời gian có hạn, đề tài chỉ xây dựng được tiêu chuẩn sở với mẫu thu hái Lai Châu Do đó, cần tiến hành nghiên cứu cỡ mẫu lớn để việc kết luận chỉ tiêu mang tính đại diện cho dược liệu Bù ốc leo - Đề xuất xác định tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng, định lượng tổng hàm lượng flavonoid cho dược liệu Bù ốc leo - Đề xuất nghiên cứu thiết lập dược liệu chuẩn đối chiếu và chất chuẩn đối chiếu - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Bù ốc leo để bổ sung chuyên luận về dược liệu Bù ốc leo Dược điển Việt Nam 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), "Thông tư 21/2007/TT-BKHCN, Hướng dẫn xây dựng áp dụng tiêu chuẩn" Bộ môn Dược liệu (2012), "Phương pháp nghiên cứu dược liệu", Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr.26-42 Bộ mơn Dược liệu (2010), "Thực tập Dược liệu", Hà Nội, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 59-78 Bộ Y tế (2017), "Dược điển Việt Nam, tập V", NXB Y học Quốc Hội (2016), "Luật Dược" Trần Thế Bách (2017), "Thực vật chí Việt Nam, tập 15", Hà Nội, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, tr 25-32, 203-207 Võ Văn Chi (2012), "Từ điển Cây thuốc Việt Nam", NXB Y Học, tr 253-254 Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hường (2017), "Giáo trình thực hành: Thực vật Dược liệu - Dược học cổ truyền", Hà Nội, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 11-14 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2005), "Thực vật học", Hà Nội, Trường Đại học Dược Hà Nội, 304-305 Trần Thế Bách (2017), "Thực vật chí Việt Nam," Hà Nội, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, 25-32 Võ Văn Chi (2012), "Từ điển Cây thuốc Việt Nam", Hà Nội, Nhà xuất Y Học, 253-254 Tài liệu Tiếng Anh [12] Bharathamma G., Sudarsanam G (2015), "Phytochemical investigation of aqueous fruit extracts of Dregea volubilis (Linn.) Benth," Indian J Plant Sci, vol 4, pp 11-15 [13] Biswas Moulisha, Bhattacharya Sanjib, Mukhopadhyay R., Haldar PK (2018), "Dregea volubilis (L f.) Benth.(Asclepiadaceae): an appraisal on pharmacognostic, phytochemical and pharmacological studies," Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, vol 18, (no) 1, pp 1-8 [14] Biswas Moulisha, Bikash Mandal Nirup, Partha Palit, Kumar Ghosh Ashoke, Sukdeb Bannerjee, Kanti Haldar Pallab (2009), "In vitro anti-leishmanial and anti-tumour activities of a pentacyclic triterpenoid compound isolated from the fruits of Dregea volubilis Benth Asclepiadaceae," Tropical Journal of Pharmaceutical Research, vol 8, (no) [15] Biswas Moulisha, Haldar Pallab Kanti, Ghosh Ashoke Kumar (2010), "Antioxidant and free-radical-scavenging effects of fruits of Dregea volubilis," Journal of natural science, biology, and medicine, vol 1, (no) 1, p 29 [16] Das B., De A., Das M., Das S., Samanta A (2017), "A new exploration of Dregea volubilis flowers: Focusing on antioxidant and antidiabetic properties," South African Journal of Botany, vol 109, pp 16-24 [17] Das Bhaskar, De Arnab, Das Piu, Nanda Amalesh, Samanta Amalessh (2019), "Pharmacognostic studies on flower of Dregea volubilis: Evaluation for 36 [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] authentication and standardization," Asian J Pharm Clin Res, vol 12, (no) 5, pp 79-89 Chaudhuri S Dev, Chakraborty U (2017), "Phytochemical constituents and radical scavenging activities of stem bark extracts of Dregea volubilis (Linn F.) Benth ex Hook F," International J Pharm Sciences Res, vol 8, pp 46754681 Do Van Hai, Bui Ha Thu, Choi Sangho, Eum Sangmi, Rodda Michele (2018), "Dregea taynguyenensis (Apocynaceae, Asclepiadoideae), a new species from Vietnam," Phytotaxa, vol 333, (no) 2, pp 267-273 Fatimah ZI., Zaiton Z., Jamaludin M., Gapor MT., Nafeeza MI., Khairul O (1998), "Effect of estrogen and palm vitamin E on malondialdehyde levels toward the development of arteriosclerosis in the New Zealand white rabbit," Biological Oxidants and Antioxidants: Molecular Mechanism and Health Effects AOCS Press, Champaign, IL, USA, p 22 Hossain Emdad, Chakroborty Saikat, Milan Ahmed, Chattopadhyay Pronobesh, Mandal Subhash C., Gupta JK (2012), "In vitro and in vivo antitumor activity of a methanol extract of Dregea volubilis leaves with its antioxidant effect," Pharmaceutical biology, vol 50, (no) 3, pp 338-343 Hossain Emdad, Chandra Goutam, Nandy Anadi P., Gupta Jayanta Kumar, Mandal Subhash C (2013), "Possible fasciocidal activity of methanol extract of Dregea volubilis leaves," Experimental parasitology, vol 135, (no) 2, pp 183-187 Hossain Emdad, Sarkar Debjani, Maiti Anup, Chatterjee Mitali, Mandal Subhash C., Gupta Jayanta Kumar (2010), "Anti-inflammatory effect of a methanolic extract of leaves of Dregea volubilis," Journal of ethnopharmacology, vol 132, (no) 2, pp 525-528 Kumar P., Ayyanar M., Ignacimuthu S (2007), "Medicinal plants used by Malasar tribes of Coimbatore district, Tamil Nadu." Shukla Amit Kumar, "Pharmacognostical, phytochemical and antipyretic activity studies," RGUHS, 2010 Li Ping-tao, Michael G Gilbert, W Douglas Stevens (1995), "Flora of China," vol 16, pp 250 Mathiventhan U., Sivakaneshan R (2015), "Vitamin C content of commonly eaten green leafy vegetables in fresh and under different storage conditions," Tropical Plant Research, vol 2, (no) 3, pp 240-245 Nandi Debkumar et al (2009), "Anti-inflammatory and analgesic activities of leaf extract of Wattakaka volubilis (Dreagea volubilis)," International Journal of Green Pharmacy (IJGP), vol 3, (no) Panda Nilendu, Mandal Debayan, Mandal Nirup B., Sahu Niranjan P., Banerjee Sukdeb (2006), "Flavonoid and flavone C-glycosides from Dregea volubilis," Natural Product Communications, vol 1, (no) Panda Nilendu et al (2003), "Polyhydroxy pregnanes from Dregea volubilis," Tetrahedron, vol 59, (no) 42, pp 8399-8403 Pothitirat Werayut, Chomnawang Mullika Traidej, Supabphol Roongtawan, Gritsanapan Wandee (2009), "Comparison of bioactive compounds content, free radical scavenging and anti-acne inducing bacteria activities of extracts 37 [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] from the mangosteen fruit rind at two stages of maturity," Fitoterapia, vol 80, (no) 7, pp 442-447 Purushoth Prabhu T., Selvakumari S., Thirumal P., Susmitha Deepthi (2012), "Preliminary phytochemical and standardization of the plant Dregea vobulilis., Benth," International Journal of Bioassays (IJB), vol 01, pp 15-17 Rajadurai M., Vidhya VG., Ramya M., Bhaskar Anusha (2009), "Ethnomedicinal plants used by the traditional healers of pachamalai hills, Tamilnadu, India," Studies on Ethno-Medicine, vol 3, (no) 1, pp 39-41 Sahu Niranjan P., Panda Nilendu, Mandal Nirup B., Banerjee Sukdeb, Koike Kazuo, Nikaido Tamotsu (2002), "Polyoxypregnane glycosides from the flowers of Dregea volubilis," Phytochemistry, vol 61, (no) 4, pp 383-388 Sandhya Ch., Divya mohana K., Sasmitha S., Mounika P.V.N.S., Sampath kumar G.V (2013), "Evaluation of Dregea volubilis leaf extract for its potential against stress induced amnesia in experimental rats," BioMedRx, vol 1, (no) 3, pp 304-307 Sanyacharernkul S., Itghiarbha A., Kongtawelert P., Meepowpan P., Nuntasaen N., Pompimon W (2009), "A new polyoxypregnane glycoside from the roots of Dregea volubilis (Lf) Benth ex Hook f and its chondroprotective effect," American Journal of Biochemistry and Biotechnology, vol 5, (no) 4, pp 202209 Shankar K Ravi, Das Sanjoy, Bujala Pavani (2016), "Phytochemical screening and in vitro antibacterial activity of ethanol and aqueous extracts of Dregea volubilis leaves," Biosciences Biotechnology Research Asia, vol 7, (no) 2, pp 975-979 Silja VP., Varma K Samitha, Mohanan KV (2008), "Ethnomedicinal plant knowledge of the Mullu kuruma tribe of Wayanad district, Kerala." Sudhakar P., Kavitha D., Reddy P Ramachandra "A preliminary pharmacognostical report on the leaf of Dregea volubilis (l.f.) Benth ex Hook.f." Yogananth N., Palanivel S., Parvathy S., Chanthuru A., Bhakyaraj R (2012), "Effect of different plant hormones on callus induction in Leaf explant of Dregea volubilis Benth (Asclepiadaceae)," Journal of biosciences research, vol 3, (no) 3, pp 198-202 Yoshimura Shinichi, Narita Hiromi, Hayashi Kojo, Mitsuhashi Hiroshi (1983), "Studies on the constituents of asclepiadaceae plants LVI Isolation of new antitumor-active glycosides from Dregea volubilis (L.) Benth," Chemical and pharmaceutical bulletin, vol 31, (no) 11, pp 3971-3983 Trang web [42] http://www.theplantlist.org/browse/A/Apocynaceae/Dregea/ 38 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC 2: TIÊU BẢN THỰC VẬT CỦA MẪU NGHIÊN CỨU ... liệu Bù ốc leo chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá chất lượng, cũng chưa có chuyên luận riêng 31 Dược điển Do đó, kết của nghiên cứu góp phần tạo sở liệu cho việc nghiên cứu xây dựng tiêu. .. Bù ốc leo - Đề xuất nghiên cứu thiết lập dược liệu chuẩn đối chiếu và chất chuẩn đối chiếu - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Bù ốc leo. .. đầy đủ, góp phần xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng được tiêu chuẩn sở dược liệu Bù ốc leo sau: Mô tả Dược