CƠ SỞ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU ĐỐI VỚI THIỆT HẠI DO MÔI TRƯỜNG CỦA CÂY LÚA - CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG Diện tích đất trồng trọt trên thế giới chiếm 10% trong tổng số 13 tỉ ha. Trong đó, 11,5 triệu ha đất đang được canh tác được xem như không thuận lợi cho nông nghiệp (FAO 2002). Hầu hết đất trồng trọt được xếp vào nhóm dưới mức tối hảo cho cây trồng. Bên cạnh những thiệt hại do sâu bệnh gây ra, người ta ước đoán có 70% tiềm năng về năng suất bị mất...

Chương GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI CỦA MƠI TRƯỜNG Diện tích đất trồng trọt giới chiếm 10% tổng số 13 tỉ Trong đó, 11,5 triệu đất canh tác xem không thuận lợi cho nông nghiệp (FAO 2002) Hầu hết đất trồng trọt xếp vào nhóm mức tối hảo cho trồng Bên cạnh thiệt hại sâu bệnh gây ra, người ta ước đốn có 70% tiềm suất bị điều kiện bất lợi mơi trường, quốc gia có nông nghiệp phát triển (FAO 2002) Những thiệt hại sâu bệnh gây gọi với thuật ngữ "thiệt hại có tính chất sinh học" (biotic stresses) Những thiệt hại điều kiện bất lợi mơi trường, thí dụ khơ hạn, ngập úng, mặn, phèn, nóng, lạnh, v.v , gọi với thuật ngữ "thiệt hại có tính chất khơng phải sinh học (abiotic stresses) Sự khan nước tưới phục vụ cho nông nghiệp báo động nhiều hội nghị khoa học giới gần Do thay đổi khí với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ khí ấm dần lên, băng tan hai cực tạo ngập lụt vùng đất thấp (như đồng sông Cửu Long) Như vậy, lũ lụt xâm nhập mặn trở thành vấn đề lớn nhiều năm sau Với tầm quan trọng vậy, người ta hoạch định thứ tự ưu tiên đầu tư nghiên cứu tính chống chịu khơ hạn chống chịu mặn toàn giới, lĩnh vực cải tiến giống trồng, sau tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu đất có vấn đề (acid, thiếu lân, độ độc sắt, độ độc nhôm, thiếu kẽm, Mg, Mn số chất vi lượng khác Cu,…) 1-1 KHƠ HẠN Khơ hạn yếu tố quan trọng bậc ảnh hưởng đến an toàn lương thực giới, điều xảy qúa khứ Tài nguyên nước phục vụ cho nông nghiệp vô tận, bên cạnh áp lực dân số kèm theo phát triển đô thị, kiện làm gia tăng nhu cầu nước phục vụ dân sinh cho phát triển cơng nghiệp Do đó, khan nước phục vụ nông nghiệp vấn đề dự báo cấp thiết qui mơ tồn cầu Hiện nay, nước phục vụ nông nghiệp chiếm 70% nguồn nước phục vụ dân sinh toàn giới Muốn sản xuất kg thóc, người ta phải cần 5000 lít nước Nhiều quốc gia Ai Cập, Nhật Bản, Úc cố gắng cải tiến nhằm nâng cao hiệu qủa sử dụng nước, giảm xuống 1,3 m3 / kg thóc Ở Trung Quốc, nhà chọn giống thử nghiệm mơ hình lúa canh tác đất thống khí, với thuật ngữ "aerobic rice", khơng phải lúa ngập nước truyền thống Bộ rễ lúa phát triển trồng cạn, với chế độ tưới cải tiến, nhằm tiết kiệm nước tối đa Hạn hán xem hậu qủa nghiêm trọng suy giảm nguồn nước Do vậy, người ta qui định ngày 22 tháng hàng năm Ngày NướcThế Giới Hiện nay, mức đảm bảo nước trung bình cho người năm giảm từ 12.800 m3 / người vào năm 1990 xuống 10.900 m3 / người vào năm 2000 có khả khoảng 8.500 m3 / người vào năm 2020 Theo Hội Nước QuốcTế (IWRA), tiêu chuẩn công nhận quốc gia có mức bảo đảm nước cho người < 4000 m3 / năm, xem thiếu nước, < 2000 m3 / năm, thuộc loại nước Kết qủa đánh giá chương trình KC12 Việt Nam cho thấy: tổng lượng nước cần dùng năm nước ta chiếm 8,8% tổng lượng dòng chảy, năm 1999, tăng lên 12,5% năm 2000, dự báo tăng 16,5% vào năm 2010 Tổng lượng nước phục vụ tưới nông nghiệp Việt Nam: 41 km3 năm 1985, tăng lên 46,9 km3 năm 1999, 60 km3 năm 2000 Lượng nước cần dùng cho mùa khô tăng lên 90 km3 vào năm 2010, chiếm 54% tổng lượng nước cung cấp Xét qui mơ tồn cầu, nhiệt độ trái đất nóng lên có khả làm 1/3 nguồn nước sử dụng giới 20 năm tới, dự báo Liên Hợp Quốc Khủng hoảng thiếu nước giới nhận định không nước qúa so với nhu cầu mà cịn quản lý nguồn nước qúa Hàng năm có 2,2 triệu người chết bệnh liên quan đến nguồn nước ô nhiễm điều kiện vệ sinh kém, với 12.000 km3 nước bị ô nhiễm nghiêm trọng Do đó, từ năm 2000 trở đi, dự án quốc tế nông nghiệp thuộc hệ thống CGIAR nhấn mạnh đến giống trồng chống chịu khô hạn, nước cho nông thôn, đô thị, xem nội dung ưu tiên đặc biệt Các trung tâm nghiên cứu giới FAO phân công phụ trách trồng liên quan đến chống chịu khơ hạn là: • • • • • • IITA phụ trách nghiên cứu đậu cowpea Sahel, đậu tương ngô Dry Savana ICRISAT phụ trách nghiên cứu cao lương, kê, đậu chickpea, đậu phụng đậu pigeon pea Ấn Độ Sahel CIAT phụ trách nghiên cứu loại đậu Mexico, Trung Mỹ Đông bắc Brazil IRRI phụ trách nghiên cứu lúa Bangladesh, Đông Ấn Độ, Thái Lan Indonesia CIP phụ trách nghiên cứu khoai tây Trung Quốc Ấn Độ, Nam Phi, Kazakhstan, Afghanistan CIMMYT phụ trách nghiên cứu lúa mì Trung Á, Tây Á, Bắc Phi, ngơ vùng cận Sahara 1-2 ĐẤT MẶN Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 đất trồng tồn giới Nó thường kèm theo tượng đất kiềm ngập nước (Gale 2002) Trong đó, 60 triệu đất mặn thủy cấp đưa mặn lên đất mặt, người ta thường dùng thuật ngữ "inland salinity" Hiện tượng thiếu nước tưới, làm đất trở nên mặn hóa Châu Á, Châu Phi Nam Mỹ Các trung tâm nghiên cứu giới FAO phân công phụ trách trồng liên quan đến chống chịu mặn là: • • IRRI phụ trách nghiên cứu lúa vùng ven biển Bangladesh, Orissa, Việt Nam, Philippines, vùng mặn đất liển châu thổ sông Hằng (Ấn Độ) vùng Đông bắc Thái Lan ICARDA phụ trách nghiên cứu lúa Trung Á 1-3 ĐẤT ACID & ĐẤT BẠC MÀU Đất acid chiếm 40% diện tích đất trồng trọt tồn giới, với pH < 5, yếu tố hạn chế chủ yếu cho trồng hàm lượng cao nhôm manganese Vấn đề đặc biệt quan trọng Nam Mỹ (380 triệu ha), bao gồm khu vực châu thổ sông Amazone Yếu tố hạn chế hàm lượng sắt cao, gây độc cho ghi nhận Tây Phi Đất phèn Việt Nam Thái Lan thuộc nhóm khác, đặc biệt, độc chất thuộc hợp chất sulfate sắt, nhôm, cộng thêm tượng thiếu lân, pH thấp, giàu hữu Các trung tâm nghiên cứu giới FAO phân công phụ trách trồng liên quan đến chống chịu đất acid bạc màu là: • • IITA phụ trách nghiên cứu đậu cowpea, đậu tương vùng rừng ẩm ướt CIAT phụ trách nghiên cứu loại đậu Châu Phi, Châu Phi La Tinh • • IRRI phụ trách nghiên cứu lúa Bangladesh, Indonesia, Philippines CIMMYT phụ trách nghiên cứu ngô Châu Mỹ La Tinh, Đông Nam Á Châu Phi, phụ trách nghiên cứu lúa mì CWANA 1-4 NHIỆT ĐỘ LẠNH & NHIỆT ĐỘ NÓNG Nhiệt độ qúa nóng qúa lạnh làm hạn chế tiềm phát triển trồng Hiện nay, 70% vùng đất trồng khoai tây giới có khả bị rủi ro nhiệt độ lạnh Cây lúa trồng Hàn Quốc, Nepal thường bị thiệt hại lạnh Các trung tâm nghiên cứu giới FAO phân công phụ trách trồng liên quan đến chống chịu nhiệt độ bất thuận là: • • • CIP phụ trách nghiên cứu khoai tây chịu lạnh Andes, chịu nóng Nam Á ICARDA phụ trách nghiên cứu lúa mạch, đậu chickpea, gai chịu lạnh IITA phụ trách nghiên cứu đậu cowpea chịu nóng Sahel 1-5 BẢN ĐỒ GEN & SỰ PHÁT TRIỂN MARKER PHỤC VỤ PHÂN TÍCH DI TRUYỀN Bản đồ gen yêu cầu trước hết cho phân tích di truyền tính trạng chống chịu thiệt hại sinh học, đồng thời tiêu chuẩn chọn giống trồng đại Nhóm Tư Vấn Nghiên Cứu Nơng Nghiệp Quốc Tế (CGIAR) FAO đạo Viện, Trung Tâm trực thuộc, hoàn thành đồ mức độ phân tử loại trồng Trong đó, có cơng trình mang tính chất hợp tác quốc tế rộng như: đồ gen lúa, lúa mì, khoai tây sử dụng phổ biến Những đồ trồng có mức độ phổ biến thấp xem xét, phân công CGIAR, chúng có tính chất quốc tế hóa thấp Chỉ cịn vài lồi chưa xây dựng đồ Bản đồ di truyền (genetic map) hiểu đồ liên kết (linkage map) marker gen mục tiêu Bên cạnh đó, người ta thực hợp phần quan trọng để xây dựng đồ vật lý (physical map) gen Kỹ thuật xây dựng đồ tính trạng số lượng (QTL) thường có thơng tin kiểm sốt gen, dựa giả định có tính chất tốn học Nhưng vơ quan trọng, tính trạng chống chịu với "stress" yêu cầu "QTL mapping" Người ta cần phải quét từ đầu đến cuối genome với marker bao phủ toàn nhiễm sắc thể, với mật độ trung bình 10cM marker Thơng qua đó, người ta xác định khu vực giả định có chứa gen điều khiển tính trạng số lượng mà ta nghiên cứu Người ta phải dựa sở biến động tính trạng kết hợp với thay đổi marker tương ứng Mật độ marker dày đặc, tốt cho giả định, với mức độ xác cao, quần thể lai sử dụng để phân tích di truyền Những vị trí xác định vơ cần thiết cho chương trình chọn giống nhờ marker (MAS = marker-aided selection) tính trạng chống chịu, cần thiết cho kỹ thuật cloning sở đồ di truyền (map-based cloning) gen thuộc QTL Những marker ứng dụng chọn giống trồng phải liên kết chặt với gen mục tiêu, sở đồ di truyền phân tử Hiện nay, marker có hiệu qủa đáng tin cậy "microsatellite" viết tắt SSR Người ta chuẩn bị đưa vào sử dụng rộng rãi marker SNP vài năm tới (chữ SNP viết tắt từ thuật ngữ "single nucleotide polymorphisms" = đa hình nucleotide đơn) Đối với lúa, thuận lợi lớn ứng dụng marker đồ genome giải mã, marker khơng cịn vấn đề Theo cơng trình Goff 30 tác giả khác năm 2002, chuỗi ký tự SSR SNP thiết kế ước khoảng 40.000 marker, kể phân tử đoạn, hay xen đoạn Đây chuỗi mã đồng mức độ 1%, mật độ 24 / gen (Gale 2002) 1-6 CƠ CHẾ SINH LÝ HỌC VÀ DI TRUYỀN HỌC ĐỐI VỚI HIỆN TƯỢNG CHỐNG CHỊU STRESS Cơ chế sinh lý giải thích tượng đáp ứng trồng stress, nhằm mục đích cải tiến cấu trúc, hoạt động sinh lý, sinh hóa cây, giúp khỏi, né tránh, chống chịu thiệt hại stress gây Có hai phương pháp liên quan đến cải tiến giống trồng chống chịu stress: (1) Phương pháp dựa kinh nghiệm (empirical approach) việc khai thác biến dị di truyền, kết hợp với nguồn vật liệu cung cấp gen chống chịu tốt giống trồng, loài hoang dại Nguồn vật liệu lý tưởng tính trạng chống chịu phân lập xem xét gen điều khiển tính chống chịu thơng qua phân tích QTL quần thể dòng lai phân ly, hai kiểu hình chống chịu cao chống chịu thấp Mặc dù chế sinh lý xem chế ưu tiên nghiên cứu, di truyền tính trạng chống chịu đến giống trồng tiến trình vơ cần thiết, với yêu cầu chọn lọc khắt khe tích lũy alen có lợi (2) Phương pháp lai tạo giống có kiểu hình lý tưởng (ideotype breeding approach), đặc điểm hình thái học sinh lý học phải có khả tham gia vào mục tiêu cải tiến giống điều kiện bị stress Gen mục tiêu từ giống trồng từ loài hoang dại quan tâm khai thác, để chuyển vào giống trồng Khi thực hai phương pháp này, người ta cò phải sử dụng kỹ thuật lai, kỹ thuật chồng gen kháng nhờ marker phân tử, nhằm xác định alen có lợi Trường hợp stress khô hạn, mặn lạnh, tượng có chức sinh lý thực vật liên quan với nhau, sở điều tiết áp suất thẩm thấu tế bào Nhiều chiến lược nghiên cứu nhằm cải tiến tính chống chịu mang tính chất đa ứng dụng Chúng bao gồm tượng điều tiết áp suất thẩm thấu rễ, lá, nhằm trì nước, loại bỏ yếu tố rào cản có tính chất kỵ nước (hydrophobic barriers) rễ lá, cải tiến thông thương mạch dẫn, nhằm thúc đẩy di chuyển nước Những chế tránh né (avoidance), (escape), chống chịu (tolerance) có nét giống khơ hạn, mặn lạnh Thí dụ cải tiến tính trạng rút ngắn thời gian từ gieo đến trỗ, tính trạng rễ phát triển mọc sâu đất, tính trạng nhạy cảm phản ứng co nguyên sinh tế bào gặp stress Di truyền tính chống chịu stress khơng phải sinh học thường kiểm soát đa gen phức tạp, gen kiểm sốt tính chống chịu trùng lắp stress khác Trong genome lúa mì lúa mạch, người ta nhận thấy ảnh hưởng di truyền kiểm soát đáp ứng khô hạn, mặn lạnh nằm đồ di truyền nhiễm sắc thể tương đương Có 10 QTL tìm thấy tính trạng chống chịu chúng nằm chồng lên số vùng nhiễm sắc thể Trường hợp sử dụng "phương pháp dựa kinh nghiệm" tính trạng chống chịu độ độc nhôm, người ta ghi nhận kỹ thuật lọc nhôm thường cải tiến phát triển rễ chồi mơi trường dinh dưỡng Yoshida có chứa Al, điều kiện pH thấp, tượng di truyền phức tạp Những gen kiểm sốt tính trạng chống chịu thường tập trung locus có giá trị đóng góp vào tần suất biến dị di truyền cao Những kết qủa xác định hướng ưu tiên MAS (chọn giống nhờ marker phân tử), với cô lập gen có tính chất định (key gene) thơng qua hai biện pháp hỗ trợ, "kỹ thuật cloning" "sản xuất dòng đẳng gen" (Gale 2002) Sự cô lập gen (gene isolation) kiến thức chuỗi mã gen xem bước phát triển có tính chất định làm rõ thêm chế di truyền tính chống chịu Khơng phải tất tính trạng chống chịu stress đa gen điều khiển Một vài tính trạng chống chịu với stress thể điều khiển gen chủ lực Thí dụ tính trạng chống chịu ngập lúa vùng Đơng Nam Á, nơi có diện tích canh tác bị ảnh hưởng lũ lụt 25 triệu ha, lũ đến bất ngờ làm lúa bị ngập hoàn toàn (7 đến 10 ngày), gen điều khiển Sub1 định vị locus giúp cho lúa chống chịu ngập phục hồi bình thường Khả lồi hoang dại có quan hệ gần với trồng đánh giá cao, chiến lược du nhập gen mục tiêu từ loài hoang dại vào loài trồng, nhằm gia tăng tính chống chịu cách có hiệu qủa Gen chống chịu mặn ghi nhận từ loài hoang dại Porteresia coarctata Ấn Độ, Sri Lanka chuyển vào lúa trồng Gen chống chịu mặn Thinopyrum bessabaricum giúp phát triển điều kiện mặn 250 mM NaCl, sử dụng chương trình cải tiến lúa mì Đối với tính trạng chống chịu độ độ nhơm, lồi cỏ lơng tây, Brachiaria decumbens, thuộc vùng nhiệt đới, xem nguồn vật liệu chương trình cải tiến giống lúa mì ơn đới, giống ngô ôn đới (Gale 2002) Chiến lược cải tiến giống có tên "crop replacement" 1-7 TIẾN ĐỘ CẢI TIẾN GIỐNG CHỐNG CHỊU (chậm khả thi) Hiện nay, tiến độ cải tiến giống chống chịu stress chậm chưa có hợp tác nghiên cứu cách hiệu qủa nhà sinh lý thực vật, sinh hóa nhà di truyền Một vài tiến ghi nhận cải tiến giống chống chịu (tolerance) tránh né (avoidance) khô hạn, mặn, độ độc nhôm Những hiểu biết chế chống chịu cho đối tượng qúa hạn chế Những giống trồng quan thuộc hệ thống CGIAR quan tâm đầu tư nghiên cứu phát triển: • • • • Giống ngô nhiệt đới chống chịu đất acid: Corpoica H-108, H-111 phát triển Colombia, giống Pool 25 Brazil, giống ZM421, 521 621 vừa cơng nhận cho phát triển Nam Phi, cịn chống chịu tượng đất nghèo N khơ hạn vụ trồng Các giống CYMMIT lai tạo hợp tác với địa phương nói Giống lúa chống chịu mặn PSBRc 84, 86 88 phát triển Bangladesh, PSBRc 88 có phẩm chất gạo tốt Giống lúa IRRI lai tạo hợp tác với quốc gia mạng lưới Giống chuối chống chịu hạn FHIA 01 INIBAP lai tạo chọn lọc, phát triển Honduras, Tanzania 50 quốc gia khác Giống khoai tây chống chịu nóng Unica phát triển Peru CIP lai tạo chọn lọc Tiến độ cải tiến giống trồng phục vụ mục tiêu chống chịu gặp trở ngại tính trạng suất cao tính trạng chống chịu có khả tương hợp thấp Năng suất cao điều kiện bị stress không tương hợp với suất cao điều kiện bình thường Điều cho thấy cần có chương trình cải tiến giống độc lập nhằm tạo giống có yêu cầu đặc biệt, loại stress riêng biệt Chúng ta chưa hiểu rõ: liệu có đối kháng suất tính chống chịu hay khơng? Gen điều khiển suất cao điều kiện bị stress điều kiện bình thường nhóm Nhưng tương tác kiểu gen mơi trường (GxE) cịn điều chưa hiểu cách đầy đủ Với phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt kỹ thuật di truyền, người ta ưu tiên nghiên cứu giông chống chịu khô hạn chống chịu mặn, với qui mô hợp tác quốc tế tích cực 1-8 KỸTHUẬT THANH LỌC CĨ TÍNH KHẢ THI VỚI QUI MƠ LỚN Việc đánh giá kiểu hình (phenotyping) dịng lai stress địi hỏi khơng ngừng hồn thiện kỹ thuật lọc rẻ tiền, xác, dễ ứng dụng thực với số lượng lớn lai Thanh lọc đồng ruộng thường gặp vấn đề phát sinh yếu tố môi trường mà chưa kiểm sốt được, chúng ảnh hưởng làm sai lệch kết qủa lọc Muốn khắc phục hạn chế này, người ta cố gắng cải tiến phương pháp bố trí thí nghiệm vấn đề stress khác Thanh lọc phịng thí nghiệm nhà lưới với yếu tố tham gia thống nhất, có kiểm sốt, thường bị hạn chế qui mô bé, tốn Hơn chế chống chịu in vitro chế chống chịu ngồi đồng thường khơng thống nhất, thí dụ tính chống chịu mặn, tính chống chịu khơ hạn Trường hợp lọc với độ độc sắt đất phèn, khó kiểm sốt chuyển đổi từ Fe++ sang Fe+++ môi trường dinh dưỡng Trường hợp lọc tính trạng chống chịu ngập hồn tồn, phải kiểm soát độ đục nước cho gần giống điều kiện đồng Trường hợp thí nghiệm tính trạng chống chịu thiếu lân, phương pháp bố trí thí nghiệm phải giải hai vấn đề: (1) chế phát triển điều kiện đất có hàm lượng lân ngưỡng thấp, giống nghiên cứu phát triển tốt điều kiện này, không chống chịu thiếu lân, (2) chế phát triển điều kiện thiếu lân thực Ứng dụng công nghệ sinh học, người ta đề xuất phương pháp đánh giá kiểu gen (genotyping), với trợ giúp marker phân tử để lọc lai có gen chống chịu với stress mục tiêu Marker SSR khuyến cáo hiệu qủa cao, đáng tin cậy, số lượng marker lớn Vấn đề trở ngại lớn tính chống chịu với stress đa gen điều khiển với giả định QTL Vì vậy, cơng việc "fine mapping" phải thực liện liên tục nhằm xác định marker đáng tin cậy cho chiến lược MAS (marker-assisted selection) sở phân tích với quần thể hồi giao cải tiến vật liệu bố mẹ chọn lọc cẩn thận 1-9 GENOME HỌC - NGÀNH HỌC DI TRUYỀN MỚI Từ năm 1998, người ta bắt đầu làm quen với thuật ngữ "Genomics" (genome học) thơng qua chương trình nghiên cứu genome người Trong thực vật, genome Arabidopsis thaliana giải mã vào năm 2000 Genome lúa công bố giải mã năm 2001 hồn thiện năm 2002 nhóm nghiên cứu Bắc Kinh (Trung Quốc) Tsukuba (Nhật Bản) với thông báo đáng ý Syngenta Monsanto Khả genome ngô mục tiêu giải mã, vùng nhiễm thể tập hợp cao gen (gene-rich regions) genome Cơng nghệ bao trùm tồn hoạt động ngành genome học là: (1) đọc chuỗi mã DNA tự động, với khả đọc máy triệu cặp base ngày, với số kênh mao dẫn từ 16, đến 98 kênh, tiếp tục cải tiến với tốc độ phát triển cực nhanh (2) microarray chip sinh học DNA, 10.000 gen "scan" lần xem xét, máy đánh giá kiểu gen tự động có khả xét nghiệm 10.000 điểm chẩn đốn DNA ngày Thực vậy, khả kiểm tra toàn genome marker di truyền, thể gen chip đơn lẽ thực tương lai gần Kỹ thuật chuyển nạp gen đơn giản dễ dàng nhờ tiến công nghệ sinh học, qua đó, việc cải biên di truyền trở nên hiệu qủa mục tiêu cải tiến giống trồng, góc độ cơng nghệ có liên quan đến "genomics" 1-10 HIỆN TƯỢNG SYNTENY & GENOMICS CĨ TÍNH CHẤT SO SÁNH Trong cuối thập kỷ 1990, kiện khoa học quan trọng đáng ghi nhớ khám phá thành phần gen, vị trí thứ tự gen ghi nhận có quan hệ chặt lồi thực vật khác Đó tượng "synteny" Thuật ngữ "synteny" có nguồn gốc từ chữ Hi Lạp, "syn" có nghĩa quan hệ với nhau, "taenia" có nghĩa dãi băng (ribbon) Thuật ngữ dùng di truyền để ám diện hai nhiều hai loci nhiễm sắc thể Người ta sử dụng thuật ngữ lập đồ so sánh (comparative mapping) xác định gen sở "gen phát triển đồng dạng" (homeologybased gene isolation) để minh họa tượng synteny có tự nhiên (McCouch 2001) Khái niệm "synteny" mở rộng khái niệm đồng dạng nhiễm sắc thể tương đồng Nghiên cứu họ Solanacea, Bonierbale ctv (1998) chứng minh cDNA markers 12 nhiễm sắc thể cà chua khoai tây có tính chất đồng tuyến (collinear), chúng khác đảo đoạn khơng vị trí trung tâm, đó, ớt có xếp tương đồng to lớn hai genome Trong họ Graminae, người ta nhận thấy chúng có mức độ phát triển đánh giá cao tượng synteny, thểø rõ ràng loài họ Hầu hết gen họ có chức biết hay chưa biết có mật mã protein tương ứng với gen chuỗi mã lúa Bản đồ genome loài thuộc họ Graminae bao gồm mễ cốc nối với thành trục đường thẳng gen mục tiêu định vị genome (với độ lớn khác nhau, theo vòng tròn đồng tâm) (hình I-1) Nếu gen lồi biết chức năng, người ta dự đốn tất lồi cịn lại Theo hình I-1, lúa có genome nhỏ nhất, thể vịng trịn trung tâm Hình I-1: Định vị gen có quan hệ loài khác bao gồm lúa (rice), kê đuôi chồn (foxtail millet), cao lương (sorghum), kê hạt ngọc (pearl millet), ngơ (maize), nhóm lúa mì (Triticeae) theo nghiên cứu Gale Devos (2002) Gen waxy :amylose thấp, làm tinh bột dẽo, dính, photoperiod sensitivity: cảm quang, liguleless : khơng có tai lá, shattering: dễ rụng hạt, d4-dwarfing: gen lùn d4, Ga-ins dwarfing: gen lùn không mẫn cảm với gibberellin (CT)8 (TC)2 Lúa (GA)20 Gen (TG)8 Lúa mạch 10kb (GGC 4a 4b (GT)1 Hình I-2.: Thành phần gen vị trí thứ tự gen bảo tồn hai lúa lúa mạch Một gen nhân thành đôi hai genome Gen lúa mạch với kích thước genome lớn lúa nước, định vị rãi rác với đoạn phân tử lập lại lớn (Dubcovsky ctv 2001) Chức gen điều khiển tính trạng dự đốn tất thuộc nhóm mễ cốc Sự tương đồng genome qui kết gen lại với giới hạn biết Hình I-2 cho thấy vùng có tính chất liên gen (intergenic) khác hai lồi có quan hệ gần nhau, khác kích thước genome Chính nhờ tượng synteny, việc ứng dụng cơng cụ genomics trở nên thuận tiện hơn, từ kết qủa phân tích genome lúa, người ta ứng dụng trực tiếp phân tích di truyền genome lúa mì, lúa mạch, kê, cao lương, ngô Bản đồ so sánh hệ công bố lúa tất genome giống (Gale 2002) Một sưu tập phân tử "probe" đóng vai trị neo có số cDNA thấp (anchor probes) sử dụng để làm đồ có tính chất so sánh loài khác (# loài) họ Hồ Bản Các vùng có gen xếp theo thứ tự bảo tồn có tính chất vị trí tương ứng với kiểu hình thể bên ngồi tư liệu hóa cách hệ thống, thơng qua đóng góp phân tử "mutant" QTL Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ thí dụ marker liên kết khơng thấy đồ vị trí dự đốn hai đường thẳng xác định vùng mục tiêu, đặt cho nhiều câu hỏi chưa giải thích Kilian ctv (1997) lần cố gắng "clone" gen loài trồng sở thơng tin chuỗi mã thơng tin có tính chất vị trí (positional) (thuật ngữ chun mơn gọi "microsynteny"), người ta sử dụng thuật ngữ "vùng đồng dạng" (homeologue region) genus khác với genus nghiên cứu Cho dù đoạn tương ứng nhiễm thể lúa mạch (Hordeum vulgare) lúa (Oryza sativa) thể rõ nét tính chất đồng dạng vùng mà gen kháng bệnh rỉ sắt lúa mạch Rpg1 định vị, gen mục tiêu khơng tìm thấy vùng dự đoán genome lúa (McCouch 1997) Chưong minh họa tượng synteny nghiên cứu giống lúa chống chịu độ độc nhôm 1-11 ỨNG DỤNG GENOMICS TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG CHỐNG CHỊU VỚI STRESS 1-11-1 Thư viện DNA (DNA library) Nhằm đáp ứng mục tiêu ứng dụng genomics cải tiến giống trồng chống chịu với stress sinh học, người ta quan tâm đến khả khai thác tượng “synteny” genomics có tính chất so sánh, nội dung đề giải pháp sở thiết kế chương trình lai tạo với database phong phú (modelling) giống chương trình lúa dạng hình có suất vượt trần, chế chống chịu chưa hiểu rõ ràng Như vậy, người ta cần có sở vật chất genome cách đầy đủ Đó thư viện DNA clone Yêu cầu tối thiểu phải có (1) đồ liên kết gen mức độ phân tử nhiễm sắc thể, (2) thư viện DNA đủ lớn, (3) hệ thống chuyển nạp có khả mang số lượng lớn gen mục tiêu chuyển vào cải biên di truyền Bản đồ phải đáp ứng điều kiện phủ kín nhiễm thể với 2-3 cM hai marker kế cận, số lượng lớn loci mang tính chất “neo” (anchor) Bản đồ RFLP, EST, SSR, SNP cung cấp cho so sánh kết qủa áp dụng để lựa chọn Thư viện DNA cho hiệu qủa tốt gấp đơi thư viện BAC với kích thước DNA gắn vào vectơ lớn 100 kb (Gale 2002) Người ta cịn dự tính khai thác sưu tập EST (những chuỗi ký tự gen chuyển mã), đồ so sánh, quần thể có tên gọi chun mơn “knockout populations” Những EST thường sưu tập từ mô thực vật bị stress, chưa bị stress Đối với đồ có tính chất so sánh, người ta xếp nhiễm sắc thể có tính chất đồng dạng theo “model” chuyên biệt Đối với quần thể “knockout”, người ta tạo thông qua thư viện DNA đột biến, hay thư viện DNA bị đoạn, gen trở nên khơng bình thường cách ngẫu nhiên Hiện nay, người ta nghiên cứu T- DNA đánh dấu, hay transposon đánh dấu (Bửu 2002), kết qủa minh họa trường hợp lúa Arabidopsis thaliana Lĩnh vực genomics lúa, lúa mì ngơ phong phú Bên cạnh đó, CGIAR khuyến khích phát triển nghiên cứu genome kê, cao lương, đậu đỗ, khoai mì 1-11-2 Kỹ thuật cloning gen Có nhiều cách để clone gen mục tiêu, nhiên, phải nhớ hoạt động xác định vị trí đồ gen mục tiêu điều khiển tính chống chịu stress, chưa ghi nhận chức cụ thể nó, tiến trình phân lập gen ứng cử viên gặp trở ngại, thể gen điều kiện định không hiểu rõ (nhất tương tác tính trạng chống chịu với môi trường) Chiến lược nghiên cứu “map-based cloning” đề xuất Người ta xếp hạng trồng theo quan hệ huyết thống xác định đồ có tính chất “kiểu mẫu” (model maps) chứa đựng gen ứng cử viên định vị khu vực dự đốn, sở phân tích QTL Với tần suất khoảng 30 gen đơn vị đồ lúa, người ta định vị cách chi tiết QTL, mà sàng lọc làm cho QTL xem xét gen chủ lực di truyền Mendel Do đó, có thuật ngữ dùng để diễn tả kiện gọi “Mendelisation”, quần thể phân ly lớn Những “BAC contig” chồng lấp tạo series clone Thông qua đồ vật lý thơng qua chuỗi ký tự có tính chất “model”, series clone mong muốn tạo Một kỹ thuật “map-based cloning” phát triển gần đây, kỹ thuật “deletion tilling” Kỹ thuật bao gồm: (1) tạo số lượng phân tử bị đoạn, có gen mục tiêu, (2) sử dụng đoạn phân tử chồng lấp tối thiểu để xác định gen ứng cử viên mơ (trường hợp genome lúa mì) Phương pháp có thuận lợi khơng cần biến dị gen mục tiêu vùng kế cận Hiện CGIAR ý đến việc ứng dụng kỹ thuật “tilling” 1-11-3 Microarray Những gen ứng cử viên thể kỹ thuật phân tích microarray Những gen nhạy cảm với stress, thể gen xảy bị stress, trở nên lý tưởng cho nghiên cứu microarray Thí nghiệm có tính chất điển hình array EST với RNA ly trích mơ bị tổn thương stress, mô không bị stress, thiết kế để tìm hiểu hiệu qủa phân tích microarray Người ta dự đốn có khoảng 25.000 gen genome Arabidopsis 50.000 gen genome lúa phát đầy đủ tương lai gần (Gale 2002) Microarray hình thành từ sưu tập EST từ thư viện cDNA, cDNA sưu tập mô bị stress (do khô hạn, mặn, thiếu lân, độ độc nhơm, v.v ) Thí dụ lúa, 10% gen điều tiết “up” “down” vòng sau chúng bị xử lý môi trường mặn (Kawasaki ctv 2001) Người ta phát triển công nghệ tạo "microarray" hay "gene chips" nghiên cứu genome chức Những chips sinh học hữu dụng tương lai gần để tìm gen mục tiêu có tính chất ứng cử viên (candidate genes) tính trạng mong muốn Đây bước đột phá có tính chất lịch sử qúa trình phát triển ngành di truyền phân tử lồi người Nhiều dịng đột biến đoạn, dịng du nhập gen cho suất cao, trồng nơi thiếu nước Nhiều dịng thể tính chống chịu hạn mặn tốt Những nghiên cứu chức cho phép hiểu rõ hơn: làm lúa thích ứng với stress, tìm gen hữu ích cho công tác lai tạo giống lúa Theo Tiến sĩ Leung, có 100 gen giúp lúa kiểm sốt tính kháng bệnh hại tìm thấy để tạo giống lúa kháng bệnh tốt Kỹ thuật "microarray" bao gồm tập trung khoảng 20.000 gen "slide" Người ta cịn gọi "chip" đóng vai trị "sensor" để tìm thông tin di truyền cần thiết Phương pháp cho phép lai lúc với nhiều "probe" "Probe" chuỗi ký tự cDNA, có nguồn gốc từ gen chống chịu với mức độ stress khác Phân tử mRNA tính trạng chống chịu stress chuyển mã ngược thành cDNA Phân tử cDNA dùng để lai với "microarray", sau người ta xác định "clone" dương tính Thơng qua nhiều giai đoạn phát triển, sau qúa trình bình thường hóa, người ta phải đảm bảo chuỗi ký tự đồng nhất, sẵn sàng xác định slide màng Chip sinh học đóng mở điều kiện bình thường bị stress Phương pháp không xác định gen ứng cử viên mà cịn tìm hiểu qúa trình thể gen điều kiện bị stress 1-11-4 Quần thể “knockout” Người ta thực nhiều quần thể khác đánh dấu transposon T-DNA để phục vụ cho nghiên cứu genome lúa Arabidopsis Những quần thể gọi với thuật ngữ “gene machines” Những máy gen với hình thức di truyền bị đảo ngược giúp xác định gen cần cho mục tiêu nghiên cứu, sở gen bị đột biến xen đoạn, gen nhảy Những dòng quần thể “knockout” co thể nghiên cứu theo kiểu hình có quan hệ với chức gen mục tiêu Gần đây, người ta phát triển phương pháp mới, TILLING, thuật ngữ viết tắt từ chữ “targeted induced local lesions in genomes” Phương pháp TILLING giúp tạo “knockout” mục tiêu từ sáng tạo series có tính chất alen với gen cần nghiên cứu Những quần thể TILLING thành lập để phục vụ cho nghiên cứu genome lúa Arabidopsis Quần thể đột biến hóa chất hay phóng xạ trồng trở thành yêu cầu cần thiết nghiên cứu di truyền tương lai Những dịng chống chịu với stress khơ hạn, mặn, nhiệt độ lạnh, ngập úng xác định Thử thách trước mắt nhà khoa học liên kết kiểu hình với gen đoạn, chuỗi mã di truyền gen ứng cử viên xem mốc khởi động tốt 1-11-5 Chuyển nạp gen Kỹ thuật chuyển nạp gen trở nên thông dụng cho hầu hết lồi trồng, hiệu qủa cịn vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu cải tiến Đặc biệt mầm, hiệu qủa chuyển nạp gen đạt khó so với hai mầm Những cố gắng công việc kiến trúc alen gen mục tiêu gắn với promoter có chức kiến tạo, thí dụ CaMV35S qúa trình chuyển nạp gen Những xét nghiệm “transgenic” nội dung bao gồm kiến trúc dây “antisense”, cho thông tin thể mong muốn Những xét nghiệm sau xem xét khả alen đặc biệt gen kiến trúc tương thích với promoter thể chức hoạt động mơ, thí dụ mô rễ, mô hạt giai đoạn phát triển cực trọng đó, nhằm đạt yêu cầu chống chịu stress theo mục tiêu đề từ ban đầu Thiết kế theo mơ hình mẫu Genome Arabidopsis thaliana xem mơ hình làm mẫu (model species) nghiên cứu sinh học phân tử tính chống chịu stress khơng phải sinh học Tính trạng chống chịu lạnh điều khiển CBF1, “regulator” genome Arabidopsis Sự thể gen CBF1 làm kích hoạt mức độ hoạt động hàng loạt gen điều khiển tính chống chịu lạnh, bảo vệ chống lại thiệt hại giá lạnh Một yếu tố có tính chất giải mã khác DREB1A điều tiết thể hàng loạt gen chống chịu với stress có genome Arabidopsis Sự thể DREB1A làm kích hoạt gen chống chịu khô hạn, gen chống chịu mặn chống chịu lạnh Khi DREB1A khởi động CaMV35S, phát triển bình thường điều kiện khơng có stress bị đình trệ cách nghiêm trọng (Gale 2002), đặt mơi trường có stress, tính trạng chống chịu cải tiến tốt Thu thập qũy gen - kỹ thuật “allele mining” di truyền phối hợp Việc thu thập ngân hàng gen, đa dạng nguồn vật liệu có gen điều khiển tính chống chịu với stress chiến lược lâu dài để cải tiến trồng Người ta ý phương pháp có tên gọi khai thác mỏ alen (allele mining) Phương pháp bao gồm qúa trình thực PCR đọc chuỗi ký tự DNA (sequencing) hàng loạt gen tìm thấy giống trồng địa, loài hoang dại có quan hệ huyết thống gần gủi Biến dị chuỗi mã cho kết qủa tương ứng với tính chống chịu stress mẫu giống, qua đó, xác nhận alen tốt cho thí nghiệm chuyển nạp gen sau Người ta cố gắng tiếp cận phương pháp gọi “di truyền phối hợp” (association genetics) Đó thuật ngữ phát triển từ nội dung thu thập qũy gen mà CGIAR đề nghị nhà khoa học nên khai thác Lĩnh vực khoa học này, sở thành tựu di truyền học người với mức độ phân tích cao quần thể phân ly vơ to lớn, không cho phép thực nội dung Người ta nghĩ đến gen phối hợp với tính trạng đó, gen xác định thông qua tương quan kiểu hình với alen chuyên biệt mức độ marker phân tử liên kết chặt chẽ với gen Trong thực vật, thể tổng quát mẫu giống sưu tập ngân hàng gen tượng biến dị loci marker, phân bố rải rác genome (đánh giá kiểu gen) Người ta phát triển nội dung cách tìm mối tương quan kiểu gen điều kiện stress với tượng không cân alen genome (allele dis-equilibrium) Đây ngành khoa học trẻ lĩnh vực sinh học thực vật, có tiềm lớn để khám phá gen Ngành học sinh học phân tử thực vật bắt đầu phát huy tác dụng lĩnh vực chọn tạo giống trồng chống chịu với thiệt hại khơng phải sinh học Genome học có tính chất so sánh ví dụ, có triển vọng để phát triển nhanh (Gale 2002) Mục tiêu Nhóm Tư Vấn Nghiên Cứu Nông Nghiệp Quốc Tế (CGIAR) phải đạt tạo giống trồng phát triển rộng khắp đất có khả trồng trọt, suất cao đất có vấn đề, vùng khí hậu bất thuận, đảm bảo yêu cầu an toàn lương thực, đặc biệt cho người nghèo tồn giới Trong chương trình cải tiến giống trồng, người ta phấn đấu áp dụng thành tựu khoa học, với công cụ tốt để giải vấn đề khác nhau, là: • • • • Gen gen cải tiến trường hợp tính chống chịu với stress sinh học Công cụ cải tiến giống có hiệu qủa cao đưa gen vào giống trồng mới, thí dụ phương tiện lọc giống tốt hơn, marker phân tử liên kết với tính trạng mục tiêu chặt chẽ hơn, qui trình chuyển nạp gen hiệu qủa Chiến lược cải tiến giống trồng tính chống chịu phải thể chương trình trọng điểm quốc gia Kiến thức sinh lý thực vật, sinh hóa chế chống chịu stress phải cải tiến khơng ngừng 1-12 PHÂN TÍCH QTL Phần lớn tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi mơi trường tính trạng di truyền số lượng Do đó, phân tích loci tính trạng số lượng QTL (quantitative trait locus-số ít, quantitative trait loci-số nhiều) phát triển với nhiều mơ hình nhằm đáp ứng yêu cầu nghiên cứu (Liu 1998) Tính trạng số lượng định nghĩa cách kinh điển tính trạng có phân bố liên tục (continuous distribution), tính trạng điều khiển nhiều gen, gen có ảnh hưởng nhỏ tính trạng mục tiêu Bản đồ QTL bao gồm kiến trúc đồ genome tìm kiếm mối quan hệ tính trạng với marker đa hình, minh chứng QTL định vị kề cận marker Di truyền tính trạng số lượng phức tạp với tính trạng đơn gen di truyền Mendel, cịn chịu tác động mạnh mơi trường Danh sách tài liệu tham khả đồ QTL phong phú, đặc biệt công trình Lander Schork (1994) Lander Zheng (1994) Stuber ctv (1992) Tanksley (1993) Weller (1998) Những tác giả sử dụng phép thử T (t-test), phương trình tuyến tính, phương trình đa tuyến, phương trình phi tuyến tính phép thử cách qng để xây dựng mơ hình Thành tựu bậc phần mềm MAPMARKER/QTL Lander ctv (1987) QTLSTAT Liu Knapp (1992), QGENE Tanksley Nelson (1996) giúp cho việc nghiên cứu phân tích QTL diễn giải cách rõ ràng Bảng 1: Danh mục “computer software” liên quan đến phân tích lập đồ QTL Phần mềm MAPMARKER/QTL QTLSTAT LINKAGE PGRI QTL cartographer MAPQTL Map Manager QT QGENE Nguồn Lander ctv 1987, Lander & Bostein 1989 Knapp ctv 1992 Terwilliger & Ott 1994 Liu 1998 Basten, Weir Zeng 1996 van Ooijen & Maliepard 1996 Manly & Cudmore 1996 Tanksley & Nelson 1996, Nelson 1997 1-12-1 Những mơ hình di truyền số lượng 1-12-1-1 Mơ hình QTL đơn (single-QTL) Một mục tiêu đồ QTL tìm kiếm toàn genome nơi định vị gen mục tiêu thông qua trắc nghiệm giả định marker đơn vị trí định, sau đó, người ta xây dựng model có tính chất “đa QTL” (multiple QTL) Như vậy, ảnh hưởng tính cộng (a) ảnh hưởng tính trội (d) biểu thị bảng mơ hình quần thể phân ly F2, giá trị di truyền quần thể hồi giao, với ảnh hưởng sau: ảnh hưởng chính, ảnh hưởng tương tác chiều, chiều, chiều tương tác “i-way” Cuối ảnh hưởng tổng qt Bảng 2: Mơ hình QTL đơn quần thể hồi giao (backcross) F2, nQQ, nQq, nqq biểu thị kiểu gen QQ, Qq, qq Mơ hình Hồi giao (Qq x QQ) Kiểu gen QQ Qq Ảnh hưởng di truyền Giá trị μ1 μ2 g = 0,5 (μ1 - μ2) Phương sai σ2 σ2 σ (1 / nQQ + /nQq)/4 F2 (Qq x Qq) QQ Qq qq Ảnh hưởng tính cộng Ảnh hưởng tính trội μ1 μ2 μ3 a = 0,5 (μ1 - μ3) d = 0,5 (2μ2 -μ1 - μ3) σ2 σ2 σ2 σ (1 / nQQ + /nqq)/ σ2(1 / nQQ + 4nQq + 1/nqq)/ 1-12-1-2 Mô hình “multiple-locus” Mơ hình di truyền tính trạng số lượng định nghĩa theo số gen, ảnh hưởng gen, tần suất gen, tương tác gen, tương tác gen x mơi trường Giả định có n gen điều khiển tính trạng số lượng Hãy xem xét quần thể F2, ảnh hưởng di truyền xảy ra: ảnh hưởng chính, ảnh hưởng tương tác chiều, chiều, chiều tương tác “i-way” Cuối ảnh hưởng tổng quát Bảng 3: Các hệ số thuộc biến số dummy ảnh hưởng gen Kiểu gen QTL AA Aa Aa Tần suất f1 f2 f3 C1 -1 C2 1/2 -1/2 1/2 Ảnh hưởng a + d/2 - d/2 -a + d/2 1-12-2 Phương pháp phân tích marker đơn (SMA = single marker analysis) Ứng dụng nguyên tắc phân tích liên kết gen, xác định cách thức tính chất di truyền marker vị trí mà diện genome • • • Gen điều khiển tính trạng số lượng lập đồ giống đồ di truyền marker Khi marker phủ đoạn lớn genome, tạo khả tốt để tìm gen điều khiển tính trạng số lượng Nếu gen marker đồng phân ly quần thể di truyền, tương quan liên kết chúng phát Phương pháp phân tích marker đơn bước khởi đầu, khơng đồ QTL, mà cịn phân tích cụ thể số liệu Những khám phá mơ hình hàm tuyến tính Yj = μ + f(markerj) + εj Trong Yj giá trị tính trạng cá thể thứ jth, μ giá trị trung bình quần thể, f(markerj) hàm số kiểu gen marker, εj sai số Thí dụ gen Q định vị gần marker A tính trạng mục tiêu điều khiển gen Q mô thông qua marker A Yj = μ + f (A) + εj Bài toán giải đáp “xác suất tin cậy được” f (A) có chứa giá trị di truyền kiểu gen Q giá trị liên kết A Q Phương pháp SMA thực dạng • • • • phép thử t đơn giản phân tích phương sai phương trình tuyến tính phép thử tỉ lệ mơ ước đốn mơ tối đa Phương pháp SMA đơn giản phân tích số liệu thực bước tính tốn, người ta sử dụng phần mềm SAS để thiết lập mơ hình 1-12-2-1 SMA quần thể hồi giao Bố mẹ Hồi giao (BC) AAQQ x aaqq aaqq x AaQq x AAQQ Tần suất hi vọng Con lai BC AaQq Aaqq aaQq aaqq AAQQ AAQq AaQQ AaQq 0,5 (1 – r) 0,5 r 0,5 r 0,5 (1 – r) Giá trị r tần suất tái tổ hợp A Q Hình 1-3: Con lai hồi giao SMA 1-12-2-2 Kết hợp tượng phân ly QTL marker Bảng 4: Tần suất kiểu gen QTL hi vọng định vị kế cận marker quần thể hồi giao, khơng có tượng quấn chéo (Liu 1998) Kiểu gen marker Giá trị quan sát Tần suất biên AA Aa n1 n2 0,5 0,5 AA Aa n1 n2 0,5 0,5 Kiểu gen QTL QQ Qq Tần suất kết hợp 0,5 (1-r) 0,5 r 0,5 r 0,5 (1-r) Điều kiện kết hợp 1-r r r 1-r 1-12-2-3 Phép thử t đơn giản quần thể hồi giao Giá trị lý thuyết (1-r)μ1 + μ2 rμ1 + (1-r)μ2 Bảng 5: Phân tích phương sai SMA quần thể hồi giao với N qui mô quần thể lai, b số lần lập lại c hệ số dự đoán c = N – [n12 + n22] / N Nguồn Di truyền tổng quát QTL G(QTL) Số cặn df N-1 N-2 N(b-1) MS MSG MSQ MSG(Q) MSE MS lý thuyết F-test σe2 + bσ2G(QTL) + bcg2 σe2 + bσ2G(QTL) σe2 MSQ/MSG(Q) μ1 - μ2 tQ = [s2 [ 1/n1 + 1/n2) ]1/2 1-12-2-4 Phân tích phương sai quần thể hồi giao Bảng 6: Phân tích phương sai SMA điển hình Nguồn Di truyền Marker G(marker) Số cặn df N-1 N-2 N(b-1) MS MSG MSM MSG(M) MSE E(MS) σe2 + bσ2G σe2 + b[σ2G(QTL)+4r(1-r)a2]+bc(1-2r)2.a2 σe2 + b[σ2G(QTL)+4r(1-r)a2] σe2 Phép thử F = MSM / MSG(M) 1-12-2-5 Mô quần thể hồi giao Hình 1-4: Đường phân bố lý thuyết giá trị tính trạng kiểu gen QTL kiểu gen marker AA Aa sở quần thể hồi giao Marker A liên kết với QTL với r=0,2 (Liu 1998) Phương pháp tiếp cận theo kiểu mô (likelihood) áp dụng SMA (Weller 1986) Một marker A giả định liên kết với QTL với tần suất tái tổ hợp r = 0,2 QTL có ảnh hưởng di truyền g = 0,5 (μ1 - μ2) = 0,5 σ Phương sai tính trạng kiểu gen QTL (QQ Qq) σ2 Đối với hai nhóm marker AA Aa, phân bố đường biểu biễn giá trị tính trạng kết hợp hai đường chuẩn (Hình 14) 1-12-3 Phương pháp SMA quần thể F2 Bố mẹ AAQQ F1 x aaqq AaQq Tự thụ Con lai F2 AAQQ, Aaqq, AAQq AaQq aaqq aaQQ AaQQ, Aaqq, aaQq Tần suất lý thuyết 0,25 (1-r)2 0,25 r2 0,5 (1-r) 0,5 [r2 + (1-r)2] r giá trị tái tổ hợp A Q Hình 1-5: Quần thể lai F2 SMA Bảng 7: Phân tích phương sai SMA điển hình quần thể F2 Nguồn Di truyền Marker A D G(marker) Số cặn df N-1 1 N-3 N(b-1) MS MSG MSM MSA MSD MSE F MSM/MSG(M) MSA/MSG(M) MSD(MSG(M) Bảng 8: Tương phản tuyến tính kiểu gen marker quần thể F2 Tương phản Tính cộng Tính trội Tần suất lý thuyết AA 1 0,25 Kiểu gen marker Aa -1 0,5 Aa -1 0,25 Codominant marker: FM = MSM / MSG(M) E (tính cộng) = [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] – [μ - (1-2r)a + 2r(1-r)d] = 2(1-2r)a E (tính trội) = [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] – 2{[μ + [1-r)2 +r2]d} + [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] = 2(1-2r)2 d Dominant marker: người ta phải dùng lý thuyết giả định H0 = μA- - μaa E (μA- - μaa) = [μ + 1/3 (1-2r)a + 2/3(1-r+r2)d] - [μ - (1-2r)a + 2r(1-r)d] = 1/3[4(1-2r)a + 2(1-2r)2d] 1-12-4 Phân tích QTL sở đồ cách quãng (interval mapping) r A (marker) r1 Q r2 B (marker) (QTL giả định) Hình 1-6: Mối quan hệ liên kết QTL hai marker kế cận QTL liên kết với marker A có giá trị tái tổ hợp (recombination fraction) r1 QTL liên kết với marker B có giá trị tái tổ hợp r2 Mối quan hệ liên kết có giá trị tái tổ hợp r = r1 + r2 – 2r1r2 Khi r có giá trị nhỏ, r = r1 + r2 Vị trí QTL thể vị trí tương đương với quãng A B ρ = r1 / r - ρ = r2 / r 1-12-4-1 Bản đồ cách quãng quần thể hồi giao (BC) AAQQBB x (1) aaqqbb (2) AaQqBb x AAQQBB (1) Tần suất lý thuyết Con lai BC AAQQBB, AAQqBb, AAQQBb, AAQqBB, AaQqBb AaQQBB AaQqBB AaQQBb 0,5 (1-r) 0,5 r1 0,5 r2 Hình 1-7: Quần thể lai BC phân tích đồ cách quãng với marker A B Bảng 9: Tần suất hi vọng QTL marker quần thể BC, khơng có quấn chéo Kiểu gen marker Tần suất pi Giá trị ước đoán p (Qi/Mi) (gi) QQ Qq AABB 0,5 (1-r) μ1 AABb 0,5 r r1 / r = ρ (1- ρ)μ1 + ρμ2 r2 / r = 1- ρ AaBB 0,5 r r2 / r = 1- ρ ρμ1 + (1-ρ)μ2 r1 / r = ρ AaBb 0,5 (1-r) μ2 Trung bình 0,25 μ2 0,5 (μ1 + μ2) μ1 Phương pháp mô đồ QTL quần thể BC thức theo hàm số (yi -μ)2 L = - ΠΣp (Qi/Mi) exp [ -] 2σ2 ([2π]1/2σ)N Sau đó, tính giá trị Log (L) (logarith likelihood) Hình 1-8: Phân bố lý thuyết giá trị tính trạng kiểu gen QTL (QQ vq Qq) kiểu gen marker (AABB, AABb, AaBB AaBb), sở quần thể BC Marker A B liên kết với giá trị r = 0,3 QTL nghiên cứu định vị hai marker (Liu 1998) 1-12-4-2 Bản đồ cách quãng quần thể F2 Thế hệ F1 biểu thị ưu lai hai dòng cận giao AAQQBB x aaqqbb Bảng 10 cho thấy tần suất hi vọng có kiểu gen QTL marker F2 với giả định khơng có trao đổi chéo Tần suất tái tổ hợp marker A B r, QTL marker A r1 Phương pháp mô đồ QTL quần thể BC thức theo hàm số (yi -μ)2 L = - ΠΣp (Qi/Mi) exp [ -] trường hợp “codominant marker” 2σ2 ([2π]1/2σ)N Bảng 10: Tần suất hi vọng có kiểu gen QTL marker F2 Kiểu gen marker AABB AABb Aabb AaBB AaBb Aabb AaBB AaBb aabb Tần suất pi 0,25 (1-r) 0,5 (1-r) 0,25 r2 0,5 r (1-r) 0,5 (1-r)2 + r2 0,5 r (1-r) 0,25 r2 0,5 r (1-r) 0,25 (1-r)2 QQ 0,25 (1-r)2 0,5 r2 (1-r) 0,25 r22 0,5 r1 (1-r) 0,5 r1r2 0,25 r12 0 pij Qq 0,5 r1 (1-r) 0,5 r1r2 0,5 r2 (1-r) 0,5[(1-r)2+r12+r22] 0,5 r2 (1-r) 0,5 r1r2 0,5 r1 (1-r) qq 0 0,25 r12 0,5 r1r2 0,5 r1 (1-r) 0,25 r22 0,5 r2 (1-r) 0,25 (1-r)2 LOD score giá trị chứng minh mức độ có ý nghĩa phân tích, tính tốn sau: LOD1 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ, σ2) LOD2 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ1, μ3, σ2, r1) LOD3 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ1, μ2, σ2, r1) Thông thường đồ QTL có ý nghĩa giá trị LOD ≥ 1-12-5 Khả giải thích thống kê sinh học đồ QTL Những yếu tố sau ảnh hưởng đến đồ QTL: • • • • • • • Số gen điều khiển tính trạng vị trí genome Sự phân bố ảnh hưởng di truyền cách thức tương tác gen Hệ số di truyền tính trạng mục tiêu Số gen phân ly quần thể lập đồ Loại quần thể lai độ lớn quần thể Mật độ đồ liên kết gen, số marker phủ genome Phương pháp thống kê ứng dụng, mức độ có ý nghĩa phân tích Trong phương pháp SMA, khả thống kê dựa phép thử t (t-test), phân tích phương sai trắc nghiệm mơ theo dạng tuyến tính Trong phương pháp đồ cách quãng (IMA: interval mapping analysis), khả thống kê dựa hệ phương trình tuyến tính với lai hồi giao, đối thuyết H0 = μ1- μ2 = (khơng có ảnh hưởng QTL quãng), trắc nghiệm mô thông qua giá trị “log likelihood” Tần suất Trong phương pháp “multiple QTL”, khả thống kê dựa lý thuyết gen tập họp {p1, p2, p3, pq} mức độ tin cậy α, nhằm phát qe QTL, đó, qe ≤ qi (Liu 1998) Hình 1-9: Tương quan kiểu hình, kiểu gen mơi trường (Xu 1997) Hình 1-10: Phát triển quần thể cận giao tái tổ hợp (RILs) thông qua kỹ thuật SSD (single seed descent: thu thập hạt cá thể) (McCouch Doerge 1995) Hình 1-11: Thí dụ đồ QTL lúa nhiễm sắc thể số (a) Vị trí kích thước đoạn đồng dạng (homeologous segment) nhiễm thể 7A lúa mì sở cDNA marker chung lúa lúa mì (b) Tính trạng (leaf rolling) chế khơ hạn (c) Tính trạng chiều dày rễ (d) Tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu OA (e) Số vết bệnh tính kháng khơng hồn tồn (partial resistance) bệnh đạo ơn (f) Gen Pi-zb (kháng đạo ơn hồn tồn (g) Ngày gieo đến trỗ (xủ lý 10 sáng) (h) Ngày gieo đến trỗ (xử lý 14 sáng) (i) Ngày gieo đến trỗ theo Li ctv (j) Ngày gieo đến trỗ theo Xiao ctv (McCouch Doerge 1995) TÀI LIỆU THAM KHẢO Basten CJ, BS Weir, ZB Zeng 1994 ZMAP- A QTL cartographer Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production 22:65-66 Bonierbale MW, RL Plaister, SD Tanksley 1998 Genetics 120: 1095-1103 Bùi chí Bửu, Nguyễn thị Lang 2002 Chuyển vị nghiên cứu chức genome thựcvật Bùi chí Bửu (chủ biên) Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại trồng Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ chí Minh Tr 53-88 FAO 2002 FAO statistics, http://apps.fao.org/(2002) Gale M 2002 Applications of molecular biology and genomics to genetic enhancement of crop tolerance to abiotic stress – a discussion document FAO – Consultative Group on International Agricultural Research Interim Science Council Rome, Italy 26-30 August 2002 26 p Kawasaki S, C Borchert, M Deyholos, H Wang, S Brazille, K Kawai, D Galbraith, HJ Bohnert 2001 Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice The Plant Cell 13:889-905 Kilian A, J Chen, F Han, B Steffenson, A Kleinhofs 1997 Plant Mol Biol 35: 187-195 Knapp SJ, WC Bridges, BH Liu 1992 Mapping quantitative trait loci using nonsimultaneous and simultaneous estimators and hypothesis tests In: JS Beckmann and TS Osborn (eds.), Plant Genomes: Methods for genetcis nad physical mapping, pp 209-237 Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands Lander ES, P Green 1987 Construction of multilocus genetic linkage maps in human Proc Natl Acad Sci USA 84:2363-2367 Lander ES, D Botstein 1989 Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps Genetics 121:185-199 Liu BH 1998 Statistical genomics: Linkage, mapping and QTL analysis CRC Press, New York, 611pp Manly KF, EH Cudmore Jr 1996 New versions of MAP Manager genetic mapping software Plant Genome IV (Abs.) p”105 McCouch SR 2001 Genomics and synteny Plant Physiology 125: 152-155 McCouch SR, RW Doerge 1995 QTL mapping in rice Plants 11(12): 482-487 Nelson JC 1987 QGENE: software for marker-based genomic analysis and breeding Tanksley SD, JC Nelson 1996 Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding Theor Appl Genet 92:191-203 Terwilliger JD, J Ott 1994 Handbook og human genetic linkage The Johnson Hopkins University Press, Baltimore van Ooijen, C Maliepaard 1996 MAPQTL version 3.0: Software for the calculation of QTL position on genetic map Plant Genome IV (Abs.) p.105 Weller JI 1986 Maximum likelihood techniques for the mapping and analysis of quntitative trait loci with the aid of genetic markers Biometrics 42:627-640 Xu Y 1997 Quantitative trait loci: separating, pyramiding, and cloning Plant Breeding Reviews 15 Cornell University, NY 14853-1902, USA ... ( 1- r) 0,5 ( 1- r) 0,25 r2 0,5 r ( 1- r) 0,5 ( 1- r)2 + r2 0,5 r ( 1- r) 0,25 r2 0,5 r ( 1- r) 0,25 ( 1- r)2 QQ 0,25 ( 1- r)2 0,5 r2 ( 1- r) 0,25 r22 0,5 r1 ( 1- r) 0,5 r1r2 0,25 r12 0 pij Qq 0,5 r1 ( 1- r) 0,5 r1r2... = μA- - μaa E (μA- - μaa) = [μ + 1/ 3 ( 1- 2 r)a + 2/3 ( 1- r+r2)d] - [μ - ( 1- 2 r)a + 2r ( 1- r)d] = 1/ 3[4( 1- 2 r)a + 2( 1- 2 r)2d] 1- 1 2-4 Phân tích QTL sở đồ cách quãng (interval mapping) r A (marker) r1 Q... cộng) = [μ + ( 1- 2 r)a + 2r ( 1- r)d] – [μ - ( 1- 2 r)a + 2r ( 1- r)d] = 2( 1- 2 r)a E (tính trội) = [μ + ( 1- 2 r)a + 2r ( 1- r)d] – 2{[μ + [ 1- r)2 +r2]d} + [μ + ( 1- 2 r)a + 2r ( 1- r)d] = 2( 1- 2 r)2 d Dominant marker: người