Đang tải... (xem toàn văn)
CƠ SỞ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU KHÔ HẠN Khô hạn và mặn là hai yếu tố cơ bản làm hạn chế sự tăng trưởng và năng suất cây trồng. Mặc dù chúng ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu tính trạng chống chịu khô hạn của cây trồng, trong suốt hai thập niên 1980 và 1990, nhưng thành tựu cụ thể về chọn tạo giống chống chịu khô hạn vẫn chưa mang lại ý nghĩa lớn lao (Reddy và ctv. 1999). Phương pháp tiếp cận thứ nhất là phương pháp phân tích sự đóng góp của các...
Chương CƠ SỞ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU KHƠ HẠN Khô hạn mặn hai yếu tố làm hạn chế tăng trưởng suất trồng Mặc dù có nhiều cơng trình nghiên cứu tính trạng chống chịu khơ hạn trồng, suốt hai thập niên 1980 1990, thành tựu cụ thể chọn tạo giống chống chịu khô hạn chưa mang lại ý nghĩa lớn lao (Reddy ctv 1999) Phương pháp tiếp cận thứ phương pháp phân tích đóng góp tính trạng có liên quan, với mơ hình QTL (quantitative trait loci) Phương pháp tiếp cận phù hợp với hầu hết loài trồng chủ yếu lúa, nhờ đồ di truyền với nhiều marker phân tử DNA phủ kín nhiễm sắc thể Hầu hết nghiên cứu tính trạng chống chịu khơ hạn quan tâm đánh giá tính trạng có liên quan với đến sống phát triển trồng điều kiện khô hạn Phương pháp phân tích di truyền phân tử giúp cho nội dung đạt hiệu qủa cao hơn, thực tính trạng, trước xem xét sống phát triển Việc đánh giá kiểu hình tính trạng riêng biệt vô quan trọng, giống việc đánh giá kiểu hình đáp ứng trồng điều kiện kiểm sốt nhà lưới hay phịng thí nghiệm, trước đánh giá đồng ruộng Một liên kết vô chặt chẽ chứng minh, thực bước qui trình MAS (chọn giống nhờ marker phân tử) Phương pháp tiếp cận thứ hai sáng tạo kiểu biến dị có chức hiểu biết cặn kẽ phản ứng trồng bị stress khô hạn, thông qua kỹ thuật chuyển nạp gen Phương pháp chuyển nạp gen cho thấy phương tiện nhiều tiềm để gắn vào mục tiêu phổ rộng gen với khả điều tiết cách linh hoạt vị trí “up” “down” trình biến dưỡng kết hợp với tượng đáp ứng bị stress khô hạn Nhưng phương pháp chuyển nạp với gen hay nhóm gen lộ trình đặc biệt khơng thích ứng điều kiện chống chịu khơ hạn, sản phẩm di truyền điều khiển tính chống chịu khơ hạn xuất phát từ nhiều lộ trình khác (Ingram Bartels 1996) Thơng thường, nhiều protein phân tử “osmolyte” có trọng lượng phân tử thấp, đóng vai trị điều tiết áp suất thẩm thấu, tích tụ bị stress khô hạn Người ta chưa hiểu rõ: yếu tố chi phối tượng thay đổi nhiều đóng góp tích cực vào tính chống chịu khô hạn Phương pháp chuyển nạp gen xem có ích chưa cho biết thông tin đáng giá Phương pháp tiếp cận thứ ba xác định gen ứng cử viên (candidate genes) tính chống chịu stress khơ hạn, mặn, với phát triển không ngừng kỹ thuật chuyển nạp gen, bên cạnh thành tựu công nghệ phân lập gen (gene isolation) thao tác gen (gene manipulation) 3-1 XÁC ĐỊNH TÍNH TRẠNG THÀNH PHẦN TRONG CHỐNG CHỊU HẠN Sự thể tính chống chịu khơ hạn quan sát thơng qua tính trạng cụ thể hình thái rễ cây, lá, chồi thân, phản ứng co nguyên sinh, bao phấn, qúa trình trỗ bơng, v.v Những tính trạng gọi tính trạng thành phần (component traits) Bảng cho khái niệm tính trạng thành phần loci tính trạng số lượng (QTL) có liên quan đến tính chống chịu khơ hạn vài trồng Người ta nhận thấy có giống vài khác biệt nhỏ chế chống chịu khô hạn, cấu thành suất nhiều loài trồng khác Sự giống chế chống chịu hạn mức độ phân tử rõ ràng so với sinh lý học hình thái học Chúng ta nghiên cứu từ suy diễn nhiều khác (Reddy ctv 1999) Hầu hết nghiên cứu marker phân tử quan tâm đến thành phần đặc biệt kiện chống chịu khô hạn, • • • • • khả rễ phát triển sâu xuống tầng đất bên dưới, tính trạng phun râu tung phấn với thời gian cách quãng xác định (ASI = viết tắt từ chữ anthesis to silking interval) điều tiết áp suất thẩm thấu (OA = viết tắt từ chữ osmotic adjustment) tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid) tượng nơng học WUE (water use efficiency có nghĩa hiệu qủa sử dụng nước) Nhiều nghiên cứu khác đề cập đến suất thành phần cấu tạo suất Do đó, người ta cố gắng xác định vị trí QTL cho tính trạng có liên quan đến chống chịu khô hạn suất, thành phần suất Quần thể dùng phân tích đồ QTL thay đổi với nhiều hệ khác Rất khi, QTL phát quần thể cặp lai khác (Reddy ctv 1999) Người ta thường gặp nhiều khó khăn so sánh kết qủa ghi nhận từ quần thể đơn bội kép (DH) với quần thể cận giao tái tổ hợp (RILs), quần thể chọn giống Người ta gặp khó khăn so sánh kết qủa quần thể có độ lớn khác (số dòng lai sử dụng khác nhau, từ vài chục dòng đến hàng trăm dòng lai) Số QTL tìm thầy tính trạng chống chịu khô hạn thường thay đổi từ đến tính trạng thuộc thành phần kiện chống chịu hạn, QTL thường trãi rộng tồn genome với nhiều nhóm liên kết gen Thí dụ, tính trạng WUE (hiệu qủa sử dụng nước) tìm thấy với QTL, từ đến genome đậu nành (Milan ctv 1998) Trong vài trường hợp, có QTL định vị nhóm liên kết gen, điều khiển nhiều tính trạng quan trọng khả điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), khả chống chịu thủy phân, chúng liên kết với tính trạng hình thái học rễ lúa (Lilley ctv 1996) Biến thiên kiểu hình tính trạng xét vị trí QTL xoay quanh giá trị 10% Trong trường hợp ngoại lệ, QTL tính trạng chiều dài rễ giai đoạn 28 ngày tuổi biến thiên 30% (Price Tomas 1997) Mối quan hệ suất QTL thường cho kết qủa âm tính vài trường hợp, tính trạng ASI, kết qủa chống chịu hạn không đối kháng với suất (Ribaut ctv 1996) Những QTL tính trạng ASI có tính ổn định nhiều năm, điều kiện mức độ stress khác nhau, xem ứng cử viên chiến lược áp dụng MAS Bảng 1: Các loci tính trạng số lượng (QTL) liên quan đến tính chống chịu khơ hạn số lồi trồng (Reddy ctv 1999) Tính trạng Cây trồng Quần thể lập đồ QTL Tác giả Đặc tính rễ 1.Hình thái Lúa 2.Phân bố rễ Lúa 203 RILs cặp lai Co39 x Moroberekan quần thể DH: 105 dòng Champoux ctv (1995) Yadav ctv (1997) Đặc tính chồi 1.Lá dẫn truyền qua khí khổng 2.Cường lực mạ Lúa 178 dòng F2s Lúa 118 dòng F2s bố mẹ japonica Price Tomas (1997) Redona Mackill (1996) Đặc tính sinh lý 1.Hàm lượng nước khả điều tiết nguyên sinh chất 2.Đặc điểm tung phấn, phun râu 3.Mức thiệt hại trước trỗ 4.Mức thiệt hại sau trỗ 5.Sự tích tụ ABA Hiệu qủa sử dụng nước (WUE) 1.WUE 2.WUE, 13C phân biệt nhóm Lúa mạch Bắp Cao lương Cao lương Bắp Lúa mì Cà chua 187 dòng RILs 272 dòng F2s 98 dòng RILs Teulat ctv (1997, 1998) Ribaut ctv.(1996) Tuinstra ctv (1996) 98 dòng RILs Tuinstra ctv (1998) 81 dòng F2s Quarrie ctv (1997) 150 dòng DH F3s tổ hợp BC1F1, 11 tổ hợp có WUE cao thấp Quarrie ctv.(1995) Martine ctv.(1989) Năng suất, thành phần NS, tương tác GxE 1.Năng suất & thành phần NS Bắp 150 dòng F2:F3 2.Tương tác GxE Bắp 272 dòng F2s Weldboom Lee (1994) Ribaut ctv.(1997) Bắp Bắp 264 tổ hợp hồi giao 100 dòng RILs Stuber (1997) Bertin ctv.(1997) Phối hợp tính trạng có giá trị kinh tế 1.Ưu lai 2.Hiệu qủa sử dụng N 3-2 NHỮNG MARKER PHÂN TỬ DNA & BẢN ĐỒ QTL Những marker phân tử DNA định nghĩa cột mốc đường thẳng, chúng xem xét mức độ phân tử DNA, nhiễm sắc thể, mà khác di truyền tìm thấy nhờ nhiều cơng cụ xét nghiệm có tính chất phân tử (Li 1999) Những loại marker phân tử thường sử dụng là: • RFLP marker có tính chất đồng trội (co-dominant) đáng tin cậy Kỹ thuật sử dụng cDNA thể probe, đánh dấu phóng xạ, phân cắt hạn chế enzyme • RAPD dạng marker DNA sản sinh nhờ kỹ thuật PCR Mức độ khuếch đại cao từ cặp mồi đơn giản, ngắn, thiết kế ngẫu nhiên (10 mer) Đây marker có tính trội (dominant) mức độ tin cậy thấp • STS marker thiết kế từ chuỗi ký tự RFLP (20-24 mer), có tính chất đồng trội, sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đơi thể tính trội Đây phương pháp phải sử dụng enzyme phân cắt trường hợp đa hình khơng thể rõ Kết qủa có độ tin cậy tốt • Microsatellite SSR marker thiết kế từ vệ tinh có chuỗi ký tự giản đơn, lập lại nhiều lần Cặp mồi thiết kế từ trước sau vệ tinh marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả dị tìm đa hình nhạy Do đó, nhanh chóng thay RFLP RAPD với mơ típ “di-nucleotide” “tri-nucleotide” (GA, GT, CAT, CTT) genome lúa • AFLP dạng marker dựa sở PCR, theo cách chọn lọc hai “adaptor” (là enzyme phân cắt hạn chế) Nó phối hợp hai tính chất RFLP RAPD, nên có khả phát đa hình tốt Nhưng thường có tính chất trội (dominant) nên gặp hạn chế thể alen lặn Những marker phân tử nói áp dụng đồ QTL để nghiên cứu tính chống chịu khơ hạn genome lúa Hướng ưu tiên người ta quan tâm sử dụng microsatellite (SSR) Mục tiêu đồ QTL tìm hiểu sở di truyền tính trạng số lượng cách xác định số lượng, vị trí, ảnh hưởng gen, hoạt động loci bao gồm tương tác gen (epistasis) tương tác QTL x E (mơi trường) Một mục đích khác đồ QTL xác định marker mang tính chẩn đốn kiểu hình đặc thù đó, cho việc áp dụng MAS trở nên có hiệu qủa, phục vụ u cầu chọn dịng (giống) chống chịu khơ hạn, chống chịu mặn, v.v Mục tiêu lâu dài thí nghiệm đồ QTL “cloning” gen điều khiển tính trạng số lượng vơ phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning” (Li 1999) Nguyên tắc lập đồ QTL với marker phân tử DNA phát cho kết hợp marker tính trạng sở liên kết gen, thơng qua phương pháp bố trí thí nghiệm phương pháp phân tích thống kê xác Quần thể phục vụ cho yêu cầu thường là: F2, hồi giao (BC), đơn bội kép (DH), cận giao tái tổ hợp (RIL) từ tổ hợp lai hai dịng cận giao, phân ly tính trạng số lượng mục tiêu nhiều marker kèm theo Quần thể phải đánh giá kiểu hình đầy đủ, đánh giá kiểu gen thông qua đồ liên kết gen với mật độ marker phủ nhiễm thể dày đặc Các phương pháp phân tích thống kê phải đáp ứng yêu cầu xác, đáng tin cậy, thơng quan phân tích marker đơn, phân tích đồ cách qng, mơ hình tuyến tính Cho đến nay, người ta biết QTL ảnh hưởng nhiều tính trạng nơng học quan trọng Những QTL đóng vai trị ảnh hưởng (tính cộng và/hoặc tính trội), chúng tìm thấy thơng qua mơ hình “main-effect QTL” mô tả Lander Botstein (1989), Zeng (1994), Li (1999) Mơ hình “main-effect QTL” có đặc điểm sau: • Những gen chủ lực phải có ảnh hưởng đến tính trạng di truyền cao, chúng xem QTL có ảnh hưởng lớn (giá trị LOD score phải lớn) có tính chất xác định rõ ràng thông qua quần thể môi trường • Những QTL mẫu phải có ảnh hưởng nhỏ đại diện cho 80% loci nhận dạng genome trồng • Những thí nghiệm MAS nội dung chuyển QTL mong muốn để cải tiến tính trạng số lượng phải thực với thận trọng định Bởi tương tác QTL với môi trường, tượng epistasis cần phải giải thích Hiện tượng epistasis kiểm soát biến dị di truyền đề cập mơ hình cải tiến Bên cạnh tương tác QTL x E đuợc thảo luận 3-3 BẢN ĐỒ QTL ĐỐI VỚI TÍNH TRẠNG RỄ LÚA Hệ thống rễ phát triển tốt tính trạng vơ quan trọng giúp trồng chống chịu khô hạn (cơ chế thoát hạn = drought avoidance mechanism) Người ta sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) cặp lai IR64 x Azucena Viện Lúa Quốc Tế (IRRI) Sau Shen ctv (1999) phát triển quần thể gần đẳng gen (NIL) IR64 du nhập với QTL chủ lực Các tác giả ghi nhận bốn đoạn nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, nơi định vị QTL chủ lực phân tích chọn lọc QTL mục tiêu (hình 3-1, Bảng 2) Có dịng DH với tượng tổ hợp alen riêng rẽ đoạn nhiễm sắc thể này, có 50% alen Azucena Bốn dòng chọn làm “donor” (vật liệu cho gen chống chịu) Những dòng lai lui với IR64 thu hoạch quần thể BC3F1, sau cho chúng tự thụ bình thường Áp dụng MAS đoạn nhiễm sắc thể để hồn thiện qui trình chọn lọc từ BC1F1 đến BC3F2 Tất lai BC3F2 mang alen donor, định vị bốn khu vực mục tiêu Những mang hai đoạn mục tiêu trở lên xác định Biến thiên kiểu hình nhiều tính trạng mục tiêu quan sát BC3F2, người ta kết luận có thể di truyền từ hệ trước sang hệ sau qúa trình du nhập gen (introgression) (Shen ctv 1999) Điều tra phần lại genome cho thấy BC3F2 có phần nhỏ alen thuộc Azucena định vị vùng mục tiêu, gần với giá trị lý thuyết # 3% Người ta thực nhiều cặp lai BC3F2 mang đoạn mục tiêu vật liệu cho gen điều khiển rễ lúa phát triển tốt, để loại trừ ảnh hưởng di truyền theo kiểu “genetic drag” ảnh hưởng QTL mục tiêu khác chồng lấp theo hình tháp (Shen ctv 1999) Bảng 2: Các dòng đơn bội kép (DH) chọn lọc để thực hồi giao (Shen ctv 1999) Dòng DH P0055 P0035 P0295 P0475 Mục tiêu ban đầu Mục tiêu lần hai Marker Marker Độ Nhiễm Tần suất alen Nhiễm thể dài Azucena thể vùng quãng (cM) mục tiêu 33,8 RZ19-RG690-RZ730 61,4 RM29-CDO686 38,9 RG437-RG17199,2 Không RG157-RZ318 42,4 W1-RG331 44,9 RM234-CDO418RZ978-CDO38RG351-RM248 30,8 Est9-RG351 37,0 RZ228-RM242RZ12-RM201RG667 Bảng 3: Những QTL hình thái rễ lúa (Shen ctv 1999) Tính trạng THK TRW TRW DR/S DRW DR/T MRL MRL MRL DR/S DR/S DRW DRW Nhiễm thể Quãng (interval) 1 1 1 2 7 7 RM34-RG345 RG690-RZ730 RZ730-RZ801 RG690-RZ730 RG690-RZ730 RZ730-RZ801 RG171-RG157 RZ318-Pal1 CD0418-RZ978 CD0418-RZ978 RZ978-CD038 RG773-RZ488 CD0418-Z978 Khoảng cách markerQTL 0.0 12.0 12.0 14.0 10.0 0.0 14.0 0.0 0.0 0.0 2.0 8.0 0.0 Vị trí QTL 126.3 187.9 202.2 189.9 185.9 190.2 103.0 146.8 128.4 128.4 140.1 8.0 128.4 LOD score R2 Ảnh hưởng cộng 4.7 4.6 5.1 3.1 4.7 5.6 6.3 3.4 7.4 8.1 5.5 3.4 7.0 21.4 21.1 35.2 13.3 23.0 22.9 33.4 14.8 28.8 31.2 23.0 21.5 27.7 -0.042 -0.125 -0.158 -0.003 -0.035 -3.758 -6.160 +4.565 -5.078 -0.005 -0.004 -0.035 -0.039 DRW DR/T MRL TRW 7 9 RZ978-CD038 CD0418-RZ978 RZ12-RM201 RZ206-RZ422 4.0 0.0 0.0 4.0 142.1 128.4 101.3 34.0 5.3 5.7 4.2 3.6 23.4 24.4 16.8 18.4 -0.036 -3.713 -3.561 -0.112 DWR: trọng lượng rễ lúa dài